Materiales y métodos

Medios de cultivo

a) PAPA – DEXTROSA – AGAR (PDA)

Para la preparación del medio de cultivo es necesario saber cuales el medio que
tiene mayor preferencia crecer nuestro hongo, ya que contamos con muchas
opciones para prepararlos, entren los cuales vimos esta: PAPA – DEXTROSA –
AGAR (PDA), Jugo de TOMATE – AGAR y PAPA – DEXTROSA – AGAR (PDA);
siendo este ultimo el empleado en la preparación
Este medio de cultivo se utiliza en el aislamiento, desarrollo y reproducción de un
gran número de especies de hongos. Para bacterias se utiliza n1 aislamiento
inicial, principal de los géneros Xanthomonas y Agrobacterium, puesto que las
bacterias necesitan medio de cultivo específico para el desarrollo y así lograr la
identificación de los diferentes géneros.
Ingredientes:
 Papa…………………………………………………….…200 ml
 Dextrosa…………………………………………………...15 g
 Agar…………………………………………………………20 g
 Agua destilada………………………………………….Aforar a 1000 ml

Procedimiento
Se necesitan dos matraces de 1000 ml cada uno. Partir 200 g de papa sin cáscara
vaciar a uno de los matraces y cubrir los trozos con agua destilada, hervir durante
15 minutos, concluido este tiempo se cuela la infusión o caldo de papa, a través de
manta de cielo Esta solución se pasa a una probeta de 100 l y se vacían los 15 g
de destroza, mezclar y aforar a 1000 ml.

Vaciar a cada matraz 500 ml de la

mezcla y añadir en cada matraz 10
g de agar. Tapar con algodón los
matraces de tal manera que selle y
no entre aire del ambiente.
Esterilizar por 20 minutos en una olla a presión a 15 lbs de presión. Pasado este
tiempo enfriar con agua fría el matraz a una temperatura tolerable.

Proceder a vaciar en las cajas petri en condiciones estériles, en un área donde

este un mechero, si se quiere acidificar de medio agregando a punto de vaciado 1
ml de ácido láctico por matraz, o agregar antibióticos, añadir 500 g por matraz.

b)

Jugo V8-AGAR
Se utiliza para llevar a cabo aislamientos de Phytophthora infenstans, así como
para inducir la producción la producción de oosporas de esta especie. También se
utiliza para aislar especies del género Phytophthora y Pythium.
Ingredientes:
 Jugo de verduras V8 centrifugado………………………300 ml
 CaCO3……………………………………………………...4.5 g
 Agar…………………………………………………………20 g
 Agua destilada……………………………………………..a forar a 1000 ml
Para sustituir el jugo V8 es conveniente sustituir por jugo de tomate en la misma
proporción, para desarrollo de algunas especies del género Phytophthora.
Para Phytophthora parasitica y Phytophthora palmivora se utiliza los siguientes
ingredientes para la producción de esporangios:
 Jugo de verduras V8 centrifugado………………………100 ml
 CaCO3……………………………………………………....2 g
  Agar…………………………………………………………15 g
 Agua destilada……………………………………………..900 ml
Preparación
Agregar el CaCO3 al jugo de verduras V8, agitar hasta disolverlo, dejar reposar
esta solución durante 10 minutos. Para clasificar la solución centrifugar durante 20
minutois a 3000 R.P.M. decantar y juntar el líquido sin sólidos, resultante de la
centrifugación, hasta completar la cantidad requerida. Con la primer formula,
disolver el agar en agua destilada, calentando ligeramente, añadir la solución de
agar al jugo de verduras V8 centrifugado y aforar con agua destilada a 1000 ml.
Para la segunda formula, utilizar 900 ml de agua destilada para disolver el agar
mezclando esta solución con el jugo de verduras V8 centrifugado.
c) Jugo de TOMATE - AGAR
Este medio de cultivo es apropiado para efectuar aislamientos de Phytophthora
capsici así como para logar un adecuado crecimiento vegetativo. L aproducción de
espoarngios se logra transferiendo discos del medio de cultivo con micelio del
hongo a cajas de petri con agua destilada, después de 24 – 48 hrs a temperatura
ambiente, presenta la esporulación.
Ingredientes:
 Jugo de tomate centrifugado………………………….…90 ml
 CaCO3……………………………………………………...6 g
 Agar…………………………………………………………20 g
 Agua destilada……………………………………………..950 ml
Procedimiento
Disolver en CaCO3 en 90-85 ml de jugo de tomate agitando, dejando reposar esta
solución durante 10 minutos. Para clarificar centrifugar durante 20 minutos a 3000
R.P.M. decantar y juntar el líquido centrifugado hasta completar la cantidad
requerida. Disolver en 950 ml de agua destilada, añadir la solución centrifugada a
la solución de agar, mezclando bien.

