GUÍA DE LABORATORIO DE CULTIVO Y PROPAGACIÓN IN VITRO DE

ORQUÍDEAS

1. ELEMENTOS DE PROTECCIÓN PERSONAL

1. Bata de laboratorio blanca y mangas largas.
2. Guantes.
3. Tapabocas.
4. Gorro.
2. RECOMENDACIONES PAR TRABAJAR EN LABORATORIO
1. Las manos y brazos deben lavarse con jabón líquido antes y después de un
procedimiento.
2. Retirar pulseras, anillos, relojes o bisutería en muñecas y dedos.
3. Las uñas deben estar cortas, limpias y sin esmalte.
4. Mantener el cabello recogido.
3. LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN DE CÁMARA DE FLUJO LAMINAR.

3.1. ELEMENTOS
 Hipoclorito de sodio al 7% (comercial) (en pulverizador para rocear)
 Toallas de papel
 Agua corriente
 Etanol al 70% (en pulverizador para rocear)
 Trapero
 Beaker o erlermeyer de 100 ml o 200 ml
 Mecheros
3.2. PROCEDIMIENTO
1. Limpie la superficie de la cámara de flujo laminar rociando hipoclorito de sodio al
3% y frote con un paño o toalla de papel por el resto del área de trabajo.
2. Trapee el suelo del área con una solución de agua e hipoclorito de sodio al 7%
(límpido comercial).
3. Encienda la luz UV durante 30 minutos, apague y espere 20 minutos a que los rayos
se dispersen.
4. Limpie nuevamente la superficie de la cámara de flujo laminar rociando hipoclorito
de sodio al 3% y frote con un paño o toalla de papel por el resto del área de trabajo.
5. Rocíe con etanol al % los implementos y materiales que introducirá en el área de
trabajo.
6. Introduzca dentro de la cámara de flujo laminar, 3 mecheros y dispérselos sobre la
superficie y enciéndalos, asimismo, un erlermeyer o beaker con etanol al 70% para
 sumergir las puntas de pinzas y bisturí que se usaran, esto con el fin de sumergir y
flamear antes de cada procedimiento.

4. LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN DE MATERIALES DE LABORATORIO

4.1. LAVADO Y DESINFECCIÓN DE RECIPIENTES, PINZAS U OTROS
ELEMENTOS.
4.1.1. ELEMENTOS
 Jabón neutro (en pulverizador)
 Cepillos para lavado de instrumental
 Hipoclorito de sodio al 7% (comercial)
 Agua corriente
 Peróxido de hidrogeno al 3%
 Toallas de papel
 Papel aluminio
 Algodón
 Probeta
 Beaker
4.1.2. PROCEDIMIENTO
1. Lave con jabón neutro los recipientes y pinzas a utilizar.
2. Prepare una solución desinfectante con hipoclorito de sodio al 7 % (límpido
comercial) teniendo en cuenta que para 1 litro (1000 ml) de esta solución se
deben mezclar: 980 ml de agua corriente (1000ml) con 20 ml de hipoclorito de
sodio al 7%. Agregue 20 a 30 ml de solución en los recipientes, en caso de
pinzas, tapas, bisturí u otros elementos, sumerja en la solución durante 15
minutos, luego enjuague con agua corriente.
3. NOTA: Si los frascos ha sido autoclavados por contaminación debe aplicarse
peróxido de hidrogeno al 3% por 15 minutos a los recipientes antes de
desinfectar con la solución de hipoclorito al 7%.
4. Secar los recipientes, pinzas y otros elementos con toallas de papel.
NOTA: Las pinzas y bisturí deben empacarse en papel aluminio para ser autoclavadas.
5. PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO
5.1. MEDIO DE GERMINACIÓN Y CRECIMIENTO
La preparación de ambos medios sigue una misma metodología con algunas excepciones
que serán nombradas a medida como avanzan los pasos a seguir. Se recomienda limpiar el
área de trabajo con etanol al 70% antes de iniciar la preparación.
5.1.1. ELEMENTOS
 Balanza de precisión
  Plancha agitadora
 Magnetos para agitación
 Beaker 500, 1000 o 2000 ml (depende el volumen a preparar)
 Medio de cultivo en polvo (P723 o P748)
 Agua destilada
 Frascos tapa azul (u otro recipiente de vidrio para siembra) de 250 o 500 ml (se
recomienda de 250 ml para germinación y 500 ml para crecimiento).
 pHmetro o cinta indicadora de pH.
 Agitador de vidrio
 Ácido clorhídrico o ácido acético diluido al 0.1M
 Hidróxido de sodio diluido al 0.1M
 Gotero
 Agar.
 Embudo de vidrio
 Papel kraft
 Cinta de papel
 Marcador
 Cinta indicadora de autoclave
 Autoclave
5.1.2. PROCEDIMIENTO
1. Pesar el medio de cultivo: teniendo en cuenta las indicaciones del proveedor de
biopruebas LTDA la cantidad de medio de cultivo de germinación en polvo (P723)
necesaria para 1 litro (1000ml) es de 32.74 gr, y para el medio de cultivo de
crecimiento en polvo (P748) necesaria para 1 litro (1000 ml) es de 64.21 gr.
2. Mida el volumen de agua destilada necesaria con una probeta teniendo en cuenta la
cantidad de medio en polvo pesado anteriormente.
NOTA: usar regla de tres para calcular.
Ejemplo: Si va a preparar 500 ml de medio P723, entonces
1000ml = 32.74 gr
500ml = X
Entonces multiplicamos
(500 ml) (32.74 gr) = 16.370
Este valor lo dividimos por 1000 ml
16.370 / 1000 ml = 16.37 gramos
Por tanto, para 500 ml de medio P723 necesitaremos 16.37 gr de polvo y 500 ml de
agua destilada.
3. Agregue el polvo y el agua destilada en un beaker (tenga en cuenta el volumen de
medio a preparar) y colóquelo sobre en una plancha agitadora y agite.
4. Después de 10 minutos de agitación, mida el pH con una cinta indicadora o pH
metro (Nota: el rango ideal es entre 5.2 y 5.6).
  Si necesita bajar el pH agregue gradualmente gotas de ácido clorhídrico
diluido (0.1M), ácido sulfúrico o ácido acético (vinagre), agite y mida de
nuevo hasta ajustar el pH.
 Si necesita aumentar el pH agregue gradualmente gotas de una solución de
hidróxido de sodio (0.1M) o bicarbonato de sodio, agite y mida de nuevo
hasta ajustar el pH.
5. Pese el agar: teniendo en cuenta que para 1000 ml de medio de cultivo se deben
agregar 12 gr de agar.
6. Agregue el agar al medio de cultivo y agite por 5 minutos.
7. Caliente el medio durante 20 a 25 minutos hasta llegar al punto de ebullición.
8. Retire el medio de cultivo con cuidado y continúe a verter en los recipientes de
vidrio, si son recipientes tapa azul de 250 ml, vierta 40 ml de medio de cultivo
(P723 o P748), si son recipientes tapa azul de 500 ml, vierta 80 ml de medio de
cultivo (P723 o P748), recuerde medir el volumen en probeta. Agite antes y durante
el vertido del medio con un agitador de vidrio, vierta usando embudo de vidrio para
evitar salpicar las paredes del recipiente.
9. Cierre los recipientes con una tapa.
Nota: la tapa del recipiente debe tener una perforación de 0.5 cm de diámetro y
rellenar con una pequeña mota de algodón. La perforación la puede realizar con un
cautín caliente, un tornillo caliente o un taladro.
10. Empaque los recipientes con el medio en papel kraft y rotule.
11. Lleve todos los recipientes a la autoclave y los instrumentos como pinzas que usara
en el procedimiento de siembra. Estos deben autoclavarse a 121 libras, a 120°C por
20 minutos.
NOTA: Los frascos tapa azul de 250 ml se deben disponer en el autoclave de forma
vertical y los frascos tapa azul de 500 ml de forma horizontal.

