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MANUAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA.

Facultad de Ciencias Bsicas. Programa de Qumica.

Leonardo Padilla Sanabria. Bacterilogo. MSc. Agosto de 2006

Practica de laboratorio No 1. Microscopa y Tinciones .


1. Microscopa: Objetivos: 1- Conocer e identificar las diferentes partes del microscopio y su uso. 2- Aprender el manejo adecuado del microscopio. Introduccin:
Gracias, a la invencin del microscopio y a las observaciones realizadas a travs de este, fue posible el cambio del pensamiento al pasar de una teora asimbitica, a una teora simbitica. Este maravilloso aparato permiti ver un mundo microscpico desconocido; de all viene su nombre. El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo est compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios estn dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. Cuando se mira a travs del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen real. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes.

Equipos - microscopio.

PARTES DE UN MICROSCOPIO PTICO

Sistema ptico
OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo. OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta. CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

Sistema mecnico
SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin. CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el enfoque correcto.

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO


1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. 2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. 3. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias. Para realizar el enfoque: 1. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. 2. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener una imagen bien definida. 3. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin.

Empleo del objetivo de inmersin: 1. Bajar totalmente la platina. 2. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite.

3. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de x40. 4. Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz. 5. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin. 6. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. 7. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. 8. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3. 9. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. 10. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio.

2. Tinciones.
Las bacterias son prcticamente transparentes (hialinas), por ello no es recomendable su estudio mediante la observacin de suspensiones de clulas en agua o tampones. El empleo de colorantes biolgicos permite aumentar el contraste entre la clula bacteriana y el medio ambiente y a travs del empleo de tcnicas especiales, es posible distinguir algunos de los constituyentes celulares ms importantes. Cualquiera sea el procedimiento de tincin, ste produce la muerte de la clula y en cierto modo la alteracin de la estructura fsica de la bacteria. 1. Colorantes Son compuestos qumicos que poseen un grupo cromforo que otorga color a la molcula y un grupo auxocromo que otorga al colorante la capacidad de disociarse electro-lticamente y por lo tanto formar sales. El grupo auxocromo es el que facilita la unin del colorante a otras sustancias con carga elctrica. Los colorantes se clasifican como colorantes naturales y sintticos. Los colorantes naturales son utilizados principalmente con fines histolgicos. La mayora de las tinciones bacterianas son realizadas con colorantes sintticos, en su mayora anilinas, las cuales derivan del benzeno. Colorantes cidos, bsicos y neutros: Los colorantes ms usados son sales, las cuales estn constituidas por un molecula cargado positivamente y una cargado negativamente. Por ejemplo, azul de metileno es actualmente la sal cloruro azul de metileno. Azul de metileno(+) + cloruro(-)

Introduccin:

a) Tincin bsica es aquella en que el color est dado por la molcula cargado positivamente, como el ejemplo anterior. b) Tincin cida es aquella en que el color est dado por el molcula cargado negativamente. Eosinato(-) + Sodio(+) c) Tincin neutra es aquella resultante de mezclas entre soluciones acuosas de ciertos colorantes cidos y bsicos. En general, las bacterias tienen afinidad por los colorantes de carcter bsico. Estos colorantes llevan en su parte cromfora carga electropositiva, la que tendra una fuerte afinidad por las sustancias electronegativas que normalmente presentan las bacterias. El pH del medio tiene gran influencia en la tincin ya que permite una mayor o menor disociacin electroltica del grupo auxocromo, permitiendo de esta manera una mayor o menor afinidad por los grupos qumicos sobre los cuales se une. Si se aumenta el pH del medio existe una mayor afinidad del colorante por la bacteria, sucediendo lo contrario si el pH se hace ms cido. La fijacin de colorantes a la clula bacteriana se facilita con el uso de mordientes, con los que forman compuestos insolubles (yodo, fenol, cido tnico, oxalato de amonio, etc.). Algunos de los colorantes ms empleados en microbiologa son: azul de metileno, violeta de genciana, fucsina bsica, safranina, verde de malaquita, etc. 2. Tinciones Las tinciones pueden clasificarse en: tinciones simples, diferenciales y especiales. a) Tinciones simples. Son aquellas en que se utiliza un solo colorante y consisten en extender y fijar la preparacin, luego se cubre con el colorante y despus de dos minutos, se lava con agua, se seca suavemente sobre la llama y con papel filtro, para luego observar al microscopio con el objetivo de inmersin. Las bacterias se tien en forma homognea de la misma coloracin. La utilidad de esta tincin es relativa, ya que slo es factible observar forma y agrupacin celular. b) Tinciones diferenciales. Permiten establecer diferencias tintoriales entre grupos de bacterias, debido a ello son las ms utilizadas en la identificacin de bacterias. Estas tinciones se basan en la aplicacin de dos colorantes en etapas sucesivas entre las que se aplican mordientes y compuestos qumicos decolorantes; de esta forma las bacterias de diferente afinidad tintorial se observan teidas de distinto color.

Objetivos:
1. 2. 3. 4. Conocer el fundamento de las coloraciones. Estudiar los diferentes tipos de coloraciones. Realizar practica de coloracin de gram. Observar y diferenciar las diferentes morfologas bacterianas.

Tincin de Gram
1. Realizar un extendido en una lamina portaobjetos tomando un escobillon y realizando un frotis de la boca. Fijar el frotis al calor. 2. Colorear por 1 minutos con cristal violeta, cuidando que el colorante cubra toda la preparacin. 3. Eliminar el exceso de colorante y lavar rpidamente con agua, manteniendo el portaobjeto en posicin inclinada. 4. Cubrir el frotis con lugol durante 60 segundos. 5. Lavar nuevamente con agua. 6. adicionar alcohol cetona (alcohol 95 y acetona al 3%) por 30 segundos. 7. Lavar con agua. 8. adicionar safranina por 30 segundos. 9. Lavar con agua, secar y observar al microscopio con aceite de inmersin. Con base a los resultados de la tincin de Gram, las bacterias que retienen el cristal violeta y aparecen coloreadas de violeta intenso, son Gram positivas y aquellas que pierden el cristal violeta y se vuelven a teir con la safranina diluida tomando un color rojo son Gram negativas. Al realizar la tincin de Gram, se debe tener la precaucin de no utilizar cultivos bacterianos muy viejos, ya que los resultados obtenidos pueden inducir a error; as en cultivos bacterianos relativamente viejos de bacterias Gram(+), algunas se observan como Gram(-), ello se debe a la acidificacin paulatina del cultivo, disminuyendo la afinidad tintorial. Otra forma de determinar si las bacterias son Gram(+) o Gram(-) es a travs del test de solubilidad del KOH. Test del hidrxido de potasio (KOH) Este mtodo est basado en la mayor resistencia de las paredes celulares de las bacterias Gram(+), al tratamiento con una solucin de KOH al 3%. En la mayora de los casos las bacterias Gram negativas no poseen paredes que resistan a la solubilidad del KOH. Este test fue descrito por primera vez en Japn (Ryu, 1938 y 1940), pero slo recientemente se est utilizando; al respecto, Gregersen (1978) ha realizado una evaluacin detallada de l a travs de trabajos bacteriolgicos rutinarios de laboratorio, particularmente en los casos que la tincin de Gram es dudosa, ejemplo: Bacillus sp., que es Gram variable. La tcnica consiste en depositar 1-2 gotas de KOH al 3% sobre un portaobjeto. Con un asa con hilo de platino, se saca desde un medio de cultivo slido, una o varias colonias (de no ms de 24 horas de edad) pequeitas de la bacteria; stas se agitan en el KOH por 5-10 segundos. Si la solucin de KOH se pone viscosa y al levantar el asa, se forma un

hilo de viscosidad que sigue a una distancia de 0,5-2 cm o ms; esto significa que la reaccin es positiva y ocurre en bacterias Gram(-). Si no hay viscosidad, se produce una suspensin acuosa que no sigue al asa, la reaccin es negativa y ocurre en bacterias Gram(+).

