ANALISIS PREVIO

1. ¿Cómo está
conformada la cadena
de ADN?
2. Elabore un mapa
conceptual*, con los
procesos de
transcripción y
traducción del ADN.
*Ver anexo

Palabras clave
Ácidos nucleicos,
ADN, ARN, PCR,
electroforesis en gel,
ANÁLISIS Y polimorfismo,
Transcripción,

AMPLIFICACIÓN DE ADN traducción.

Protocolo 9, Bio II 2022-2

 ANÁLISIS Y AMPLIFICACIÓN
DE ADN
PRÁC TI CA NO. 9

(Modificado de Sanver-Wang 2014)

OBJETIVOS

Comprender la estructura del ADN

Identificar distintas técnicas de análisis del ADN

Comprender los fundamentos bioquímicos de la replicación del

ADN
INTRODUCCIÓN

Los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos cuya

función es transmitir la información hereditaria y determinar las
proteínas que serán sintetizadas en la célula.

Cada nucleótido está conformado por: 1) una pentosa (azúcar

de 5 átomos de carbono), que puede ser ribosa o desoxirribosa, 2)
uno o más grupos fostato, y 3) una base nitrogenada. Como se
observa en la figura 1, las bases nitrogenadas se clasifican en
Purinas (Adenina y Guanina) y Pirimidinas (Timina, Citosina y
Uracilo).

Figura 1. Bases nitrogenadas. Fuente:

http://www.biologia.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/large_molecules/
06t.html
 Para formar los ácidos nucleicos, los nucleótidos se unen uno
a otro mediante enlaces fosfodiéster, cada uno conformado por un
grupo fosfato y los enlaces covalentes que lo unen a los azúcares de
nucleótidos adyacentes.

Existen dos tipos de ácidos nucleicos: el ácido

desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN). El ADN
es el componente de los genes y tiene codificada la información
genética en la secuencia de nucleótidos específicos que lo
constituyen. El ARN participa principalmente en la síntesis de
proteínas.

El ARN está conformado por una cadena lineal de

ribonucleótidos, los cuales contienen como pentosa a la ribosa (de
ahí su nombre), y pueden tener como bases nitrogenadas Adenina,
Guanina, Citosina o Uracilo.

Sin embargo, la estructura del ADN puede ser descrita como

una doble hélice compuesta de dos cadenas de nucleótidos, llamados
desoxirribonucleótidos ya que contienen como pentosa a la
desoxirribosa, y como base nitrogenada pueden tener Adenina,
Guanina, Citosina o Timina. Al estar el ADN conformado por dos
cadenas de nucleótidos que corren en sentidos opuestos, estas
cadenas son antiparalelas entre sí. La unión de una cadena de
nucleótidos a otra será posible a través de puentes de hidrógeno que
se forman entre bases nitrogenadas complementarias (una purina
con una pirimidina). De esta manera, se forman dos puentes de
hidrógeno entre Adenina y Timina, y tres puentes de hidrógeno
entre Guanina y Citosina.

Polimorfismos del ADN:

Los individuos de la misma especie tienen el mismo

número de cromosomas y los mismos genes. Por ejemplo, todos
los seres humanos tienen 23 pares de cromosomas, cada uno de los
cuales contienen los mismos genes.
 ¿Por qué entonces, parecemos diferentes y poseemos
características (pelo, ojos y piel color, la altura, etc.,) que hacen
que cada uno de nosotros sea único en un mundo de más de siete
mil millones de seres humanos? La verdad es que nuestras
características únicas son el resultado de diferencias muy pequeñas
(≤0.1%) dentro de la secuencia de nucleótidos de nuestro genoma,
a esto llamamos polimorfismos. En este laboratorio, nos
centraremos en dos tipos de polimorfismos:

1. Números variable de repeticiones (VNTR) son las secuencias de

ADN dentro de los cromosomas, por lo general de 20 a ~ 100 pb
de longitud, que se repiten varias veces, los diferentes individuos
tienen diferentes número de repeticiones. Los VNTRs son
encontrados en múltiples cromosomas y pueden ser muy variable
de una persona a otra.

2. Repeticiones en cortas en Tándem (STR) son similares a los

VNTR con una sola secuencia primaria de diferencia-repetida y
son mucho más pequeños, por lo general entre 3 y 10 pb. Una
ventaja de utilizar los STR para huellas dactilares de ADN en
lugar de VNTR es que, dado que los STR son típicamente mucho
más pequeños, el análisis permite el uso de ADN que ha sido
degradado y usar incluso pequeños fragmentos de ADN.
Fig. 1 Empalme de ADN ajeno en un vector de clonación para producir ADN
recombinante Fuente: Modificado de Solomon, E., Berg, L. y Martin, D. (9 Ed.).
(2013). Biología (pp. 942). México, D. F., México: Cengage Learning.