6. DESINFECCIÓN Y SIEMBRA DE SEMILLAS

6.1. SI ES CAPSULA VERDE O MADURA
6.1.1. ELEMENTOS
 Cámara de flujo laminar
 Frascos con medio de cultivo estéril
 Cápsula de orquídea en buen estado
 Jabón neutro
 Agua corriente
 Etanol al 70%
 Hipoclorito de sodio al 3%
 Beaker
 Probeta
 Mango de bisturí estéril
  Hojas de bisturí N° 23 estériles
 Pinzas metálicas estériles
 Cajas petri estériles
 Mechero
 Erlermeyer de 100 o 200 ml con etanol al 70%
 Espátula metálica estéril
 Papel película
 Cinta de papel
 Marcador
6.1.2. PROCEDIMIENTO
1. Revise que la cápsula no presente contaminación superficial o las hendiduras
presenten aberturas, de estar en ese estado, la capsula debe abrirse y las semillas
extraerse y pasar por el proceso de secado, almacenado y desinfección (ver ).
En caso de que la cápsula este en buenas condiciones continúe con los siguientes pasos:
2. Lave la capsula con jabón neutro y enjuague con agua corriente.
3. En la cámara de flujo laminar, sumerja la capsula dentro de etanol al 70% o una
solución de hipoclorito de sodio al 3 % (para 100 ml, use 20 ml de hipoclorito de
sodio al 3% y 80 ml de agua destilada) durante 15 minutos, flamee la capsula y
déjela enfriar.
4. Disponga de la capsula en una caja petri estéril, con la ayuda de pinzas sostenga la
capsula y haga dos cortes horizontales con un bisturí para abrirla.
Posteriormente continue a la siembra de las semillas en los recipientes con medio de
cultivo:
5. Retire el papel kraft del recipiente con el medio, flamee el cuello y abra, flamee
nuevamente la boca y tapa.
6. Con la ayuda de una espátula metálica estéril, tome una porción de semilla extraída
(aproximadamente 2 gramos de semilla), introduzca dentro del recipiente y disperse.
7. Flamee el cuello del recipiente y tape.
8. Las semillas extraídas que sobren, se depositan en una caja petri para ser llevadas a
secado y posterior almacenamiento.
9. Selle la tapa con papel película, y rotule con nombre de la especie, fecha y nombre
de quien realizo el procedimiento.

6.2. SI LA SIEMBRA ES CON SEMILLAS SECAS-MÉTODO JERINGUILLA

6.2.1. ESTIMULACIÓN DE SEMILLAS
Antes de realizar la siembra con semillas secas, estas se deben estimular dado a que han
estado almacenadas a temperaturas muy bajas.
6.2.1.1. ELEMENTOS
 Cámara de flujo laminar
  Cajas petri
 Semillas secas
 Espátula metálica estéril
 Agua destilada
 Azúcar de mesa
 Beaker
 Agitador de vidrio
 Balanza de precisión
 Probeta
6.2.1.2. PROCEDIMIENTO
1. En cámara de flujo laminar, tome la porción de semillas que usara y deposítela en
una caja petri.
2. Prepare una solución de agua con azúcar al 5 % (aproximadamente 50 ml de agua
destilada con 2 gramos de azúcar de mesa), disuelva hasta que los gránulos de
azúcar desaparezcan.
3. Con un gotero, agregue la solución sobre las semillas, y deje durante 12 horas en la
cámara de flujo laminar.
6.2.2. SIEMBRA EN CÁMARA DE FLUJO LAMINAR
6.2.2.1. ELEMENTOS
 Cámara de flujo laminar
 Semillas estimuladas
 Frascos con medio de cultivo estéril
 Jeringa desechable estéril de 10 o 20 ml
 Gasa cortada en 4cm2
 Cauchos
 Hipoclorito de sodio al 3%
 Agua destilada
 Beaker
 Probeta
 Papel película
 Mechero
6.2.2.2. PROCEDIMIENTO
1. Tome una jeringa desechable estéril de 10 o 20 ml (si no está estéril, desinfecte
antes de usar), retire el embolo, ponga una gasa de 4 cm 2 doblada en la punta de la
jeringa y sujete con un caucho.
2. Deposite aproximadamente 2ml de semillas estimuladas y ponga el embolo.
3. Prepare una solución de hipoclorito de sodio al 3% (para 100 ml, use 20 ml de
hipoclorito de sodio al 3% y 80 ml de agua destilada) absorba aproximadamente 8
ml de solución y agite la jeringa por 15 minutos.
 4. Retire la solución, enjuague 3 veces las semillas absorbiendo agua destilada,
agitando y expulsando.
5. Retire el papel kraft del recipiente con medio que utilizara, flamee el cuello del
recipiente y abra y flamee nuevamente boca y tapa.
6. Flamee la punta de la jeringa con cuidado, e inyecte aproximadamente 2 ml de
solución con semillas dentro del recipiente. Flamee nuevamente la boca y la tapa, y
cierre.
7. Selle con papel película y rotule el recipiente con nombre de especie, fecha y
nombre de quien realizo el procedimiento.