Preguntas: 1. Investigue que es un cromforo y un auxocromo y por que son importantes en la observacin del color?. 2. Explique que funcin cumple cada uno de los colorantes utilizados en la tincin de Gram?. 3. Explique por que las bacterias gramnegativas al adicionarles KOH forman una solucin viscosa y las gram positivas no?. 4. Investigue otros tipos de microscopia adems de la microscopia de luz y elabore un cuadro comparativo (similitudes y diferencias).

Practica de laboratorio No 2. Preparacin de medios de cultivo y esterilizacin


Introduccin.
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiologa por lo que un control en su fabricacin, preparacin, conservacin y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas). Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaba la prdida de los factores nutritivos lbiles. Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. En los laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma lquida o en forma slida.

Usualmente para preparar un medio slido se parte de un medio lquido al que se le aade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la slicagel. Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en: Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adicin de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos. Medios definidos o sintticos: son los medios que tienen una composicin qumica definida cuali y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigacin. De acuerdo al uso del medio de cultivo, stos se clasifican en: Medio enriquecido: medio que presenta un gran exceso de nutrientes y se utilizan para microorganismos que tiene grandes exigencias nutricionales. Medios selectivos: estn diseados para el aislamiento de microorganismos especficos. Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad metablica microbiana. No contienen ningn tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar caractersticas fisiolgicas de los microorganismos. Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes bsicos o por simple rehidratacin de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere l uso de los medios de cultivo deshidratados porque, adems de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles. Para su preparacin se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: Prepararlos slo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad. Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiolgica y fisicoqumica adecuada. Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada. Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilizacin. Nunca se deben exceder las condiciones sealadas por el fabricante.

ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que seale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco

(entre 15 y 25oC), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor. Los medios de cultivo deshidratados se deben descartar cuando se hidraten o decoloren. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8oC, a menos que el medio requiera alguna condicin diferente. Se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratacin.

OBJETIVO Al finalizar el trabajo prctico el estudiante estar en capacidad de: 1. Preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de medios de cultivo deshidratados. 2. Indicar el mtodo de esterilizacin apropiado. PROCEDIMIENTO 1. Lea cuidadosamente las instrucciones de preparacin del medio de cultivo asignado. 2. Agregue la cantidad de agua destilada necesaria para la cantidad de medio a preparar. 3. Pese la cantidad exacta del medio deshidratado. 4. Cierre inmediatamente el frasco de medio de cultivo. 5. Agregue el medio deshidratado al agua destilada. 6. Caliente en estufa hasta que halla una disolucin completa del medio. 7. Separe 200ml del medio disuelto y calentado en un Erlen-Meyer de 250 ml para preparar medio lquido. 8. Agregue agar-agar para que quede a una concentracin del 6% P/V al medio liquido restante. 9. Caliente nuevamente hasta la disolucin completa del agar-agar. 10. Tape los Erlen-Meyer con una torunda de algodn y pngale la tirilla verificadora de autoclave (cambio de color a 121oC). 11. Autoclave por 20 minutos. Tenga cuidado cuando saque el medio del autoclave porque aun esta caliente. 12. Deje enfriar hasta que sea capaz de colocar el Erlen-Meyer sobre la piel, en este momento comience a servir el medio en las cajas de petri, tubos y en los tubos, adicionando aproximadamente 15 a 20 ml por caja de petri y llene un poco menos de la mitad, los tubos. 13. Deje solidificar completamente el agar, Algunos tubos djelos solidificar de forma inclinada. 14. Selle las cajas y los tubos con papel para film o cinta de enmascarar, guarde en lugar seco y seguro, ya que este medio se utilizara en la prctica siguiente. 15. Separe, un tubo de medio liquido, otro solid y una caja de petri con medio solid para incubar a 37oC.

Preguntas: 1. Para que se dejan incubando algunos medios de cultivo recin preparados en incubacin?. 2. El medio de cultivo preparado en la practica en que categora lo clasificara y por que?. 3. Investigue de donde proviene el agar-agar y cual es su estructura. 4. Investigue diferentes mtodos de esterilizacin, elabore un cuadro comparativo. 5. Explique porque mtodo esterilizara una solucion de L-glutamina y de antibitico antimictico?.
NOTA: Los siguientes elementos deben ser trados por los estudiantes

Cinta de enmascarar ( pegar el papel). Algodn gasa ( para hacer los tapones de los erlenmeyer).

Practica de laboratorio No 3
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.
Introduccin La mayora de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axnicos o puros. Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene un slo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola clula; el crecimiento de sta origina, en medio slido, una masa de clulas fcilmente visible que recibe el nombre de colonia. Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de una poblacin microbiana mixta, se utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. Uno de los principales usos de las tcnicas de aislamiento microbiano, adems de la obtencin del cultivo axnico, es poder observar el tipo de colonias, color y el olor de las mismas; todas estas caractersticas sumadas a la morfologa bacteriana y su diferenciacin a travs de la coloracin de Gram, son la base fundamental para poder comenzar realizar una identificacin del microorganismo. Adems es indispensable obtener colonias aisladas para poder realizar las pruebas bioqumicas. Objetivos: 1. 2. 3. 4. Familiarizarse con el manejo de microorganismos. Conocer las diferentes tcnicas de aislamiento en caja de petri y tubos. Obtener colonias separadas utilizando uno o ms mtodos. Estudiar la morfologa de las colonias, color y olor.

Existen diferentes tcnicas de aislamiento y siembra de microorganismos entre las que tenemos: 1. Aislamiento por extensin en superficie con cayado. 2. Aislamiento por estra mltiple o siembra por agotamiento. 3. Aislamiento por Dilucin en masa. 4. Siembra en cultivo liquido con asa y pipeta. 5. Siembra en tubo con agar inclinado y no inclinado semislido.

1. AISLAMIENTO POR EXTENSIN EN SUPERFICIE CON CAYADO Tecnica: Observar figura 1.

Diluciones seriadas de la muestra.

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5
Cayado

0.1 ml

extensin

1. Realice diluciones de la muestra o el cultivo como se indica en el grafico. 2. Deposite sobre la placa con agar 0.1 ml de la dilucin correspondiente con pipeta esteril. 3. Realice la extensin de la muestra a travs de un cayado de vidrio estril en todas las direcciones hasta que este completamente seco. 4. Incube la placa a 37oC de 24 a 48 horas. Coloque la caja en posicin invertida. 5. Realice el conteo de colonias.

2. AISLAMIENTO POR ESTRA MLTIPLE O SIEMBRA POR AGOTAMIENTO.

Tecnica: observar figura 2. 1. Ponga el asa curva en la llama del mechero, hasta observar que se pone roja, retire de la llama y deje enfriar, o enfri directamente en el medio ( pedir indicaciones al profesor). 2. Tome el inoculo con el asa, en poca cantidad (El inoculo corresponde a la pequea muestra que usted toma). 3. Levante la tapa de la caja de petri y extienda l inoculo en forma de estras muy juntas, en una pequea rea de la superficie de la placa de agar, teniendo cuidado de no realizar mucha presin para evitar daos en el agar. 4. Realice nuevamente el paso nmero 1. 5. Rote la caja de petri de tal forma que un extremo de la siembra anterior quede fcilmente accesible para ser tocado por el asa en la prxima extensin.

6. Toque con el asa parte de la siembra realizada previamente y extienda de nuevo haciendo estras ( NOTA: despus de tocar con el asa la primer siembra realizada, siga realizando las estras, sin que estas toquen la primer siembra nuevamente). 7. Repita los pasos 5 y 6 hasta que haya dado todo el giro a la caja de petri. 8. Incube de 24 a 48 horas a 37oC. Coloque la caja en posicin invertida.

3. AISLAMIENTO POR DILUCIN EN MASA. Este tipo de tcnica se utiliza para realizar recuento de microorganismos vivos en anlisis de alimentos. Tecnica: Observar figura 4. 1. 2. 3. 4. Haga 4 diluciones de la muestra o el cultivo como se indica en la figura 1. Tome 4 cajas de petri esteril y marque cada una con una dilucin, Adicione 0.1 ml de la dilucin en la caja de petri esteril correspondiente. Agregue +/-15ml de agar L.B. liquido atemperado a +/- 45 oC. ( Para saber que el medio esta a una temperatura aproximada de 45 oC, tome el Erlen-meyer que contiene el medio de cultivo y arrmeselo a la piel, si es capaz de soportar el calor, es por que ya esta a una temperatura adecuada para se adicionado).

