.

ó
Índice.
Microscopía óptica. ............................................................................................................................3
Fundamentos de la formación de imágenes. .................................................................................3
Ecuación de Rayleigh ......................................................................................................................5
Iluminación Köhler .........................................................................................................................5
Diámetros del campo de visión ......................................................................................................6
Microscopía electrónica de barrido (SEM: Scanning Electrón Microscopy). ......................................8
¿Qué es la microscopía electrónica de barrido (SEM)? ..................................................................8
Principios fundamentales de la microscopía electrónica de barrido (SEM) ....................................9
Instrumentación de microscopía electrónica de barrido (SEM): ¿cómo funciona? ......................10
Aplicaciones .................................................................................................................................11
¿Fortalezas y limitaciones de la microscopía electrónica de barrido (SEM)? ...............................12
Imágenes SEM representativas de minerales asbestiformes del USGS Denver Microbeam
Laboratory ....................................................................................................................................13
Microscopía electrónica de transmisión...........................................................................................14
¿Qué es un microscopio electrónico de transmisión? ..................................................................14
¿Cómo funcionan los TEM? ..........................................................................................................14
¿Cuáles son las diferencias entre un TEM y un microscopio de luz? ............................................15
¿Cómo se preparan las muestras de TEM? ..................................................................................16
Bibliografía .......................................................................................................................................17
Microscopía óptica.
Fundamentos de la formación de imágenes.

En el microscopio óptico, cuando la luz de la lámpara del microscopio pasa a través

del condensador y luego a través de la muestra (suponiendo que la muestra es una
muestra que absorbe luz), parte de la luz pasa tanto alrededor como a través de la
muestra sin ser perturbada en su camino. Tal luz se llama luz directa o luz no
desviada. La luz de fondo (a menudo llamada envolvente) que pasa alrededor de la
muestra también es luz no desviada. Parte de la luz que pasa a través de la muestra
se desvía cuando se encuentra con partes de la muestra. Tal luz desviada (como
aprenderá más adelante, llamada luz difractada) se representa como la mitad de la
longitud de onda o 180° fuera de sintonía (más comúnmente, fuera de fase) con la
luz directa que ha pasado sin desviarse. El desfase de media longitud de onda,
causado por la propia muestra, permite que esta luz provoque una interferencia
destructiva con la luz directa cuando ambas llegan al plano de imagen intermedio
ubicado en el diafragma fijo del ocular. La lente aumenta aún más esta imagen que
finalmente se proyecta en la retina, la película de una cámara, o la superficie de un
sensor de luz que envía datos a un chip de computadora. Lo que ha sucedido es
que la luz directa o no desviada es proyectada por el objetivo y distribuida
uniformemente por todo el plano de la imagen en el diafragma del ocular. La luz
difractada por la muestra se enfoca en varios lugares localizados en el mismo plano
de la imagen, donde la luz difractada provoca una interferencia destructiva y reduce
la intensidad, lo que da como resultado áreas más o menos oscuras. Estos patrones
de luz y oscuridad son lo que reconocemos como una imagen del espécimen.
Debido a que nuestros ojos son sensibles a las variaciones de brillo, la imagen se
convierte en una reconstitución más o menos fiel del espécimen original.

Espectros de difracción vistos en el plano focal posterior del objetivo a través de un

telescopio de enfoque al obtener imágenes de una rejilla de líneas poco espaciadas.
(a) Imagen del diafragma de apertura del condensador con una etapa vacía. (b) Dos
espectros de difracción de un objetivo de 10x cuando se coloca una rejilla de líneas
finamente regladas en la platina del microscopio. ( c ) Espectros de difracción de la
rejilla de líneas de un objetivo de 40x. ( d ) Espectros de difracción de la rejilla de
líneas de un objetivo de 60x.
En el plano focal trasero del objetivo, el azul Las longitudes de onda de cada rendija
interfieren constructivamente para producir el área azul de la imagen difractada de
cada espectro u orden; de manera similar para las áreas roja y verde (Figura (a)).
Cuando las longitudes de onda difractadas están desfasadas 1/2 onda para cada
uno de estos colores, las ondas interfieren destructivamente. De ahí las áreas
oscuras entre los espectros u órdenes. En la posición del orden cero, todas las
longitudes de onda de cada rendija se suman constructivamente. Esto produce la
luz blanca brillante que ve como el orden cero en el centro del plano focal trasero
del objetivo.