Digestión Enzimática restringida:

Una clase de proteínas, llamadas enzimas de restricción se

especializan en el corte de las moléculas de ADN. Por lo general
tienen cinco letras y nombres basados en las bacterias que los
producen (Fig.1), como EcoRI aislado de E. coli, y BamHI aislado
de Bacillus amyloliquefaciens. Una característica de casi todas las
enzimas de restricción es que hacen el corte en sitios específicos,
lo que significa que cada enzima de restricción hará una incisión
única en una secuencia de ADN en particular, llamada el sitio de
reconocimiento de secuencia.

La especificidad del corte in situ de las enzimas de

restricción es la base para producir una huella dactilar de ADN
utilizando restricción de polimorfismo de longitud de fragmentos
(RFLP). Ya que sabemos la secuencia de reconocimiento para
cualquier enzima de restricción, y la secuencia de ADN
secuenciada (como el cromosomas del genoma humano), sabemos
exactamente dónde van a hacer un corte, y, en consecuencia, el
número y tamaño de los fragmentos de ADN producidos. Sin
embargo, las regiones del genoma que contiene VNTR y STR
serán de longitud variable de una persona a otra, produciendo así
fragmentos de diferentes tamaños a partir de ADN que ha sido
cortado con una enzima de restricción específica.

Reacción en cadena de polimerasa (PCR):

Uno de los avances más importantes en el análisis de ADN

es la reacción en cadena de la polimerasa. Antes de la llegada de la
PCR, se requería que se extrajera una muestra biológica sustancial
de una escena del crimen para producir una huella dactilar de
ADN y la muestra tendría que contener ADN libre de degradación
para ser adecuado para el análisis RFLP.

Con PCR se realiza en un tubo de ensayo lo que era sólo

era posible en las células vivas – la replicación del ADN. Cuando
una célula de cualquier organismo sufre mitosis (división celular),
el ADN de la célula de debe duplicarse de manera que cada célula
hija recibe una dotación completa del genoma.
Independientemente de donde toma lugar, el proceso de
replicación de ADN requiere tres componentes principales: 1) el
ADN que va a copiar (la plantilla ADN), 2) los bloques de
construcción de ADN (nucleótidos que contienen A, T, G y C), y
3) ADN polimerasa, la enzima que crea el ADN usando
nucleótidos libres, basado en la secuencia de la plantilla de ADN
original.

Durante la mitosis, la célula pasa a través de una única

ronda de replicación del ADN, produciendo de este modo sólo dos
cromosomas para cada plantilla. La típica amplificación de PCR,
por otro lado, tiene decenas de ciclos, y la cantidad de ADN
aumenta exponencialmente (duplicandose después de cada ciclo).
Por ejemplo, si una PCR de amplificación consistió en 30 ciclos,
cada molécula de ADN molde produciría 230 moléculas de ADN.

Electroforesis en gel del ADN:

 Electroforesis en gel de ADN es una técnica utilizada para
fragmentos de ADN separados de diferentes longitudes resultantes
a partir de una digestión con enzimas de restricción. Se toma
ventaja del hecho de que una molécula de ADN, o fragmento,
tiene una carga global negativa, y por lo tanto es atraída por un
campo eléctrico positivo. La electroforesis en gel de ADN requiere
de una muestra de ADN digerida, una cámara de electroforesis en
gel, la cual consiste en un aparato a prueba de agua, con un
electrodo positivo en un extremo y un electrodo negativo en el
otro, que contiene un gel de agarosa.

Debido a la carga negativa de ADN, los fragmentos

migrarán a través del gel hacia el extremo positivo de la cámara.
Los fragmentos de ADN más pequeños, van a migrar más rápido a
través de la matriz de gel, dando como resultado la separación de
los fragmentos basado en el tamaño. Los fragmentos de ADN más
pequeños estarán más cerca del electrodo positivo, y el mayor
fragmento de ADN será el más cercano al electrodo negativo.
Fragmentos de ADN del mismo tamaño se encontraran en el
mismo lugar en su carril, creando una banda que se puede ver.
Cualquier banda determinada dentro de un gel puede tener
millones de fragmentos de ADN de igual longitud.
Fig. 2 Electroforesis en gel del ADN. Fuente Solomon, E., Berg,
L. y Martin, D. (9 Ed.). (2013). Biología (pp. 942). México, D. F.,
México: Cengage Learning

Huella de ADN:

Los polimorfismos de nucleótido se pueden utilizar para

crear lo que se conoce comúnmente como una huella digital de
ADN, el patrón de bandas único observado a partir de una muestra
de ADN está basada en el tamaño y el número de fragmentos de
ADN en la muestra. La tecnología de análisis de ADN ha
mejorado significativamente en las últimas décadas, en la medida
en que ya se necesita muy poco ADN en la escena del crimen
(solo unas pocas células por lo general es suficiente) para producir
una huella dactilar de ADN.

Desde 1995, la técnica de PCR ha sido utilizada para

producir huellas de ADN utilizando los STR. La secuenciación de
diferentes regiones del genoma humano ha permitido identificar
un gran número de regiones que pueden potencialmente ser
utilizadas para distinguir individuos. Cuanto más regiones STR se
utilizan para producir un perfil de ADN, hay una mayor
probabilidad de que cada individuo tendrá una huella dactilar de
ADN única.