5. Mezcle las cajas con movimientos cuidadosos, como sigue: Moviendo la caja de arriba hacia abajo. Rotando la caja haciendo crculos 5 veces en el sentido de las agujas del reloj. Moviendo la caja 5 veces haciendo ngulos rectos. Rotando la caja haciendo crculos 5 veces en sentido contrario de las agujas del reloj. 6. Deje solidificar el agar y agregue una capa adicional de agar. Deje solidificar. 7. Invierta las cajas e incube a 37 oC durante 24 a 48 horas y Coloque una caja con medio sin inocular e incubela con las dems.

Figura 4.

0.1 ml

Dilucin d e la muestra

15 ml de medio atemperado

5. SIEMBRA EN CULTIVO LIQUIDO CON ASA Y PIPETA. A). Tcnica siembra con asa: Figura 5. 1. Ponga el asa curva en la llama del mechero, hasta observar que se pone roja, retire de la llama y deje enfriar, o enfri directamente en el medio 2. Tome el tubo que contiene la muestra e introduzca el asa curva hasta 1/3 parte, squela y verifique que el asa contiene una gota de muestra en la punta. 3. Sumerja el asa con la gota de muestra en la punta, en un tubo que contiene 5ml de medio L.B. estril 4. Agite el asa dentro del medio para permitir el desprendimiento de la muestra y la dilucin de la misma. 5. Incube de 24 a 48 horas a 37oC. Coloque la caja en posicin invertida. 6. Observe la turbidez del medio al cabo de la incubacin. Figura 5. FLAMEAR FLAMEAR

R O T A R
MUESTRA INOCULACIN INCUBACIN

B. Tcnica siembra con pipeta: 1. Tome el tubo que contiene la muestra e introduzca la pipeta graduada y aspire con pipeteador de seguridad el volumen que necesita. 2. Transfiera la pipeta con la muestra en un tubo que contiene 5ml de medio L.B. estril y deposite all la muestra. 3. Mezcle con la misma pipeta aspirando y soltando 5 veces la muestra y el cultivo. 4. Incube a 37 oC de 24 a 48 horas. 5. Observe la turbidez del medio al cabo de la incubacin.

6. SIEMBRA EN TUBO CON AGAR INCLINADO Y NO INCLINADO SEMISLIDO. Agar semislido: Es aquel agar que contiene una menor concentracin de agaragar. las siembras en agar inclinado y no inclinado pueden realizarse a travs del asa curva o recta, con el asa curva se realiza siembra en la superficie del agar generalmente en zig-zag. Y con el asa recta se realiza la siembra por puncin. A). Siembra en tubo con agar inclinado semisolido: figura 6. 1. Ponga el asa curva en la llama del mechero, hasta observar que se pone roja, retire de la llama y deje enfriar, o enfri directamente en el medio. 2. Tome el tubo que contiene la muestra e introduzca el asa curva hasta 1/3 parte, squela y verifique que el asa contiene una gota de muestra en la punta. 3. Siembre la muestra que contiene el asa, en forma de zig-zag sobre la superficie inclinada del tubo; el proceso se inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba por el rea inclinada. 4. Incube a 37 oC de 24 a48 horas. Figura 6.

B). Siembra en tubo con agar no inclinado semisolido: figura 7. 1. Ponga el asa recta en la llama del mechero, hasta observar que se pone roja, retire de la llama y deje enfriar, o enfri directamente en el medio. 2. Tome con la punta del asa una pequea cantidad de la colonia a sembrar. 3. introduzca el asa recta con la muestra a travs del agar hasta el fondo del tubo sin moverlo para los lados. 4. Retire el asa por la misma trayectoria por donde la introdujo, de tal manera que quede una sola puncin en el agar. 5. Incube a 37 oC de 24 a48 horas. Figura 7.

Preguntas. 1. Investigue a que hace referencia siembra por agotamiento y cual es su utilidad?. 2. En que casos se utiliza la siembra en cultivo liquido y agar semislido, explique?. 3. Cual es la utilidad de hacer recuento de colonias por el mtodo de dilucin en masa?. 4. Usted es un director de control de calidad en una empresa de alimentos, su director le pide que tiene que hacer un recuento de microorganismos en los alimentos: Que mtodos podra utilizar para hacer este recuento? Enumere como mnimo 2 . Explique cual es el fundamento de cada uno de los mtodos escogidos.

Practica de laboratorio No 4. MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE UNA POBLACIN MICROBIANA.


FISIN BINARIA Es un proceso en el cual de la divisin de una clula resultan dos (2) clulas, usualmente ambas clulas hijas tienen el mismo tamao y forma. Este es el proceso ms comn y sin duda el ms importante en el ciclo de crecimiento de las poblaciones bacterianas. En un cultivo en crecimiento la clula bacteriana aumenta de tamao, replica su ADN y la pared celular y la membrana citoplasmtica comienzan a crecer hacia adentro a partir de direcciones opuestas formando una particin conocida como septo. A cada lado del septo se ubica una copia del cromosoma bacteriano y los otros constituyentes celulares que le permitan a cada clula hija vivir como clula independiente. Luego se separan como dos clulas hijas resultantes de la divisin de la clula madre original. Se define crecimiento como un aumento en la cantidad de constituyentes y estructuras celulares, cuando hay crecimiento en ausencia de divisin celular hay aumento en el tamao y peso de la clula. Mientras que cuando el crecimiento es seguido de divisin celular hay un aumento en el nmero de clulas. Es importante distinguir entre el crecimiento de clulas individuales y el crecimiento de poblaciones, ya que en los microorganismos debido a su pequeo tamao no se hacen estudios de crecimiento individual sino estudios de crecimiento de poblaciones. El crecimiento de una poblacin es el aumento del nmero de clulas como consecuencia de un crecimiento individual y posterior divisin. El crecimiento de una poblacin ocurre de una manera exponencial. El crecimiento exponencial es una consecuencia del hecho de que cada clula se divide dando dos (2) clulas hijas, las cuales al dividirse darn cada una dos clulas hijas, as es que en cada perodo de divisin la poblacin se duplica. La velocidad de crecimiento exponencial se expresa como tiempo de generacin (G) y este se define como el tiempo que tarda una poblacin en duplicarse. Los tiempos de generacin varan ampliamente entre los microorganismos, algunos crecen rpidamente y presentan tiempos de generacin de unos 30 minutos y otros tienen tiempos de generacin de varias horas o incluso das. Existen varios mtodos para medir el crecimiento microbiano: Mtodos directos. Son aquellos en los que se cuenta el n total de clulas en un volumen conocido y as se estima el n total en la poblacin. Entre ellos: a. Recuento directo del n de clulas al microscopio. Se utilizan portas especialmente diseados para el recuento celular y denominados cmaras de recuento. Existen varios tipos de cmaras de recuento, una de ellas es la cmara Thoma Este mtodo tiene el inconveniente de que no diferencia entre clulas viables y no viables. Es poco preciso. b. Contadores electrnicos. Las clulas son suspendidas en un fluido conductor que pasa lentamente a travs de una abertura fina por la que pasa una corriente elctrica. Cada clula que pasa produce un cambio en la conductividad y estos cambios o pulsos convenientemente amplificados son registrados electrnicamente dando una medida directa del n de clulas en el medio. No diferencia entre clulas viables y no viables ni entre clulas o partculas inertes.