(a) Espectros visibles a través de un microscopio de enfoque en el plano focal

posterior de un objetivo de 40x. (b) Diagrama esquemático de la luz tanto difractada
como no desviada por una rejilla de líneas en la platina del microscopio.

Patrones de difracción generados por estrechos y anchos.

(a) Imagen conoscópica de la cuadrícula vista en el plano focal posterior del objetivo
cuando se enfoca en el patrón de hendidura ancha en (b). (b) Imagen ortoscópica
de la cuadrícula con mayor ancho de hendidura en la parte superior y menor ancho
en la parte inferior. ( c ) Imagen conoscópica de la parte de ancho estrecho de la
cuadrícula (parte inferior de (b)). (d) y (f) Imágenes ortoscópicas de líneas de
cuadrícula dispuestas en un patrón cuadrado (d) y un patrón hexagonal (f). (e) y (g)
Imágenes conoscópicas de patrones en (d) y (f), respectivamente.
 Ecuación de Rayleigh a menudo citada para su resolución:
d = 1.22 (l / 2NA)
Donde d es el espacio entre dos partículas adyacentes (todavía permitiendo que las
partículas se perciban como separadas), l es la longitud de onda de la iluminación
y NA es la apertura numérica del objetivo.
Cuanto mayor sea el número de órdenes difractados más admitidos en el objetivo,
más pequeños son los detalles de la muestra que se pueden separar claramente
(resolver). De ahí el valor de usar una apertura numérica alta para tales
especímenes. Asimismo, cuanto más corta sea la longitud de onda de la luz visible
utilizada, mejor será la resolución. Estas ideas explican por qué las lentes
apocromáticas de alta apertura numérica pueden separar detalles extremadamente
pequeños en la luz azul.

Iluminación Köhler
La iluminación adecuada de la muestra es crucial para logrando imágenes de alta
calidad en microscopía y crítica fotomicrografía. Un procedimiento avanzado para
La iluminación del microscopio fue introducido por primera vez en 1893 por August
Köhler, de la corporación Carl Zeiss, como método de proporcionar una iluminación
óptima de la muestra. Todos fabricantes de microscopios de laboratorio modernos
recomendamos esta técnica porque produce una iluminación de la muestra que es
uniformemente brillante y libre de deslumbramiento, lo que permite al usuario
aprovechar todo el potencial del microscopio.
La mayoría de los microscopios modernos están diseñados para que la lente
colectora y otros componentes ópticos integrados en la base proyecten una imagen
ampliada y enfocada del filamento de la lámpara en el plano del diafragma de
apertura. de un condensador de subetapa colocado correctamente. Cerrar o abrir el
diafragma del condensador controla el ángulo de los rayos de luz que salen del
condensador y llegan a la muestra desde todos los acimuts. Debido a que la fuente
de luz no está enfocada al nivel del espécimen, la iluminación al nivel del espécimen
es esencialmente amplia y sin grano, y no sufre deterioro por el polvo y
imperfecciones en las superficies de vidrio del condensador. El tamaño de apertura
del diafragma de apertura del condensador, junto con la apertura del objetivo,
determina la apertura numérica realizada del sistema del microscopio.
A medida que se abre el diafragma del condensador, aumenta la apertura numérica
de trabajo del microscopio, lo que da como resultado una mayor transmisión de luz
y poder de resolución. Los rayos de luz paralelos que atraviesan e iluminan la
muestra se enfocan en el plano focal posterior del objetivo, donde la imagen del
diafragma de apertura variable del condensador y la fuente de luz se observan
enfocadas simultáneamente.
Muchos microscopios están equipados con un condensador de subetapa
especializado que tiene una lente superior abatible, que se puede quitar de la
trayectoria óptica para usarla con lentes inferiores.

Diámetros del campo de visión (FN 22)

(Ocular SWF 10x)
Magnificación de Diámetro
Objetivo
1/2x 44.0
1x 22.0
2x 11.0
4x 5.5
10x 2.2
20x 1.1
40x 0.55
50x 0.44
60x 0.37
100x 0.22
150x 0.15
250x 0 0.088
Fuente: Nikon.
Los tres tipos de objetivos sufren de pronunciada curvatura de campo y proyecta
imágenes que son curvas en lugar de planas. Para superar esta condición inherente,
los diseñadores de lentes han producido objetivos corregidos de campo plano que
producen imágenes planas. Estos lentes se denominan acromáticos planos,
fluoritas planas o apocromáticos planos, y aunque este grado de corrección es
costoso, estos objetivos ahora se utilizan de forma rutinaria debido a su valor en
fotomicrografía.

