Trabajo Práctico Nº 1

Fundamentos básicos para el trabajo en

esterilidad en el análisis microbiológico
de alimentos

AÑO 2021
Introducción:

Es imprescindible el trabajo en esterilidad para el análisis microbiológico de alimentos,

caso contrario los resultados derivados de esta acción serán erróneos. Para ello debemos
garantizar la correcta preparación de los medios de cultivo (a), del material de vidrio (b),
acondicionamiento del ambiente de trabajo (c) y una correcta manipulación del material a
analizar en condiciones de esterilidad (d). Asimismo debemos proceder a decontaminar el
material luego de la jornada de trabajo (e).

Objetivo:
Se plantea recordar aquellas acciones que permitan el trabajo en esterilidad esencial en un
laboratorio de microbiología de alimentos. Asimismo, nos familiarizaremos en el manejo
de cultivos realizando diluciones, aislamiento por agotamiento (estriado), siembra en
superficie y en profundidad.

Metodología:
a) Preparación de medios de cultivo

Se recomiendan los medios de cultivo deshidratados por razones de conveniencia y porque

su preparación es más uniforme. También pueden prepararse a partir de sus componentes
básicos, en este caso deben pesarse y agregarse los componentes en las cantidades
correctas. Para hongos filamentosos esta es la metodología más frecuente que se utiliza en
la actualidad, ya que no se disponen en forma comercial las formulaciones finales.
Para los medios comerciales se pesa según la cantidad de las instrucciones en el rótulo y
luego se agrega el agua destilada y se disuelve completamente por ebullición si el medio
tiene agar o por agitación frecuente en el caso de un caldo. Se ajusta el pH y se distribuye
en frascos o tubos en la forma y cantidades necesarias. No se debe usar más del 75% del
volumen del frasco para un manejo seguro del mismo al momento de tener que fundir el
mismo si fuera necesario. Se pueden utilizar erlenmeyers con tapón de algodón o frascos
con tapa a rosca tipo Scotch para la preparación de los medios y llevar al autoclave.
En caso de preparar tubos con caldo, se prepara en un vaso de precipitado el volumen total
y luego se dispone con pipeta el volumen en tubos de ensayo si fuera así requerido.
En caso de ser necesario poner campanas de Durham (Foto 1) las mismas se colocan
invertidas y luego de haber dispuesto el caldo en el tubo y se verifica que no quede gas en
el interior de la misma.

Foto 1: Campana de Durham

Los caldos se pueden convertir en agares agregándoles un 1,5% de agar-agar al caldo. Si

debo fraccionar un medio que contiene agar para luego esterilizarlo (caso picos de flauta de
agar nutritivo por ejemplo), debo tener en cuenta que se debe disolver la mezcla del polvo
del caldo y el agar –agar en el agua destilada y fundir por completo a ebullición para luego
con pipeta distribuir en caliente en tubos y luego esterilizar.
Con algunas excepciones, los medios se esterilizan en autoclave a 121ºC durante 15
minutos. Tanto tapas de frascos como tubos deben estar flojas para que en el proceso de
esterilización pueda penetrar el vapor y luego de sacar el material del autoclave se ajustan
las tapas. Hay medios que no se esterilizan en autoclave necesitando un proceso de
ebullición por determinado tiempo a baño maría y otros en los cuales se prepara el medio
base, se esteriliza y posteriormente se les agregan suplementos específicos sensibles al
calor que son esterilizados por filtración.
En muchos casos el medio recién preparado y esterilizado se distribuye en placas de Petri
para su uso inmediato por cultivo en superficie. Las placas deben secarse antes de su
inoculación para evitar la difusión y confluencia de las colonias. Las placas deben utilizarse
inmediatamente o almacenarse durante un máximo de dos días a temperatura ambiente o
siete días si se conservan refrigeradas y en los dos casos dentro de bolsas impermeables a la
humedad, invertidas. Las placas contaminadas deben ser desechadas.
En caso de no haber utilizado el medio de cultivo cuando lo teníamos caliente luego de
terminada su esterilización, y el mismo se haya solidificado, debo fundirlo a baño maría o
en microondas a baja potencia y por lapsos cortos de tiempo y luego plaquearlo.