7. TRASPLANTE DE PLANTULAS POR CONTAMINACIÓN O INDUCCIÓN A

CRECIMIENTO
Después de 120 a 150 días las plántulas necesitan de ser trasplantadas a un medio de
crecimiento que les brindara otros suplementos para el enraizamiento y crecimiento de
hojas, por tanto se debe realizar el siguiente procedimiento una vez el medio de crecimiento
(P748) esté dispuesto en frascos de 500 ml y autoclavado.
7.1. ELEMENTOS
 Cámara de flujo laminar
 Recipiente o frasco con plántulas de 120 a 150 días
 Recipiente o frasco con medio de cultivo de crecimiento nuevo
 Cajas petri estériles
 Pinzas metálicas estériles
 Agua destilada
 Hipoclorito de sodio al 3%
 Erlermeyer o beaker con etanol al 70%
 Mecheros
 Papel película
 Cinta de papel
 Marcador
7.1.1. PROCEDIMIENTO
1. En cámara de flujo laminar y con los mecheros encendidos, tome un recipente o
frasco con plántulas y ábralo, flamee el cuello y la tapa.
2. Tome la pinza estéril, sumerja la punta en etanol al 70%, flamee y deje enfriar.
3. Con la pinza, extraiga una pequeña porción de plántulas y deposítelas en una caja
petri estéril.
4. Tome un par de pinzas, sumerja las puntas en etanol al 70%, flamee y deje enfriar,
luego separe las plántulas y retire el material muerto (hojas de color café o amarillo,
raíces, agar) y disponga la plántula en otra caja petri. Repita este procedimiento con
todas las plántulas.
NOTA: Si las plántulas presentan contaminación, estas deben sumergirse en hipoclorito de
sodio al 3% por 10 minutos y lavarse con agua destilada. Este procedimiento debe
realizarse antes de sembrarlas en un nuevo medio.
5. Retire el papel kraft del medio de crecimiento, abra y flamee cuello y tapa.
6. Una vez las plántulas limpias, tome una por una con pinzas e introdúzcalas dejando
espacio entre ellas en el medio.
7. Flamee el cuello y tapa nuevamente, cierre, selle con papel película y rotule.

8. INCUBACIÓN DE CULTIVOS
Los cultivos deben permanecer en una estantería bajo unas condiciones controladas de
temperatura entre 22°C-24°C, fotoperiodo de 24 horas (12 horas luz-12 horas oscuridad)
usando luces LED, estas deben ser colocadas a una distancia de 30 cm sobre los recipientes
con los cultivos. Es importante realizar una revisión periódica de los cultivos para observar
posible aparición de hongos o bacterias, además para limpiar la superficie con un paño y
alcohol etanol al 70%.