Niveles de corrección óptica por aberración en objetivos comerciales.

(a) Los objetivos acromáticos, el nivel más bajo de corrección, contienen dos
dobletes y una sola lente frontal;
(b) Los objetivos de fluoritas o semiapocromáticos, un nivel de corrección medio,
contienen tres dobletes, una lente de menisco y una lente frontal única;
(c) Los objetivos apocromáticos, el nivel más alto de corrección, contienen un
triplete, dos dobletes, una lente de menisco y una sola lente frontal hemisférica.
Microscopía electrónica de barrido (SEM:
Scanning Electrón Microscopy).

¿Qué es la microscopía electrónica de barrido (SEM)?

El microscopio electrónico de barrido (SEM) utiliza un has enfocado de electrones

de alta energía para generar una variedad de señales en la superficie de las
muestras sólidas. Las señales que se derivan de las interacciones muestra-electrón
información sobre la muestra, incluida la morfología externa (textura), la
composición química y la estructura cristalina y la orientación de los materiales que
componen la muestra. En la mayoría de las aplicaciones, los datos se recopilan
sobre un área seleccionada de la superficie de la muestra y se genera una imagen
bidimensional que muestra variaciones espaciales en estas propiedades. Las áreas
que van desde aproximadamente 1 cm a 5 micras de ancho se pueden visualizar
en un modo de escaneo usando técnicas SEM convencionales (ampliación que va
desde 20X hasta aproximadamente 30,000X, resolución espacial de 50 a 100 nm).
El SEM también es capaz de realizar análisis de ubicaciones de puntos
seleccionados en la muestra; este enfoque es especialmente útil en la
determinación cualitativa o semicuantitativa de composiciones químicas (usando
EDS), estructura cristalina y orientaciones de cristal (usando EBSD ). El diseño y la
función del SEM son muy similares a los del EPMA y existe una considerable
superposición de capacidades entre los dos instrumentos.

Un instrumento SEM típico, que muestra la

columna de electrones, la cámara de
muestra, el detector EDS, la consola
electrónica y los monitores de visualización.
Principios fundamentales de la microscopía electrónica de
barrido (SEM)

Los electrones acelerados en un SEM transportan cantidades significativas de

energía cinética, y esta energía se disipa como una variedad de señales producidas
por las interacciones de la muestra de electrones cuando los electrones incidentes
se desaceleran en la muestra sólida. Estas señales incluyen electrones secundarios
(que producen imágenes SEM), electrones retro dispersados ( BSE ), electrones
retro dispersados difractados ( EBSD que se usan para determinar estructuras
cristalinas y orientaciones de minerales), fotones ( rayos X característicos que se
usan para análisis elemental y continuo). rayos X), luz visible ( cátodo luminiscencia-
-CL), Y calor. Los electrones secundarios y los electrones retro dispersados se
utilizan comúnmente para obtener imágenes de muestras: los electrones
secundarios son más valiosos para mostrar la morfología y la topografía de las
muestras y los electrones retro dispersados son más valiosos para ilustrar los
contrastes en la composición de las muestras multifásicas (es decir, para la
discriminación de fase rápida). generación de rayos Xse produce por colisiones
inelásticas de los electrones incidentes con electrones en orbitales discretos (capas)
de átomos en la muestra. A medida que los electrones excitados regresan a estados
de menor energía, producen rayos X que tienen una longitud de onda fija (que está
relacionada con la diferencia en los niveles de energía de los electrones en
diferentes capas para un elemento dado). Por lo tanto, se producen rayos X
característicos para cada elemento en un mineral que es "excitado" por el haz de
electrones. El análisis SEM se considera "no destructivo"; es decir, los rayos X
generados por interacciones de electrones no conducen a la pérdida de volumen de
la muestra, por lo que es posible analizar los mismos materiales repetidamente.
Instrumentación de microscopía electrónica de barrido (SEM):
¿cómo funciona?

