Proceso de cría del trichogramma

Para la producción artesanal de Trichogramma, se necesita de una infraestructura mínima de dos

salas: una que será utilizada para la producción del hospedero y otra para la reproducción de las
microavispas. Es necesario también un espacio para la recolección de los huevos y limpieza de los
instrumentos.

El proceso de producción de Trichogramma se realiza en dos fases complementarias: La cría del

hospedero alterno a través del cual se obtienen los huevos que servirán de base para la producción
del Parasitoide y la cría de Trichogramma que sería el producto final de la Unidad de Producción.

Proceso de Cría del Hospedero alterno: Sitotroga cerealella:

Sitotroga Cerealella (Oliver) es un insecto plaga de granos almacenados, el cual se ha reproducido

exitosamente sobre granos de sorgo y maíz. El huevo recién puesto es de color blanco, con el
transcurso del día se va tornando amarillento y luego rojizo. Otros hospederos que pueden ser
utilizados son Ephestia khuniella y Corcyra cephalonica, entre otros.

Procesos básicos para la producción del hospedero:

Se utiliza un hospedero alterno porque criar masivamente la plaga que se desea controlar es más
difícil y costoso. Con esto se busca que pueda ser de fácil producción, económico y lo menos
dañino posible para el entorno. En este caso puede utilizarse la palomilla del maíz, Sitotroga
cerealella.

Proceso de infestación:

Es el proceso por el cual se infesta el grano ya tratado con los huevos de Sitotroga desinfectados.
Los huevos para esta operación deben ser seleccionados teniendo en cuenta que sean frescos y que
provengan de gabinetes limpios y sin problemas de insectos extraños, como gorgojos contaminantes
del grano (Tribolium spp., Sitophyllus orizae, Rhyzoperta dominica, Orizaephillus surinamensis),
chinches (Xyloscorius sp. y Orius insidiosus) y parásitos de la familia Pteromálidaes.

Tratado el huevo se procede a la infestación del grano, en una relación normal de dos gramos de
huevo por kilogramo de grano. Terminada la infestación se dejan las bandejas de manera horizontal
por un mínimo de tres días hasta que los huevos eclosionen y penetren al grano antes de colocarlas
en los rieles de los gabinetes. Colocadas correctamente las bandejas en los gabinetes se cierra
herméticamente con un cobertor de tela de color oscuro preferiblemente azul marino de rayón o
poliéster para evitar la infestación externa. Se rotula con la fecha en que se cierra. Pasados los 30
días se puede iniciar la recolección de las mariposas.

Obtención de huevos de los gabinetes de cría:

En condiciones normales de laboratorio se debe hacer el primer cambio de los frascos 30 días
después de la infestación. Los cambios de frascos deben hacerse a diario, así como los cernidos,
hasta que la mayoría de las palomillas estén muertas. El huevo se obtiene mediante el cernido de las
palomillas que se encuentran en los frascos dispuestos debajo de los gabinetes de cría.

El cernido consiste en enroscar a los frascos un cernidor. Con ayuda de un extractor, una bandeja
plástica y un pincel se desprenden los huevos del fondo del frasco. Este proceso sirve para eliminar
la mayor cantidad de impurezas posibles de los huevos.

Tratamiento de los huevos: Los huevos, después del proceso de limpieza, son colocados en una
tela fina y posteriormente se desinfectan sumergiéndolos en acetona reactiva entre 15 y 20
segundos.

Proceso de Cría de Trichogramma spp:

Para la cría de Trichogramma se utilizan los huevos colectados del hospedero alterno seleccionado.
Los Trichogrammas que servirán de base para la cría son obtenidos a partir de huevos parasitados
de lepidópteros, capturados en el campo y colocados en frascos de cristal transparente a los cuales
se les dará seguimiento diario.

Proceso de parasitación:

Esta parte se realiza en un área dentro de la Sala de Cría. Se colocan frascos de un galón con boca
ancha con Trichogrammas adultos donde se introducen tirillas de huevos recién depositados,
limpios y desinfectados del hospedero. Estos huevos son dispersados en una cartulina de 20
pulgadas2. Para la adhesión de los huevos a la cartulina se utiliza goma arábica disuelta, o agua de
azúcar diluida (aunque puede atraer hormigas y otros insectos). La cantidad de huevos aproximados
por pulgadas cuadradas es de 2,500 a 3,000 y debe introducirse la tirilla al frasco de parasitación
con huevos después del primer día de la emergencia, esto significa el día después que los
Trichogrammas salen del huevo. La proporción más utilizada en el Laboratorio es una tirilla madre
por cada tres tirillas de parasitación.
Una vez las tirillas de infestación están parasitadas por la microavispa, éstas siguen tres vías
dependiendo de las necesidades: O bien se destinan a continuar la producción siendo tirillas madres;
se almacenan en una nevera para ser utilizadas en el momento adecuado o bien se destinan a ser
liberadas en el campo.