b) Preparación del material de vidrio

b.1) placas de Petri: si bien hoy día, lo más frecuente es utilizar placas de Petri plásticas
esterilizadas por oxido de etileno, también podrán ser utilizadas placas de Petri de vidrio.
En este caso: se deben envolver en papel, rotular y esterilizar en una estufa durante 3 horas
a 160 °C .
b.2) pipetas: Si bien lo más frecuente es utilizar micropipetas automáticas, existirán
situaciones en las cuales será mejor el uso de pipetas de vidrio. En este caso se debe colocar
un algodón en la parte superior, se envuelven y rotulan y se esterilizan en una estufa
durante 3 horas a 160 °C.
También puede utilizarse un pipetero de acero inoxidable. En este caso se colocan las
pipetas dentro de él, con las puntas hacia abajo y se lo somete a un ciclo de autoclave
normal o bien en estufa durante 3 horas a 160 °C.

b.3) puntas para micropipetas: Los tips son los consumibles que necesita la micropipeta y,
para ser esterilizados, se colocan en racks o frascos de vidrio, se envuelven con papel y se
autoclavan a 121ºC durante 15 minutos.

c) Acondicionamiento del área de trabajo

El laboratorio debe estar aislado del exterior y no debe haber corrientes de aire. La mesada
y las manos se desinfectan con el uso de alcohol 70:30 (es conveniente tener siempre
preparado en una piseta en el laboratorio).
Se colocan dos mecheros distanciados a 30 cm aproximadamente para trabajar en ese
espacio y se aconseja, en el caso que se disponga, trabajar siempre dentro del flujo laminar.

d) Trabajo en esterilidad

Existen dos metodologías de siembra para la realización de recuentos en placa: siembra en

superficie y siembra en profundidad.
La siembra en superficie consiste en agregar el inoculo que generalmente es de 0,1 ml sobre
una placa agarizada distribuyendo el mismo con la ayuda de una espátula de Drigalski.
Luego, se incuba y se realiza el recuento. Para el caso de la siembra en profundidad se
añade 1 ml del inoculo en una placa de Petri estéril y luego se vuelca el medio de cultivo
fundido y atemperado, se realizan movimientos envolventes para homogeneizar el inóculo
con el medio y se deja solidificar. Se incuba y se realiza el recuento.
El inoculo que se utiliza en la siembra, debe provenir de un homogenato del alimento, en un
diluyente adecuado, y haber sufrido tantas diluciones como sean necesarias.
Estas diluciones, por lo general, son decimales y se realizan en tubos de ensayo. Es muy
importante el uso de un vortex para garantizar la homogeneización del material a analizar.

e) Decontaminación del material utilizado

Para el descarte del material utilizado se procede a sumergir las placas de Petri y
pipetas de vidrio en una solución de lavandina al 10% durante 24 hs, se desecha el agar
y luego se realiza un lavado con detergente y agua. Se les saca el rótulo a las placas con
una esponja o con alcohol.
Los tubos de las diluciones se autoclavan a 1,3 atm durante 20 minutos, se lavan con
detergente y agua, y se retiran los rótulos con la ayuda de una esponja o de alcohol.
El material descartable se desecha en una bolsa roja para luego ser retirado para su
incineración. Caso contrario existen bolsas aptas para autoclave, en las que se puede
 introducir el material descartable para decontaminar y se le aplica el tratamiento
térmico para posteriormente desecharlo.

Actividad:

1) Revisar corrientes de aire

2) Preparar la mesada de trabajo: limpiar, colocar mecheros y si es necesario
tener un recipiente con lavandina al 10% para desechar el material sucio.
3) Utilizar guantes estériles o desinfectar las manos con alcohol 70:30
4) Realizar diluciones seriadas partiendo de un cultivo O/N (aprox. 108 ufc/ml)
de un microorganismo determinado y sembrar 1 ml en profundidad utilizando
Agar para Recuento en Placa (PCA) atemperado y 0,1 ml en superficie en
placas con PCA, de las diluciones correspondientes para obtener un recuento
apropiado entre 25-250 ufc. Rotular.
5) Realizar un estriado por agotamiento para obtener colonias aisladas de dicho
cultivo O/N.
6) Incubar a 37 ºC durante 24/48 hs y realizar los recuentos correspondientes.