Aislamiento
Esta práctica consiste en tomar material vegetativo infectado por hongos para
poder aislarlos en un medio de cultivo para su posterior purificación e inoculación
todo esto con el cuidado necesario para evitar el acceso de cualquier otro agente
oportunista y evitar así contaminación.
Materiales
 Mechero bunsen
 Material vegetativo infectado
 Cloro al 3%
 Servilleta
 Cajas petri
 Medio de cultivo

Comenzamos por tomar partes de nuestro material infectado, en este caso será
Sclerotinia presente en el cultivo de lechuga y bañarlos en una caja petri con el
cloro al 3% para evitar así la posible contaminación de otros agentes patógenos
como lo pueden ser bacterias u hongos presentes en el ambiente. Este se deja no
más de 5 minutos.
Pasado este tiempo se deja secar en la servilleta de papel cerca de la flama del
mechero bunsen, esto para que el mismo ambiente de la flama del mechero
elimine otros agentes infecciosos del ambiente.
Una vez secas las muestras se procede a colocar las muestras en el medio de
cultivo, estas deben ser 8 y estar dispuestas de maneta equidistante alrededor de
la periferia de la caja petri. Todo esto con las medidas necesarias de esterilidad.

Una vez depositados se cierra la caja y se sella con una tira de parafina para
evitar contaminaciones. Los medios de cultivo se depositaron en una caja mas
grande donde se dejarán una semana para su correcto desarrollo en las
condiciones adecuadas.

Purificación y conteo de esporas

La práctica consistió en el aislamiento de Sclerotinia a un medio de cultivo nuevo

Materiales
  Mechero
 Aguja de disección
 Medios de cultivo

Se tomaron los medios de cultivos infectados de

la practica anterior para aislar solo una parte de la
hifa infectiva del hongo. Solo se tomó una
pequeña muestra y se colocó en otra caja Petri
para esperar su desarrollo.

Para el conteo de espiras se empleó del hematocitómetro. Este se trata de un

portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas en forma de H en el
centro se forman las áreas de conteo en cuyo fondo se ha marcado con la ayuda
de un diamante una cuadrícula de dimensiones conocidas. Se cubre la cámara
con un cubreobjetos que se adhiere por simple tensión superficial con dos gotas
de twin. Luego se introduce por capilaridad entre
la cámara y el cubre, el líquido con las células a
contar, generalmente tras una dilución previa; la
cámara tiene dos zonas lo que permite hacer
dos recuentos simultáneamente. Se observa la
retícula al microscopio con el aumento
adecuado y se cuentan las células.
En esta práctica se contaron esporas del hongo
alternaria para saber la cantidad que se
encontraban dentro de la muestra.
En el cuadrante A:

Numero de esporas:
221/mm3 x 2000= 442000 / ml

Cuadrante B:
Numero de esporas:
196/mm3 x 2000= 392000 / ml

Cuadrante C:

Numero de esporas:
219/mm3 x 2000= 438000/ ml

Cuadrante D:
Numero de esporas:
174/mm3 x 2000= 348000/ ml

Cuadrante E:
Numero de esporas:
147 mm3 x 2000= 294000/ ml
Total de esporas: 1914000
Medición de una espora