Liberación de los Trichogramma:

Para la liberación de los Trichogramma en el campo, las tirillas son cortadas en secciones de una
pulgada cuadrada cuando tienen aproximadamente cinco días de parasitadas. Esto garantiza que
eclosionen en el campo, se apareen y busquen sus huéspedes. Estas secciones de tiras son colocadas
en sobres pequeños que son hechos de papel manila, muy resistente a la humedad. En el interior del
sobre se coloca una pulgada cuadrada parasitada con Trichogramma. Estos sobres contienen
perforaciones que permiten a las microavispas salir al momento de la eclosión donde buscarán sus
hospederos.
 Proceso de cría del hongo bouveria bassiana

Preparación del medio líquido:

Los medios líquidos utilizados para la producción masiva, varían de acuerdo a la especie de hongo
entomopatógeno que se va a producir, el más común es el PD, PG (Papa Dextrosa, Papa Glucosa),
CA (Caldo de Arroz) para Pochonia. Estos medios pueden prepararse en frascos erlenmeyer o
matraces a razón de 700 ml por frasco de 1000 ml, se cubren con papel aluminio y se esteriliza a
121 ºC y 15 lbs (1 atm) de presión por 20 minutos.

Otra forma de preparar el medio líquido es en biofermentadores de 20 litros, se preparan 15 litros de

medio, se esterilizan en una autoclave por una hora a 121 ºC y 15 lbs de presión. La esterilización se
realiza con los filtros, cerrando las mangueras con una pinza antes de los filtros para evitar que se
mojen al momento de la esterilización.

Inoculación e incubación del medio líquido:

Frascos Erlenmeyer

Una vez fríos los medios líquidos, se llevan a la cámara de flujo laminar y se le agrega
aproximadamente 0.1 g de cloranfenicol a granel. Se selecciona la mejor placa previamente
analizada, es decir libre de contaminación, buena esporulación y morfología microscópica típica. Se
agrega 10 ml de agua destilada estéril más Tween y con la ayuda de una espátula o una cucharilla
flameada y enfriada con alcohol, se raspa suavemente la superficie de la placa, para soltar las
esporas o conidias, se agrega 10 ml de agua destilada estéril más Tween, con una pipeta estéril se
toma 5 ml de la solución y se agrega al medio líquido frío. También otra forma de inocular el medio
líquido es cortar el agar y agregar un cuarto de placa por frasco de medio líquido. Terminada la
siembra se cierran con su respectiva tapa estéril de papel aluminio, se cubre finalmente con cinta
parafilm y se llevan a un agitador orbital a 160 rpm por 3 días a la temperatura de 24 a 28 ºC
(controlar la temperatura con estufas o termoventiladores).
Preparación del sustrato

Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae: 800 g de arroz y 200 ml de agua.

Una vez llenadas las bolsas de polipropileno, se engrapan los extremos de la bolsa previo doblez de
la bolsa y se esteriliza en autoclave: 121 ªC, 15 Lb de presión (1 Atmosfera), por 30 minutos, El
tiempo de esterilización esta en relación conforme aumente la cantidad de bolsas (hasta 45 min con
el autoclave convencional). Precaución: Esperar que la presión baje a cero “ 0” antes de abrir el
autoclave. En un ambiente previamente esterilizado con luz UV por 1 hora, colocar las bolsas sobre
una mesa desinfectada, resistente al calor y con ayuda de guantes de cuero resistentes al calor, se
procede a descompactar el arroz, para que no se formen grumos. Las bolsas se dejan enfriar y antes
de continuar con el paso siguiente de la inoculación del sustrato se debe esterilizar, nuevamente, el
ambiente donde se dejaron enfriar las bolsas. (Emplear lámparas de luz ultravioleta durante 1 hora,
desconectar, e ingresar a partir de 30 minutos aproximadamente).