Crecimiento

c. Recuento de clulas viables. Haciendo diluciones apropiadas seguidas de siembra sobre placas Petri podemos obtener crecimiento de colonias aisladas procedentes cada una de una nica clula. Si se multiplica por el factor de dilucin tendremos el n de clulas en cultivo. Slo detecta viables pero es un mtodo lento y caro por el elevado nmero de placas que hay que utilizar para que los resultados sean significativos. Mtodos indirectos. Son aquellos que utilizan parmetros distintos del n de clulas, pero que pueden relacionarse de forma directa con ste (masa celular, actividad metablica, etc..). Ello es posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los constituyentes celulares y as la velocidad de crecimiento de la poblacin puede estimarse por la velocidad del incremento de cualquiera de estos parmetros. Entre los mtodos indirectos se encuentran: a. Determinacin del peso seco. Se trata de medir la masa celular presente en un cultivo y estimar el n de clulas proporcional a sta. b. Determinacin del nitrgeno celular. Medir el contenido proteco del cultivo. c. Determinacin del DNA d. Determinacin de una actividad metablica segn el tipo de microorganismo: consumo de oxgeno (en aerobios), liberacin de CO2 u otro producto de fermentacin, aumento de la concentracin de alguna enzima constitutiva, incorporacin en la clula de algn material radiactivo, etc. e. Medida de la turbidez del cultivo. Se basa en la capacidad de las clulas y partculas en general de absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. Un cultivo celular aparece turbio porque las clulas dispersan la luz que atraviesa la suspensin. La turbidez es proporcional al nmero de clulas y puede medirse utilizando un espectrofotmetro. El espectrofotmetro es un aparato que hace pasar la luz a travs de una suspensin celular y detecta la luz no dispersada.( figura 1). Figura 1. Partes de un espectrofotmetro.

Este instrumento mide la relacin de intensidad de Luz incidente con la intensidad del rayo luminoso que sale despus de atravesar la muestra. Cuanto mayor sea el n de clulas mayor es la turbidez el cultivo, por lo tanto hay un aumento en la retencin de la luz o densidad ptica (D.O.) y menor la cantidad de luz que pasa hacia el detector ( luz no dispersada). La D.O. del cultivo es pues proporcional a la densidad celular. Esto es as dentro de ciertos lmites puesto que a elevadas concentraciones pueden formarse agregados celulares o producirse un efecto "pantalla" de unas clulas sobre otras

CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO. Figura 2. Fase de latencia Cuando una poblacin bacteriana es inoculada en medio fresco, el crecimiento usualmente no comienza de inmediato sino despus de un tiempo llamado de latencia, que puede ser corto o largo dependiendo de las condiciones. La fase de latencia representa un periodo de transicin para los microorganismos cuando son transferidos a una nueva condicin. En esta fase se producen las enzimas necesarias para que ellos puedan crecer en un nuevo medio ambiente. En esta fase no hay incremento en el nmero de clulas, pero hay gran actividad metablica, aumento en el tamao individual de las clulas, en el contenido proteico, ADN y peso seco de las clulas. Si un cultivo que est creciendo en fase exponencial es inoculado al mismo medio de cultivo bajo las mismas condiciones de crecimiento, no se observa fase de latencia y el crecimiento exponencial sigue a la misma velocidad. Si el inoculo se toma de un cultivo viejo (fase estacionaria) y se inocula en el mismo medio, generalmente se presenta la fase de latencia esto se debe a que las clulas generalmente agotan una serie de coenzimas esenciales u otros constituyentes celulares y se requiere cierto tiempo para su sntesis. Tambin se observa latencia cuando el inculo est formado por clulas que han sido daadas pero no muertas, bien sea por tratamiento con calor, radiaciones o sustancias qumicas, puesto que requieren reparar dicho dao. En el caso de que una poblacin se transfiera de un medio de cultivo rico a un medio pobre, se observa latencia puesto que es necesario que las clulas para poder seguir creciendo tengan una serie de enzimas para poder sintetizar algunos metabolitos esenciales que no estn presentes en el medio. Es el perodo de la curvas de crecimiento en el cual el microorganismo crece exponencialmente, es decir que cada vez que pasa un tiempo de generacin la poblacin se duplica. Bajo condiciones apropiadas la velocidad de crecimiento es mxima. Las condiciones ambientales (temperatura, composicin del medio de cultivo, etc.) afectan a la velocidad de crecimiento exponencial. Fase estacionaria En cultivos en recipientes cerrados una poblacin no puede crecer indefinidamente en forma exponencial. Las limitaciones del crecimiento ocurren ya sea por agotamiento de algn nutriente esencial, por acumulacin de productos txicos, porque se alcance un nmero de clulas elevado para el espacio disponible o por una combinacin de las causas anteriores. Este periodo durante el cual cesa el crecimiento se conoce como fase estacionaria. Si la incubacin contina despus de que una poblacin microbiana alcanza la fase estacionaria, las clulas pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero va a comenzar una disminucin progresiva en el nmero de clulas viables y cuando esto ocurre se dice
que la poblacin ha entrado en fase de muerte.

Fase exponencial o fase logartmica

Fase de muerte

Figura2. Representacin grafica de una curva de crecimiento bacteriano.

Objetivos:

Medir el crecimiento de una poblacin microbiana. Medir de la turbidez del cultivo (mtodo indirecto) Medir la viabilidad bacteriana a la temperatura.

1. Preparacin de la escala de Mc Farland: Escala de Mc farlan 1% de BaCl2 (ml). 1% H2SO4 de (ml). # bacterias/ millones por ml. Tubo # 1 0.1 9.9 300 Tubo # 2 0.2 9.8 600 Tubo # 3 0.3 9.7 900 Tubo # 4 0.4 9.6 1200 Tubo # 5 0.5 9.5 1500 Tubo # 6 0.6 9.4 1800 Tubo # 7 0.7 9.3 2100 Tubo # 8 0.8 9.2 2400 Tubo # 9 0.9 9.1 2700 Tubo # 10 1.0 9.0 3000 Total 6.0 ml. 100 ml. ----Realice la lectura de cada uno de los 10 tubos en un espectrofotmetro a 615 nm, utilizando como blanco una agua destilada. 2. Determinacin de la curva de crecimiento: Inocularemos el tubo de ensayo que contiene el medio de cultivo liquido con las bacterias necesarias para obtener una turbidez semejante al primer tubo del nefelmetro. Mediremos la D.O. a 615nm y tomaremos esta como la D.O. inicial (to). Utilice como blanco agua destilada. Seguiremos la evolucin de la turbidez del cultivo midiendo la D.O. a diferentes tiempos durante unas 2 horas. Tomaremos muestras a 0, 20, 40, 60,80.100 y 120 minutos.

Representaremos en una grfica los valores de D.O ( eje X ), versus del tiempo (eje Y ). La curva obtenida ser la curva de crecimiento del cultivo. 3. Efecto de la temperatura sobre el crecimiento bacteriano. 1. Tome un tubo con 6 ml de medio de cultivo y adicione bacterias hasta que alcance una turbidez similar al tubo 1 de la escala de Mc Farlan. 2. Haga una diluciones seriadas hasta 10-4 (tomando 0.9ml de medio y adicionaldo 0.1 de las bacterias y as sucesivamente hasta llegar al tubo al tubo 104). 3. Siembre la dilucin 10-4 a travs del mtodo de dilucin en placa. 4. Tome el tubo e incbelo por 3 minutos en agua hirviendo. 5. repita paso # 2 6. repita el paso # 3. 7. Repita el paso # 4, pero incube por 6 minutos y repita el proceso del paso # 2 y 3. o 8. Incube las cajas a 37 C por 24 horas al cabo del cual s har recuento de colonias en la caja. Preguntas: 1. Investigue el fundamento de la espectrofotometra. 2. Investigue el espectro electromagntico. 3. Investigue que son cultivos continuos.
4. Investigue el fundamento de la turbidimetra y la nefelometra.

Practica de laboratorio No 5. RECUENTO DE MESOFILOS AEROBIOS.


Introduccin:

Tambin conocido como recuento Estandar, SPC o Recuento Total de bacterias, es el indicador del grado de contaminacin global del alimento sin poder definir su origen. Es de utilidad en productos fresco-enfriados, congelados, precocidos o alimentos preparados. All se cuantifican los tipos de bacterias que pueden crecer a 30 - 35 C en condiciones aerobias ya sean provenientes de la piel de las heces, manos, equipos, suelo, agua etc. El resultado de este recuento, como en todos los recuentos viables, se expresa en Unidades Formadoras de Colonia (UFC) donde una clula bacteriana o un grupo de ellas tienen la habilidad para originar una colonia. Normalmente el nmero encontrado es inferior al que se obtiene en los sistemas de cuantificacin electrnicos, donde se cuentan clulas bacterianas sin diferenciar si estn vivas o muertas o si crecen a temperaturas especficas. Por ser un recuento de tan amplia cobertura, es el indicador mas usado para definir la calidad bacteriolgica general de los alimentos y entre mas bajo indicar mejor higiene del alimento. Objetivos: 1. Conocer la tcnica para hacer recuento de mesofilos aerobios. 2. Estudiar la importancia de este recuento como indicador de la contaminacin de los alimento. 3. Practicar diluciones, siembras y recuento de microorganismos.
Principio base del mtodo.