Los componentes esenciales de todos los SEM incluyen lo siguiente:

▪ Fuente de electrones ("Pistola")
▪ Lentes de electrones
▪ Etapa de muestra
▪ Detectores para todas las señales de interés
▪ Dispositivos de visualización/salida de datos
▪ Requisitos de infraestructura:
▪ Fuente de alimentación
▪ Sistema de vacío
▪ Sistema de refrigeración
▪ Suelo sin vibraciones
▪ Sala libre de campos magnéticos y eléctricos ambientales.
Los SEM siempre tienen al menos un detector (generalmente un detector de
electrones secundarios) y la mayoría tiene detectores adicionales. Las capacidades
específicas de un instrumento en particular dependen críticamente de los detectores
que acomode.
Aplicaciones

El SEM se usa habitualmente para generar imágenes de alta resolución de formas

de objetos (SEI) y para mostrar variaciones espaciales en las composiciones
químicas:
1) adquisición de mapas elementales o análisis químicos puntuales usando EDS.
2) discriminación de fases basada en el número atómico medio ( comúnmente
relacionado con la densidad relativa) usando BSE.
3) mapas de composición basados en diferencias en los "activadores" de elementos
traza (típicamente metales de transición y elementos de tierras raras) usando CL.
El SEM también se usa ampliamente para identificar fases en función del análisis
químico cualitativo y/o la estructura cristalina. La medición precisa de características
y objetos muy pequeños de hasta 50 nm de tamaño también se logra mediante el
SEM. Imágenes de electrones retro dispersados ( BSE) se puede utilizar para la
discriminación rápida de fases en muestras multifásicas. Los SEM equipados con
detectores de electrones retro dispersados difractados ( EBSD ) se pueden utilizar
para examinar micro telas y orientación cristalográfica en muchos materiales
¿Fortalezas y limitaciones de la microscopía electrónica de
barrido (SEM)?
Fortalezas
Podría decirse que no existe otro instrumento con la amplitud de aplicaciones en el
estudio de materiales sólidos que se compare con el SEM. El SEM es crítico en
todos los campos que requieren caracterización de materiales sólidos. Si bien esta
contribución se refiere principalmente a las aplicaciones geológicas, es importante
señalar que estas aplicaciones son un subconjunto muy pequeño de las
aplicaciones científicas e industriales que existen para esta instrumentación. La
mayoría de los SEM son comparativamente fáciles de operar, con interfaces
"intuitivas" fáciles de usar. Muchas aplicaciones requieren una preparación mínima
de la muestra. Para muchas aplicaciones, la adquisición de datos es rápida (menos
de 5 minutos/imagen para análisis SEI, BSE, spot EDS). Los SEM modernos
generan datos en formatos digitales, que son altamente portátiles.

Limitaciones
Las muestras deben ser sólidas y deben caber en la cámara del microscopio. El
tamaño máximo en dimensiones horizontales suele ser del orden de 10 cm, las
dimensiones verticales son generalmente mucho más limitadas y rara vez superan
los 40 mm. Para la mayoría de los instrumentos, las muestras deben ser estables
en el vacío del orden de 10 -5 - 10 -6 torr. Las muestras con probabilidad de
desgasificación a bajas presiones (rocas saturadas con hidrocarburos, muestras
"húmedas" como carbón, materiales orgánicos o arcillas expansivas, y muestras
con probabilidad de decrepitación a baja presión) no son adecuadas para el examen
en SEM convencionales. Sin embargo, también existen SEM de "bajo vacío" y
"ambientales", y muchos de estos tipos de muestras se pueden examinar con éxito
en estos instrumentos especializados. detectores EDSen SEM no pueden detectar
elementos muy ligeros (H, He y Li), y muchos instrumentos no pueden detectar
elementos con números atómicos inferiores a 11 (Na). La mayoría de los SEM
utilizan un detector de rayos X de estado sólido ( EDS ), y aunque estos detectores
son muy rápidos y fáciles de utilizar, tienen una resolución de energía y una
sensibilidad relativamente bajas a los elementos presentes en cantidades bajas en
comparación con los detectores de rayos X dispersivos de longitud de onda ( WDS
) en la mayoría de los microanalizadores de sonda electrónica ( EPMA ). Se debe
aplicar un revestimiento eléctricamente conductor a las muestras eléctricamente
aislantes para su estudio en SEM convencionales, a menos que el instrumento sea
capaz de funcionar en un modo de bajo vacío.
Imágenes SEM representativas de minerales asbestiformes del
USGS Denver Microbeam Laboratory
Microscopía electrónica de transmisión.