Inoculación del sustrato con el medio líquido:

De frascos Erlenmeyer

Una vez frías, las bolsas con el arroz se llevan a la cámara de flujo laminar, se desinfecta el borde
de cada bolsa con un algodón embebido en alcohol, se abre cuidadosamente la bolsa y se inocula
con 30 ml del caldo líquido agitado. Con un frasco de medio preparado se iniculan 20 bolsas. Se
cierra nuevamente la bolsa y se agita para homogenizar el inòculo con el sustrato.

Incubación del sustrato:

Las bolsas inoculadas son llevadas a la sala de germinación a la temperatura de 24 a 28 ºC,

incubándose en oscuridad los primeros 3 días para favorecer el desarrollo del micelio. Al finalizar el
tercer día encender la luz de los cuartos de incubación. Al cuarto día de incubación, las bolsas son
quebradas suavemente para favorecer la oxigenación de todo el sustrato y son dejadas 7 a 21 días
hasta completar la esporulación. En esta etapa se revisan las bolsas diariamente, eliminando las que
se presenten poco homogéneas, así como las bolsas con presencia de contaminantes.
Secado del producto final:

Con la finalidad de secar el producto, se abren las bolsas por el centro, con lo que se consigue bajar
la humedad a 30 – a 35%. Otra opción más favorable para disminuir la humedad hasta 15%, es
vaciar el sustrato a plásticos de polietileno o bandejas desinfectadas con alcohol, encendiendo el
aire acondicionado o utilizando deshumedecedores.

Extracción de conidias:

Consiste en separar del arroz las conidias del hongo y recolectarlas para su posterior formulación.
La cosecha extracción de conidias puede realizarse en equipos mecánicos como el Mycoharvester o
en forma manual utilizando tamices mas frotación, en que se cosechan pequeñas cantidades con
fines de ensayos.

La conidias cosechadas son afectadas por la luz, humedad y altas temperaturas, por lo que una vez
cosechado el hongo debe conservarse en refrigeración a 4 ºC, para mantener su viabilidad.

Cosecha del hongo entomopatógeno seco.

El producto final es cosechado en bolsas, pesado a 800 g y sellado. El rendimiento de esporas por
kilo está en función a la especie producida, pudiendo llegar a obtenerse concentraciones de 4x1013
a 1x1014con/k (B. bassiana) Para la cosecha utilizar vestuario de bioseguridad, (careta de cara
completa, mameluco cuerpo completo descartable o lavable).

Proceso de producción de bacillus thuringiensis

Como la producción in vitro del virus por parte de las células de insecto hospedadoras es un
proceso lítico, se ha ideado un sistema de cultivo en dos etapas: Una primera de cultivo celular
(A) en biorreactores diseñados apropiadamente y con el objetivo de generar suficiente cantidad de
células hospedadoras; y una etapa posterior (B) de infección de las células de S. exigua con el
morfotipo desnudo del SeMNPV. Para conseguir una producción continua del baculovirus, el
biorreactor de la etapa (A) surtiría de células hospedadoras a varios biorreactores de la etapa (B).
Los primeros pasos, antes de infectar las células en el reactor de infección, serán la creación de un
banco celular que se utilizará para alimentar los reactores de amplificación celular y de
amplificación vírica. Asimismo, se creará un stock viral con la forma desnuda del baculovirus
SeMNPV amplificando la hemolinfa extraída a larvas de S. exigua infectadas per os para infectar
el reactor de infección.
Una vez alimentado el reactor de infección, entre 8 y 10 días después del inicio de la infección
(dpi), las células infectadas y con OBs aún en su interior se cosechan y se someten a un proceso
de lisis celular mediante ultrasonidos. Los OBs liberados se pueden cosechar, por ejemplo,
concentrándolos mediante centrifugación. Posteriormente, se evaluará su actividad biológica y se
formulará el bioplaguicida.
El medio de cultivo proveniente de los reactores de amplificación y del cosechado de células
infectadas debe ser esterilizado para poder desecharlo. Para ello, se llevará a cabo una etapa de
inactivación mediante, por ejemplo, la adición de lejía o con luz UV.
Para un mayor aprovechamiento del medio de cultivo este puede reutilizarse en los procesos de
amplificación celular y producción vírica. Para ello, el medio de cultivo proveniente del reactor de
amplificación celular se filtra a 0,22 µm. Para un mayor aprovechamiento del stock vírico las
MOIs deberían ser lo más bajas posibles, ser determinadas de antemano y siempre con el
compromiso de mantener una alta calidad del baculovirus producido.