El mtodo se basa en incubar en agar de recuento en placa, a 35C y durante 48 hrs., volmenes medidos de diferentes diluciones de la muestra, y contar el nmero de colonias producidas para determinar el nmero de grmenes viables o unidades formadoras de colonias por gramo de muestra.

Procedimiento
Preparacin de la muestra. 1. Aspticamente pesar 10 g. de muestra y dilur en 90 ml. de agua peptonada, si se trata de muestras liquidas, tomar 10 ml de la muestra y diluirla en 90 ml de agua peptonada. 2. Homogenizar la mezcal por trituracin en un vaso esterilizado de licuadora a una velocidad aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos.(Esta tcnica se realiza cuando estamos trabajando con muestras slidas). NOTA: Para el proceso de aprendizaje, en este laboratorio la dilucin de las muestras se hara, tomando 1ml de la muestra, previamente mezclada, y se adicionara a el tubo que contiene 9 ml de agua peptonada. Diluciones. Segn el nmero de grmenes esperado y sobre la base de la solucin inicial de 10 g. O 10ml en 90 ml. (dilucin 10-1), preparar diluciones decimales de 10-2, 10-3, 10-4, usando pipetas estriles para cada dilucin, tomando 1 ml. de la solucin anterior en 9 ml. de agua peptonada evitando se forme espuma. Mezclar manualmente cada dilucin agitndola 25 veces en 7

segundos con movimientos ascendentes y descendentes formando un ngulo de abertura aproximado de 60 entre brazo y antebrazo.

Tcnica.
1. Aspticamente pipetear 1 ml. de cada dilucin y sembrar por duplicado en caja de Petri previamente identificada. Volver a mezclar la dilucin a usar, si sta ha permanecido ms de 3 minutos sin agitar. 2. Agregar a cada una de las cajas 12-15 ml. de agar de recuento en placa previamente fundido a bao mara y enfriado a 44-46C ( tomar el agar y ponerlo en la piel, cuando sea capaz de resistir el calor del agar sobre la piel, es la temperatura ideal) No deber transcurrir un tiempo mayor de 15 minutos entre la dilucin de la muestra y la siembra en placas. 3. Inmediatamente mezclar la muestra diluida y el agar mediante agitacin, como se aprendi en la practica de siembras (movimientos circulares y formando ngulos de 90 grados). Durante un lapso igual o superior a un minuto, evitando mojar los bordes de la placa; dejar enfriar sobre una superficie plana y horizontal. Deje solidificar el agar. 4. Una vez solidificado el agar, adicione una capa mas de agar, deje solidificar nuevamente. Selle las cajas con cinta, invierta las cajas de Petri e incubar a 35C por 48 2 hr. 5. Para realizar el conteo de las colonias, escoja las cajas que presenten entre 30 y 300 colonias. 6. para realizar el conteo de colonias en ambas cajas. Divida la caja en 4 cuadrantes con marcador o lapiz de cera, cuente las colonias que se observan como puntos blancos o cremas en cada cuadrante y sume los 4 cuadrantes para dar el recuento total de la caja, haga el mismo procedimiento en la otra caja. ( No olvidar que se sembr por duplicado). 7. El clculo del vapor promedio del nmero de unidades formadoras de colonias por gramo de muestra se efecta multiplicando el nmero de colonias contadas en cada dilucin de las placas seleccionadas (valor C), por el factor de dilucin correspondiente (valor D). 8. La diferencia entre los resultados extremos de la determinacin efectuada por duplicado, no deber exceder del 10% de la media aritmtica de los 2 resultados; en caso contrario, debe repetirse el examen. 9. Obtener el valor del recuento total de grmenes expresado de la siguiente manera:

N= C X D
donde: N= Unidades formadoras de colonia por gramo de muestra. C= Promedio del Nmero de colonias en ambas cajas de la misma dilucin. D= Factor de dilucin. ANEXOS Agar Recuento en Placa (composicin) Triptona Extracto de Levadura Glucosa Agar Agua destilada

5,0 g 2,5 g 1,0 g 15,0 g 1 lt

Disolver los ingredientes en agua y hervir. Poner en tubos o frascos. Autoclave por 15 minutos a 121C. El pH final debe ser 7.0 0.1. Agua Peptonada para Dilucin: Peptona Agua destilada

1g 1 lt

Disolver la peptona en un litro de agua destilada ajustando el pH a 6.8 0.1 y esterilizar en autoclave a 121C por 15 a 20 minutos. Nota: el medio Plate Count, viene listo para uso, de acuerdo a las indicaciones del fabricante, pese la cantidad de medio necesario y disuelva en agua destilada, despus autoclave.

Cuadro gua de trabajo.


10 g o 10 ml de muestra 90 ml de agua peptonada o 1ml de muetra + 9ml de agua peptonada.

Hacer 4 diluciones y agregar 1 ml de la dilucin elegida en las Placas Petri

Agregar 20 ml de Agar Plate Count Mezclar con movimientos rotatorios de izquierda a derecha y de 90 grados durante 1 minuto Incubar a 30-35C por 48 hrs.

Informar como:

UFC/g = C x D

Preguntas: 1. Investigue Cual es la cantidad permitida de mesofilos aerobios en la leche. 2. Si usted va a realizar un recuento de bacterias termofilas que procedimientos utilizara?. 3. Si un alimento presenta un recuento de mesofilos aerobios muy alto, que cree usted que esto indique?.Explique. 4. Si un alimento presenta un recuento de mesofilos aerobios muy alto, como cree usted que afectara el alimento?.Explique.

Practica de laboratorio No 6. Recuento de coliformes totales por la tcnica de nmero mas probable.
Introduccin:

este grupo de microorganismos crece entre 15 y 45 C, comprende varios gneros de la familia Enterobacteriaceae, esta ampliamente distribuida en la naturaleza, agua y suelos pro tambin es habitante normal de los tractos intestinales de los animales y del humano y por ende estar presente en todos los medios que tengan o hayan tenido contacto con materia fecal como suelo, agua, las manos y equipos en general. Los coliformes totales son el mejor indicador de la calidad higinica en el manejo de los alimentos. Objetivos: Conocer la tcnica para hacer recuento de NMP de coniformes totales. Estudiar la importancia de este recuento como indicador de la contaminacin de los alimento. 4. Practicar diluciones, siembras y recuento de microorganismos.
Principio del mtodo.

El mtodo se basa en determinar el numero mas probable de coliformes totales en una muestra, al comparar el numero de tubos positivos (presencia de gas en los tubos de hemlisis) frente a la tabla. La produccin de gas es el indicador de la presencia de los coliformes debido a que realizan fermentacin de los azucares que presenta el caldo.
Preparacin de la muestra. 3. Aspticamente pesar 10 g. de muestra y dilur en 90 ml. de agua peptonada, si se trata de muestras liquidas, tomar 10 ml de la muestra y diluirla en 90 ml de agua peptonada. 4. Homogenizar la mezcal por trituracin en un vaso esterilizado de licuadora a una velocidad aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos.(Esta tcnica se realiza cuando estamos trabajando con muestras slidas). NOTA: Para el proceso de aprendizaje, en este laboratorio la dilucin de las muestras se har, tomando 1ml de la muestra, previamente mezclada, y se adicionara a el tubo que contiene 9 ml de agua peptonada. Diluciones. Sobre la base de la solucin inicial de 10 g. O 10ml en 90 ml. (dilucin 10-1), ( en la practica 1ml de muestra + 9 ml de agua peptonada, preparar diluciones decimales de 10-2 y 10-3. usando pipetas estriles para cada dilucin, tomando 1 ml. de la solucin anterior en 9 ml. de agua peptonada evitando se forme espuma. Mezclar manualmente cada dilucin agitndola 25 veces en 7 segundos con movimientos ascendentes y descendentes formando un ngulo de abertura aproximado de 60 entre brazo y antebrazo.