¿Qué es un microscopio electrónico de transmisión?

Los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) son microscopios que utilizan

un haz de partículas de electrones para visualizar muestras y generar una imagen
muy ampliada. Los TEM pueden ampliar objetos hasta 2 millones de veces. Para
tener una mejor idea de cuán pequeño es eso, piense en cuán pequeña es una
celda. No es de extrañar que los TEM se hayan vuelto tan valiosos en los campos
biológico y médico.

¿Cómo funcionan los TEM?

Los TEM emplean un haz de electrones de alto voltaje para crear una imagen. Un
cañón de electrones en la parte superior de un TEM emite electrones que viajan a
través del tubo de vacío del microscopio. En lugar de tener una lente de vidrio que
enfoca la luz (como en el caso de los microscopios ópticos), el TEM emplea una
lente electromagnética que enfoca los electrones en un haz muy fino. Luego, este
haz atraviesa la muestra, que es muy delgada, y los electrones se dispersan o
golpean una pantalla fluorescente en la parte inferior del microscopio. En la pantalla
aparece una imagen del espécimen con sus distintas partes mostradas en diferentes
tonos según su densidad. Esta imagen puede luego estudiarse directamente dentro
del TEM o fotografiarse. La Figura 1 muestra un diagrama de un TEM y sus partes
básicas.
¿Cuáles son las diferencias entre un TEM y un microscopio de
luz?

Aunque los TEM y los microscopios ópticos funcionan con los mismos principios
básicos, existen varias diferencias entre los dos. La principal diferencia es que los
TEM usan electrones en lugar de luz para ampliar las imágenes. El poder del
microscopio óptico está limitado por la longitud de onda de la luz y puede ampliar
algo hasta 2000 veces. Los microscopios electrónicos, por otro lado, pueden
producir imágenes mucho más ampliadas porque el haz de electrones tiene una
longitud de onda más pequeña que crea imágenes de mayor resolución. (La
resolución es el grado de nitidez de una imagen). La figura 2 compara la ampliación
de un microscopio óptico con la de un TEM.

Fig. 2 [izquierda] Tallo de algodón; El área en el círculo es el tejido del floema.

Microscopio de luz x250. Foto de K. Esaú. [derecha] Imagen ampliada de tejido de
floema de algodón que muestra un elemento tamiz (celda superior) y una celda
acompañante (celda inferior), TEM x8,000. Foto de J. Thorsch.
¿Cómo se preparan las muestras de TEM?

Las muestras deben ser muy delgadas para que los electrones puedan atravesar el
tejido. Esto se puede hacer cortando rebanadas muy finas del tejido de una muestra
con un ultramicrótomo. Primero se debe poner el tejido en una solución química
para preservar la estructura celular. El tejido también debe estar completamente
deshidratado (toda el agua eliminada)
Bibliografía:
1 National High Magnetic Field Laboratory, The Florida State University, 1800 E.
Paul Dirac Dr., Tallahassee, Florida 32306,
davidson@magnet.fsu.edu, http://microscopy.fsu.edu
2 Olympus America, Inc., 2 Corporate Center Dr., Melville, New York 11747,
abramm@olympus.com, http://www.olympus.com
Goldstein, J. (2003) Microscopía electrónica de barrido y microanálisis de rayos X.
Kluwer Adacemic/Plenum Pulbishers, 689 p.
Reimer, L. (1998) Microscopía electrónica de barrido: física de la formación de
imágenes y microanálisis. Springer, 527 págs.
Egerton, RF (2005) Principios físicos de la microscopía electrónica: una
introducción a TEM, SEM y AEM. Springer, 202.
Clarke, AR (2002) Técnicas de microscopía para ciencia de materiales. CRC
Press (recurso electrónico)5
Centro Cheadle para la Biodiversidad y Restauración Ecológica • Instituto de
Investigación de la Tierra The Regents of the University of California, Todos los
derechos reservados. UC Santa Bárbara, Santa Bárbara CA 93106 •