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Fluorimetra

Tcnica espectrofotomtrica que se basa en la absorcin de radiacin por parte del analito a
medir en una muestra y su posterior emisin. Su fundamento es la fluorescencia molecular
que se basa en que la emisin de radiacin por electrones excitados que vuelven al estado
fundamental se realiza en varias etapas, de manera que se emite una radiacin de una
longitud de onda distinta a la absorbida. En el fenmeno de fluorescencia, una molcula
absorbe radiacin electromagntica y debido a ello los electrones pasan de un estado basal a
otra fase de excitacin. Al ser la longitud de onda de la radiacin emitida diferente de la
longitud de onda de absorcin, puede utilizarse sta tanto para identificar como para
cuantificar sustancias.


La fluorescencia se emite en todas direcciones, lo que puede aprovecharse al disear los
aparatos de medida que, en principio, son similares a los usados en espectroscopa de
absorcin, con la diferencia de que, para evitar las interferencias que pueda causar la
transmisin de la radiacin incidente sobre la muestra, se sita el sistema de deteccin en
ngulo recto respecto a la luz incidente. De esta manera, slo se detecta radiacin
fluorescente. Si no se hiciera as, no se podra discriminar la radiacin fluorescente, al ser sta
de menor magnitud que la radiacin no absorbida procedente de la fuente de radiacin (al
situar el detector en un ngulo de 90 con respecto a ella, la radiacin no absorbida
procedente de la fuente de radiacin no ser detectada).

La principal ventaja de las tcnicas fluorimtricas es su sensibilidad, que permiten detectar
cantidades de sustancias del orden de nanogramos. Las causas de esta mayor sensibilidad de la
fluorimetra con respecto a la espectrofotometra de absorcin radican en que las medidas de
fluorescencia utilizan como blanco un compuesto no fluorescente, que da una seal cero o
muy prxima a cero en el detector. En cambio, en el caso de las medidas de absorcin, el
blanco transmite la mayor parte de la radiacin incidente y provoca una gran respuesta en el
detector. Por lo tanto, en los mtodos fluorimtricos es posible aumentar significativamente la
sensibilidad del detector, permitiendo medir con precisin cantidades muy pequeas de
radiacin.
Las medidas de fluorescencia como alternativa en la cuantificacin de acidos
nucleicos
La determinacin precisa de concentraciones de DNA o RNA puede ser difcil, particularmente
cuando no se conoce la pureza de la muestra. En muchos casos, la aproximacin ms rpida y
precisa para determinar la concentracin de cidos nucleicos relativamente puros es la
espectrofotometra de absorbancia.
Tanto el DNA como el ARN absorben a un mximo de 260nm, mientras que la mayora de las
protenas absorben de manera ms intensa a 280nm. Sin embargo, los cidos nucleicos
tambin absorben significativamente a 280nm (50%-55% de la absorbancia a 260nm), y la
mayora de las protenas pueden absorber a 260nm tambin fuertemente (depende de la
protena). Por esto puede ser difcil medir precisamente la concentracin de DNA,RNA y
protenas mezclados. La espectroscopia de absorbancia es una tcnica rpida y precisa para
determinar la concentracin de DNA en muestras puras. Es menos precisa cuando el DNA
contiene protenas, RNA, oligonucletidos o nucletidos, estos ltimos absorben a 260nm
fuertemente y no se distinguen del DNA. Aunque usando medidas adicionales a 230nm, 280nm
o 320nm se puede determinar la existencia de contaminantes debido a protenas u otras
molculas orgnicas. Aunque en ciertos umbrales la cantidad de cidos nucleicos no se puede
distinguir de los posibles artefactos.
Este problema se puede superar usando un mtodo alternativo para la medicin de DNA en
presencia de otras biomolculas, ensayos fluorimtricos usando tintes. Estos tienen una alta
afinidad por el tipo de biomolcula a determinar y son menos sensibles a las concentraciones
relativamente altas de los posibles contaminantes que haya en la muestra.
La fluorescencia permite una determinacin de cidos nucleicos ms sensible y especfica que
los mtodos convencionales de espectroscopia de UV-VIS. Se trata de una deteccin indirecta
de las molculas por medio de un tinte fluorescente. Este mtodo esta ideado para la
determinacin especifica de dsDNA, ssDNA y oligonucletidos, RNA y tambin protenas.
Adems de una alta especificidad, este mtodo es algo ms sensible que el mtodo
convencional de absorcin de la luz en una factor de 1 000-10 000. El hecho de que el tinte se
una especficamente al cido nucleico de intereses es una gran ventaja, pudindose medir
dsDNA a muy bajas concentraciones por ejemplo.

Segn el tinte que se escoja se medir a unos rangos, y se distinguir entre RNA y DNA. Tambin se
observan las diferencias entre absorbancia y el uso de algunos tintes en fluorescencia.
Diferencias entre medidas de fluorescencia y absorbancia
En un principio, ambos mtodos de deteccin se basan en que molculas solubilizadas
interaccionan con la luz a una longitud de onda especfica. En la absorcin, la energa lumnica
causa una transicin de los electrones de la molcula iluminada a un nivel energtico mayor,
tras esto vuelven a su estado original. Durante este proceso se absorbe luz. Un fotmetro es
capaz de determinar la diferencia entre la energa de luz restante y la cantidad inicial usada
para excitar la molcula a travs de un detector, determinando la absorbancia por tanto.
En el caso donde la concentracin de la muestra se determina por fluorescencia, la muestra es
iluminada de manera similar, a una longitud de onda especfica. De nuevo, la luz primero se
absorbe. Si un fluorforo es excitado, el o sus electrones excitados, no vuelven directamente a
su estado de energa original. Primero, el electrn cae a un nivel energtico algo menor,
seguido de un segundo paso, en el cual vuelve a su estado original. En este caso se emite
fluorescencia. La longitud de onda emitida siempre es ms larga que la de la luz excitadora.

Una de las diferencias principales con la determinacin de concentraciones usando medidas
de absorbancia es que el fluorforo no se mide directamente, sino que es usado para la
deteccin indirecta de molculas tales como DNA. Los clculos de concentraciones de una
muestra se basan en una curva estndar generada previamente. As, concentraciones
conocidas de cidos nucleicos (estndares) son combinados con un tinte fluorescente, y se
mide la fluorescencia relativa en un fluormetro, seguido de la interaccin con los estndares.

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