Tcnica.
10.Adicionar aspticamente a 3 tubos que contengan 10 ml de medio Bilis verde brillante, 1 ml de la dilucin 10-1 y marcarlos con la dilucin correspondiente. 11. Adicionar aspticamente a 3 tubos que contengan 10 ml de medio Bilis verde brillante, 1 ml de la dilucin 10-2 y marcarlos con la dilucin correspondiente. 12.Adicionar aspticamente a 3 tubos que contengan 10 ml de medio Bilis verde brillante, 1 ml de la dilucin 10-3 y marcarlos con la dilucin correspondiente. 13.Incube a 35C de 24 a 48 2 hr. 14.Observe los tubos que presentaron produccin de gas. 15.Determine la cantidad de coliformes totales de acuerdo a la tabla anexa. Anexos: Agua Peptonada para Dilucin: Peptona Agua destilada

1g 1 lt

Disolver la peptona en un litro de agua destilada ajustando el pH a 6.8 0.1 y esterilizar en autoclave a 121C por 15 a 20 minutos. Nota: el Caldo Bilis verde brillante, viene listo para uso, de acuerdo a las indicaciones del fabricante, pese la cantidad de medio necesario y disuelva en agua destilada, despus autoclave.

Cuadro gua de trabajo.


10 g o 10 ml de muestra 90 ml de agua peptonada o 1ml de muetra + 9ml de agua peptonada.

Hacer 3 diluciones y agregar 1 ml de la dilucin elegida en las 3 tubos que contenga 10 ml de caldo Bilis verde brillante

Incubar a 35C por 24 a 48 hrs.

Preguntas: 5. Investigue Cual es la cantidad permitida de coliformes totales en la leche y jugos. 6. Describa 2 mtodos a travs del cual usted puede hacer un recuento de Coliformes totales. 7. Si un alimento presenta un recuento de coliformes totales muy alto, que cree usted que esto indique?.Explique. 8. Investigue que metodos se utilizan para hacer recuento de coniformes en agua potable.

Practica de laboratorio No 7 PRUEBAS BIOQUMICAS


La utilizacin de medios selectivos y diferenciales, las tinciones de Gram, caractersticas de las colonias y motilidad en el estudio de una determinada bacteria nos brinda una gran informacin sobre el gnero bacteriano con el que se est trabajando. Una vez aislada una bacteria determinada, se le pueden realizar una serie de pruebas que evalan su actividad bioqumica. Esto permite hacer una identificacin final de la especie en cuestin, es decir se estudian ciertos sistemas enzimticos que son nicos de cada especie y que sirven como marcadores de identificacin. En el laboratorio, esos sistemas enzimticos se detectan inoculando la colonia bacteriana bien aislada y fresca (24-48 hs de crecimiento) en una serie de medios de cultivo que contienen sustratos especficos e indicadores qumicos para detectar cambios de pH o presencia de subproductos especficos. Objetivos: Identificar especies pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Procedimiento: Se sometern cultivos (de 24-48 hs), con colonias aisladas a distintas pruebas bioqumicas. 1) Prueba del agar triple azcar hierro. Permite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar hidratos de carbono especfico incorporado a un medio de crecimiento bsico as como la produccin de gas y cido sulfhdrico. Se suele utilizar para la identificacin de distintas especies de la familia Enterobacteriaceae. Metodologa: 1- Inocular cada uno de los microorganismos aislados por puncin con asa recta hasta el fondo del tubo y por estra en la superficie inclinada del mismo tubo de agar TSI. 2- Incubar a 37C durante 18-24 h 3- Observar entre las 18 h y las 24 h de cultivo (ni antes ni despus) Resultados: El uso de un hidrato de carbono implica la liberacin al medio de productos cidos capaces de ser detectados por un indicador de pH. Si el microorganismo en cuestin es incapaz de usar el hidrato de carbono, consume entonces las peptonas del medio liberando productos que alcalinizan el mismo. Al interpretar los datos de la prueba debe tenerse en cuenta los siguientes aspectos:

A) Utilizacin del hidrato de carbono: *Si el microorganismo en estudio solo fermenta glucosa i) en superficie: reaccin alcalina, color rojo ii) en profundidad: reaccin cida, color amarillo *Si el microorganismo es capaz de fermentar tanto glucosa como lactosa: i) en superficie: reaccin cida, color amarillo ii) en profundidad: reaccin cida, color amarillo.

*Si el microorganismo no es capaz de fermentar glucosa ni lactosa (no enterico) i) en superficie: reaccin alcalina, color rojo ii) en profundidad: si es aerobio entonces no hay crecimiento ni cambio de color; si es facultativo entonces hay reaccin alcalina y color rojo * Si el microorganismo no es capaz de fermentar lactosa pero si de oxidarla i) en superficie: reaccin cida en tiempos cortos (color amarillo) luego reaccin Alcalina y color rojo. ii) en profundidad: no hay crecimiento ni cambio de color. B) Produccin de gas Si el microorganismo en estudio es aerobio, la produccin de H2 y CO2 se manifiestan por la formacin de burbujas y/o el desprendimiento de del agar del fondo del tubo, dejando un rea clara Si el microorganismo en anaerobio, entonces no hay liberacin de gases. C) Produccion de SH2: Si el microorganismo produce este cido, el mismo reaccionara con el hierro Formando un precipitado de SFe insoluble (color negro) i no produce el cido no habr reaccin. S 2) Pruebas del SIM (SULFURO-INDOL-MOTILIDAD) Estas cuatro pruebas son muy tiles para distinguir bacterias coliformes entre si. Produccin de INDOL Mide la capacidad del microorganismo de producir indol a partir de triptofano por accin de la enzima triptofanasa. Metodologa: 1) Inocular un poco de la colonia aislada por puncin en profundidad en un tubo de agar SIM. Dejar un tubo sin inocular como testigo. 2) Incubar a 37 por 48 h. 3) Colocar sobre el tubo unas gotas de reactivo de Kovacs (alcohol amlico, paradibenzaldehido cido). Dejar reposar por unos minutos. Prueba positiva: formacin de anillo rojo en la superficie (compuesto quinnico derivado del indol) Prueba negativa: anillo amarillo en superficie. Motilidad: Permite determinar la presencia de movimiento en las bacterias que poseen flagelos de locomocin Positiva: Observar opacidad alrededor de la puncin de inoculacin del tubo de SIM. Negativa: no se observa opacidad alrededor de la puncin de inoculacin del tubo de SIM. 3). Voges Proskauer y rojo de Metilo Estas dos pruebas permiten detectar el tipo de fermentacin (butilengliclica o acido mixta) que realiza el microorganismo. La prueba de Voges-Proskauer sirve para comprobar la capacidad de algunos organismos de producir acetilmetilcarbinol (acetona) a partir de la fermentacin butilengliclica de la glucosa. Klebsiella pneumoniae y Enterobacter (+). Escherichia coli y otras especies de Klebsiella (-). La prueba del Rojo Metilo sirve para comprobar la capacidad de un organismo de producir

y mantener estables los productos terminales cidos de la fermentacin (cido mixta) de la glucosa. Escherichia coli (+) y Klebsiella, Enterobacter (-). Metodologa: 1- Inocular el tubo del caldo MR-VP con una asa curva, con cultivo fresco. 2- Incubar a 37 por 48 h 3- Dividir el contenido del tubo en dos partes iguales 4- Para determinar presencia de acetona (Voges) agregar a 1 ml de cultivo 0.6 ml de Reactivo de Barrit y 0,2 ml de KOH al 40%. 5- Agitar suavemente y dejar reposar 5-10 min. Prueba positiva: color rosado-rojo en la superficie que se intensificar al cabo de unas horas (presencia de acetona). Prueba negativa: sin cambio de color (amarillo) en la superficie. 6-Para detreminar Rojo Metilo, agregar al segundo tubo unas 5 gotas de indicador rojo de metilo al 0,1%. Prueba positiva: si el cultivo continua siendo de color rojo, entonces el pH esta por debajo de 4,4. Hay fermentacin cido-mixta. Prueba negativa: color amarillo en la superficie, pH=6. 4). Aprovechamiento de Citrato (Medio Citrato de Simmons) Esta prueba permite determinar la capacidad del microorganismo para utilizar citrato como nica fuente de carbono. Salmonella, Arizona, Citrobacter,Klebsiella y Enterobacter (+), E. coli, Shigella, Edwarsiella, Yersinia, Actinobacillus (-). Metodologa: 1-Inocular un tubo por puncin y en superficie del agar citrato de Simmons con una ansada de cultivo fresco. 2-Incubar a 37C por 48 h Prueba positiva: viraje de color a azul. Prueba negativa: no hay cambio de color. 5). Agar hierro lisina (LIA). Se utiliza para diferenciar microorganismos entericos sobre la base de su capacidad de descarboxilar o desaminar la lisina Y formar H2S.