Actualmente, el FBI ha identificado 13 regiones STR (loci)

en 12 cromosomas diferentes utilizados para el ADN toma de
huellas dactilares, por lo que la probabilidad de que dos personas
tengan la misma huella de ADN, es de al menos, 1 de 1 mil
millón! Estos 13 loci STR, se utilizan para producir una base de
datos: el Sistema de Índice Combinado de ADN (CODIS), que
contiene el DNA las huellas dactilares de los detenidos,
procesados o condenados por un delito. Las huellas de ADN
encontradas en nuevas escenas del crimen ahora se comparan con
perfiles en CODIS de la misma manera que en el crimen real las
huellas de la escena se comparan con las bases de datos de huellas
digitales para buscar coincidencias, que a su vez puede identificar
a las personas que estuvieron presentes en la escena del crimen.
 Desafortunadamente, producir una huella de ADN a partir
de las pruebas recogidas en la escena del crimen no garantiza que
el individuo será identificado. A menudo, una huella de ADN
recogida en la escena del crimen no coincide con los perfiles de
los sospechosos que figuran en el CODIS. Esto puede conducir a
"casos fríos" en el que el criminal va identificado de forma
indefinida, aunque a veces los investigadores tienen suerte y
obtienen una semejanza familiar, individuos estrechamente
emparentados tendrán más STR en común, por lo que a veces es
posible identificar a un individuo que puede no estar en CODIS,
pero tiene un pariente cercano cuyo perfil ADN está en CODIS.

PREGUNTAS DE ESTUDIO

Usa el fragmento de ADN de siguiente para responder a las

preguntas 1- 5:

1. Llene con las bases nitrogenadas complementarias

2. Escriba la serie complementaria resultante después de la
transcripción
3. ¿Cuántos pares de bases de largo tiene este fragmento de ADN?
4. ¿Qué significan las líneas continuas de entre las bases
nitrogenadas?
5. ¿Qué significan las líneas de puntos de entre las
bases nitrogenadas en diferentes hebras?

Estudio de caso-The Sleeper Grim:

Entre 1985 y 2007, se llevaron a cabo por lo menos una docena de
asesinatos en el área de Los Ángeles que estaban vinculados a la
misma persona en base a las pruebas de ADN recogidas en las
escenas del crimen. El asesino se le dio el apodo de "Grim Sleeper
"porque no tenía las víctimas conocidas entre 1988 y 2002.

A pesar de que los investigadores tenían la huella digital del ADN

del presunto asesino, la identidad de este asesino serial se
desconoce debido a que no existe una coincidencia exacta posible
en la base de datos CODIS. Sin embargo, en 2010 los
investigadores descubrieron una semejanza familiar entre el ADN
de Grim Sleeper y en el CODIS un perfil de ADN de Christopher
Franklin, que había sido declarado culpable de un cargo de delito
grave por armas. Los investigadores luego sabían que el Grim
Sleeper era un pariente cercano de Franklin, así que identificaron
un sospechoso en base a una descripción dada por el único
sobreviviente de un ataque.

El principal sospechoso era el padre de Christopher Franklin,

Lonnie David Franklin Jr. Desafortunadamente, debido a que las
huellas de ADN no eran una coincidencia exacta, esta evidencia
no era suficiente para detener a Lonnie Franklin por los asesinatos.
Por lo tanto, un detective de la policía encubierto de Los Ángeles
se hizo pasar por un camarero en un restaurante de pizza donde el
sospechoso comía a menudo. En poco tiempo a partir de entonces
los investigadores recuperan la huella de ADN de Lonnie Franklin
utilizando ADN obtenido a partir de una pieza parcialmente
comida de pizza que Franklin había descartado, y coincide con la
de Grim Sleeper y el 07 de julio 2010, Lonnie Franklin fue
finalmente arrestado por los asesinatos Sleeper Grim. Y seis años
más tarde fue condenado a la pena de muerte por el asesinato de 9
mujeres y una menor de edad.

Utilice las huellas de ADN que se muestran a continuación en el

gel de agarosa para responder las preguntas 5-11:
 6. ¿Qué técnica se usó para separar los fragmentos de ADN?
7. En pocas palabras describe cómo los fragmentos de ADN son
apartados.
8. ¿Qué representan los rectángulos blancos?
9. ¿Qué representan los rectángulos negros?
10. ¿Qué sospechoso o sospechosos tienen más probabilidades de ser
inocentes?
11. ¿Cuál sospechoso puede estar relacionado con la persona que
cometió el crimen?
12. ¿Qué sospechoso es más probable que haya cometido el crimen?

REFERENCIAS
Sanver Wang, Dilek (Junio 2014) General Biology BioSci100 laboratory Manual
https://www.canyons.edu/_resources/documents/academics/onlineeducation/
Bio100_Lab_Manual_4th_ed_revised_May2019.pdf