Metodologa: 1-Inocular un tubo por puncin y en superficie del agar LIA con una ansada de cultivo fresco. 2-Incubar a 37C por 48 h. Prueba positiva para descarboxilacin: produccin de color purpura(alcalino) en el fondo del tubo. Prueba negativa para descarboxilacin: no hay cambio de color. Prueba positiva para desaminacin: produccin de color rojo en la superficie inclinada y color amarillo en el fondo del tubo. Prueba negativa para descarboxilacin: no hay cambio de color. Prueba positiva para produccin de H2S: ennegrecimiento del medio.

Bibliografa: Diagnostico microbiolgico de koneman quinta edicin. Instituto de Investigaciones Biotecnolgicas, Universidad Nacional de General San Martn. Guia de Trabajos Prcticos. 2005. PDF. Preguntas de investigacin: 1. Investigue los principios, como se realizan y para que microorganismos se utilizan las siguientes pruebas bioqumicas: Coagulasa, Oxidasa, Catalasa, urea, . 2. investigue como se realiza un antibiograma por concentracin mnima inhibitoria y difusin en disco.

Practica de laboratorio 8. PREPERACIN DE AGAR PDA ( PAPA,DEXTROSA AGAR). Introduccin:


Los hongos son organismos eucariotas que se encuentran en casi todos los ambientes, crecen fcilmente en la gran mayora de los medios y cualquier tipo de materia orgnica, requieren para su crecimiento de gran cantidad de humedad y se adaptan fcilmente a cualquier ambiente. El agar PDA es un medio de fcil preparacin y econmico para el cultivo de hongos, generalmente permite estimular la esporulacin. Se puede comprar comercialmente, pero por su fcil preparacin es mejor hacerlo en el laboratorio. Formula: Papa Glucosa Agar agar Agua destilada Preparacin: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Pelar las papas y partirlas en rodajas. Agregar 100 ml de agua destilada y dejar hervir por 20 minutos. Filtrar mediante una gasa. Aadir al filtrado la glucosa y el agar. Completar a un litro con agua destilada. dejar hervir hasta que se disuelva completamente el agar. Autoclavar a 120C por 20 minutos. Adicionar 20 ml del agar autoclavdo por cajas de petri, dejar solidificar. Incubar una caja a 37C por 24 horas. 250 gr. 20gr. 20gr. 1Lt.

Cultivo de hongos del ambiente: 1. Tome una caja de agar PDA, destpela y expngala al ambiente por 20 minutos, al cabo de este tiempo, tape la caja e incbela a temperatura ambiente por 8 dias. Pregunta de investigacin: 1. Investigue como se cultivan de forma artesanal e industrial los championes y cual es el proceso hasta llevar este producto a los supermercados.

Practica de laboratorio No 9. Identificacin de hongos y microcultivo.


Objetivo: Conocer las tcnicas de identificacin de los hongos y el microcultivo como herramienta necesaria para la identificacin de los hongos.

Los hongos se estudian y clasifican a travs de las diferencias en su morfologa y forma de reproducirse. Al examinar los hongos utilizamos las diferencias de la colonia, el micelio vegetativo y las estructuras reproductoras, tanto sexuales como asexuales. Las colonias difieren en tamao, aspecto de su superficie y color. Sobre la base de su reproduccin sexual los mohos pueden agruparse en cuatro clases: a. Los ficomicetos. b. Los ascomicetos. c. Los bacidiomicetos. d. Los deuteromicetos. Las levaduras son hongos unicelulares, la mayoria hacen parte de los ascomicetos. Normalmente son clulas ovales o cilndricas y habitualmente se dividen por gemacin. Durante el proceso de gemacin se origina una pequea clula que aumenta de tamao gradualmente y se separa de la clula madre. Las levaduras normalmente no desarrollan un micelio, sino que permanecen en estado unicelular durante todo el ciclo de crecimiento. Existen casos como el de la candida albicans una levadura potencialmente patgena que causa infecciones vaginales, de pulmones e incluso sistmica. Los hongos patgenos pueden producir diversas clases de micosis y se subdividen en tres categoras. Enfermedad Agente etiolgico Principales zonas afectadas Micosis superficiales Tia Microsporum Cuero cabelludo Pie de atleta Ephydermopiton, Trichopyton Entre los dedos de los pies Tia cruval o inginal Ephydermopiton, Trichopyton Regin genital Micosis subcutaneas Esporotricosis Speorothrix schenckii Brazo, Manos Cromoblastomicosis Varios gneros de hongos Piernas, pies. Micosis sistmicas Criptococosis Criptococcus neoformans Pulmones, meninges Coccidiomicosis Coccidioides immitis Pulmones. Histoplasmosis Histoplasma capsulatum Pulmones. Blastomicosis Blastomyces dermatitides Pulmones Candidiasis Candida albicans Cavidad oral, tracto intestinal

Introduccin:

Procedimientos
Preparacin en fresco
Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuacin: 1. Seleccionar una colonia aislada. 2. Calentar a la llama el alambre de un asa de siembra, y doblar. 3. Con la ayuda del asa, extraer un fragmento de la colonia. 4. Depositar el fragmento extrado sobre un portaobjetos en el cual, previamente, se ha depositado una gota de azul de lactofenol. 5. Cubrir con un cubreobjetos y presionar suavemente para dispersar la colonia; de esta forma, la muestra est disponible para su observacin al microscopio. Este procedimiento es el que utilizan la mayora de los laboratorios, ya que las muestras se preparan con facilidad y rapidez y adems permite identificar muchas de las especies de hongos ms habituales. El mayor inconveniente de la observacin en fresco es que se puede alterar el ordenamiento caracterstico de las esporas al presionar con el cubreobjetos. De igual forma este procedimiento se utiliza para el reconocimiento de hongos de muestras directas, para lo cual se raspa con una lanceta o portaobjeto el rea afectada, sobre una caja de petri estril, posteriormente se pone la muestra en un portaobjeto se adiciona una gota de azul de lactofenol, se pone un cubreobjeto encima. Luego pone en cmara hmeda durante varias horas y posteriormente se observa al microscopio.

Preparacin con cinta de celofn adhesiva


El procedimiento se lleva a cabo como sigue: 1. Apoyar el lado engomado de un trozo de cinta adhesiva transparente sobre la superficie de una colonia. 2. Colocar la cinta bien extendida sobre una gota de azul de lactofenol o azul de anilina colocada, a su vez, sobre un portaobjetos. 3. Observar al microscopio para conocer la forma y ordenamiento caracterstico de las esporas. Este mtodo puede considerarse como el ms simple, econmico y adecuado para la identificacin de hongos, recomendable para los laboratorios microbiolgicos de cualquier nivel. La preparacin de la cinta transparente permite observar al microscopio como se desarrolla el microorganismo en el cultivo. Generalmente las esporas se mantienen intactas y la identificacin se realiza con facilidad. Una de las desventajas de este mtodo es que si la cinta transparente no se presiona con suficiente firmeza sobre la superficie de la colonia, la muestra no es adecuada, ya que al no quedar bien adherida la cinta, las esporas o las hifas no se pueden identificar. En los casos en que mediante este mtodo no se observen esporas deber realizarse la preparacin en fresco.

Microcultivo
Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuacin: 1. Coloque sobre una caja de petri estril un papel filtro hmedo y sobre este 2 palillos. Sobre los palillos, poner una lamina portaobjeto estril. 2. Cortar un bloque pequeo de un medio slido adecuado (agar), que ha sido vertido en una caja de Petri, hasta una altura de 2 cm. El bloque puede cortarse con la ayuda de un bistur estril o con un tubo de ensayo estril sin reborde (lo que permite obtener un taco redondo). 3. Colocar el bloque de agar sobre el portaobjetos. 4. Con una asa de siembra cuyo alambre ha sido doblado en ngulo recto, inocular los cuatro cuadrantes del bloque de agar con el microorganismo a identificar. 5. Colocar un cubreobjetos estril sobre la superficie del bloque de agar sembrado. 6. Tapar la caja de Petri y sellarla con cinta, incubar a 30o C x 8 a 15 dias. 7. Finalizado el perodo de incubacin, retirar el cubreobjetos (este proceso debe realizarse en una cabina de seguridad biolgica), y colocarlo en un portaobjetos que contenga azul de lactofenol o azul de anilina. La observacin al microscopio permite distinguir la forma y disposicin de las esporas. Este mtodo permite la observacin microscpica del hongo mientras se desarrolla directamente debajo del cubreobjetos, de forma que las caractersticas microscpicas se distinguen con facilidad, las estructuras se mantienen intactas y puede observarse un gran nmero de reas representativas. No deben realizarse cultivos en portaobjetos de hongos de crecimiento lento que pueden ser patgenos dimorfos, como Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasiliensis o Sporothrix schenckii.

Prueba del tubo germinativo


Se realiza de acuerdo con el siguiente procedimiento: 1. Suspender un inculo muy pequeo de clulas de la levadura obtenidas a partir de una colonia aislada en 0,5 ml de suero de oveja (o de suero humano, procedente de un individuo sano). 2. Incubar los tubos a 35-37o C, no superando las 3 horas. 3. Despus de la incubacin, tomar una gota de la suspensin y colocarla sobre un portaobjetos. 4. Observar con el microscopio a poco aumento la presencia de tubos germinativos. 5. Un tubo germinativo se define como un apndice con la mitad de ancho y 3 a 4 veces el largo de la clula de la cual emerge. En la mayor parte de los casos no existe constriccin en el origen del tubo germinativo. Preguntas de investigacin: 1. Investigue que son las dermatomicosis y cuales son los principales hongos implicados en estas enfermedades. 2. Investigue el uso de los hongos en el control biolgico y cual es su modo de accin. (tome como ejemplo la broca del caf, pero investigue otras).

Practica de laboratorio No 10. Anlisis microbiolgico del ambiente.


Introduccin:

Los microorganismos, tiene la capacidad de ubicarse en todos los ambientes y sitios. Esto se denomina ubicuidad. Es por esto que en procesos industriales es de vital importancia el conocimiento de la ubicacin y la carga microbiolgica de las personas y del medio donde se trabaja. Para el trabajo biotecnolgico a nivel industrial es indispensable poder conocer en la medida de lo posible cual es la poblacin y/o poblaciones microbianas que hacen parte del ecosistema de la fabrica. El objetivo que se busca es poder tomar medidas de control, en el caso que los microorganismos encontrados como contaminantes del ambiente sean patgenos, o simplemente saber con que tipo de microorganismos contamos en nuestro ambiente (mohos, levaduras, bacterias). Objetivos: 1. Conocer las tcnica para hacer anlisis de ambientes.. 2. Estudiar la importancia de estas tcnicas, en el conocimiento de los ecosistemas dentro de las industrias. 3. Conocer la importancia de la desinfeccin en los procesos de alimentos.
Principio del mtodo.

El mtodo se basa en determinar que tipo de microorganismos se encuentran en el ambiente de trabajo, esto a travs de la siembra en diferentes medios de cultivo para el aislamiento de hongos y bacterias.
Nota se harn diferentes siembras de ambientes: 1234Siembra de superficie. Siembra de manos. Siembra de ambiente. Siembra de respiracin y tos.

1. Siembra de superficies. 1. Saque una torunda estril y mjela en agua peptonada, escurra el exceso de peptona, presionando contra las paredes del tubo. 2. Tomando una plantilla de cartulina que contenga un rea de 20cm2, pngala sobre el rea de trabajo a la cual le desea realizar el control microbiolgico y frote la torunda mojada en la peptona tres veces en dicha rea, retrocediendo entre los trazos sucesivos. 3. Inserte la torunda en el tubo que contiene la peptona, mover la torunda dentro de este para que se desprendan los microorganismos. 4. Realice este mismo procedimiento (pasos 1,2 y 3). en 4 partes mas del rea de trabajo. 5. Mezcle las muestras contra la palma de la mano. 6. Siembre 1ml y 0.1 ml en cajas de petri y agregue 20 ml de medio plate count para bacterias y 20 ml de medio saboreau para hongos, mezcle como se aprendi en la siembra de dilucin en masa. 7. Tome dos cajas de petri con agar saboreau y siembre en la superficie 0.5 y 0.1 ml de la muestra. Con un asa curva extienda la muestra sobre toda la caja. 8. Incube 48 horas a 37oC las cajas de agar nutritivo y realice el recuento de los microorganismos e informe el numero de UFC en 20cm2 de rea.

9. La cajas de agar saboreau que se sembraron por superficie se dejaran a temperatura ambiente por 8 das. 10. Las cajas de agar saboreau que se sembraron por dilucin en masa se incubaran a 37 oC x 8 dias. Nota: Despus de realizar la siembra anterior, tome una toalla y humedzcala en una solucin de hipoclorito al 3% en agua, limpie el rea de trabajo, limpie el lmpido con una toalla con agua y deje secar. Realice nuevamente el procedimiento de siembra de superficies posterior a la limpieza con el hipoclorito. 2. Siembra de manos. 1.Tome 1 cajas de petri con medio agar nutritivo, divida la caja en dos con un asa curva. 2. Marque cada parte de la caja con derecha e izquierda. 3. Haga presin con los dedos e introduzca un poco las uas dentro del agar. 4. Incube las cajas por 48 horas a 37oC. 3. Siembra del ambiente.

1. Tome una caja de agar nutritivo y otra de agar saboreau.


2. Exponga la caja destapada al ambiente por 20 minutos. 3. Incube la caja de agar nutritivo a 37oC por 48 horas. 4. La caja de agar saboreau de dejara a temperatura ambiente por 8 das. 4. Siembra de Respiracin y tos. 1. Tome una caja de petri con medio agar nutritivo. 2. Tosa o estornude sobre la caja 4 veces. 3. Incube las cajas por 48 horas a 37oC. Anexos: Agua Peptonada para Dilucin: Peptona Agua destilada

1g 1 lt

Disolver la peptona en un litro de agua destilada ajustando el pH a 6.8 0.1 y esterilizar en autoclave a 121C por 15 a 20 minutos. Nota: el agar nutritivo y el plate coutn, viene listo para uso, de acuerdo a las indicaciones del fabricante, pese la cantidad de medio necesario y disuelva en agua destilada, despus autoclave. Preguntas de investigacin: 1. Investigue cual es la flora normal del cuerpo humano. 2. Investigue cual es la importancia de conocer que tipo de microorganismos habitan en el ecosistema de una industria. 3. Usted como qumico tiene la posibilidad de crear una industria de productos desinfectantes, Investigue como se evala la eficiencia de un desinfectante. Desde el punto de vista microbiolgico.

Nota Aclaratoria: muchas de los tcnicas presentes en este mini-manual se han


tomado de pginas de Internet, manuales de microbiologa, libros y otras prestadas por algunos amigos; se han realizado algunos cambios en las mismas y se han adaptado para el grupo de microbiologa en qumica. En ningn momento se busca plagiar la informacin aqu contenida, pero s se busca poder dar una informacin adecuada para los estudiantes. LEONARDO PADILLA SANABRIA. Bacterilogo MSc. Bibliografa: Internet. Diagnostico microbiolgico Koneman, quinta edicin. Editorial panamericana. Manual de prcticas: Control microbiolgico en la industria. PUJ. Blanca Cecilia Gaviria. Manual de microbiologa industrial. PUJ. Annabella Gaitan Herrera. Manual de micologa. INS. Microbiologa alimentara. Segunda edicin. Editorial diaz de santos.