Técnicas en Biología

Celular

http://www.uv.mx/edu-cont/files/2013/03/7149016-celulas-humanas.jpg
ANDREA FERNANDA MONROY LICHT
alicht@uninorte.edu.co
¿Qué es la microscopia?
Observación de objetos muy pequeños bajo grandes aumentos
 ¿Qué es la microscopia?
Observación de objetos muy pequeños bajo grandes aumentos
Cell veg
1mm= 1000 𝝻m ≈100-200 𝝻m

Cell muscle
≈100 𝝻m

≈7 𝝻m

≈150 𝝻m
1-2 𝝻m

≈24 𝝻m

Microscopía Electrónica
Microscopía óptica
Ojo desnudo
Instrumentos que producen una
0.1-0.2 mm
imagen aumentada de un objeto. Límite de resolución
del ojo humano
 Clases de microscopios
MICROSCOPIO ÓPTICO

El tipo de microscopio más

utilizado, se sirve de la luz
visible para crear una
imagen aumentada del
objeto.
780nm 380nm
 AUMENTO
Conceptos importantes
Hace referencia a que la imagen sea más grande, es decir que ocupe más
superficie retiniana.

El poder de aumento de una lente está determinado por el grado de

curvatura de su superficie y la distancia focal.
En las lentes convexas a mayor distancia focal, mayor será el aumento.
El primer juego de lentes, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo y el
segundo juego, cercano al ojo del observador se denomina ocular.
Cada sistema de lentes produce un aumento enunciado con la letra x, así que 10x
significa que la imagen está aumentada 10 veces.

AUMENTO TOTAL: Aumento del objetivo x Aumento del ocular

Células epiteliales Magnificación contra Resolución ???

0.1 mm -
Conceptos importantes
RESOLUCIÓN (d)
Es la capacidad que tiene un sistema óptico de aislar dos puntos que
se encuentran muy próximos entre sí, de manera que se puedan ver
individualizados uno del otro.
La riqueza - CALIDAD de detalles que puede ser observada al
microscopio.

0,2 µm 200nm EL LÍMITE DE RESOLUCIÓNà (LR) es la distancia mínima

0,25 µm àLUZ BLANCA que debe existir entre dos puntos para que puedan ser
100 -170 nm àLUZ UV discriminados como tales
Afectado por la λ
LRàestá en proporción inversa con la longitud de
onda: a menor longitud de onda, mayor poder de resolución.
. A diferencia de un fotón de luz que tiene una longitud de onda constante, la longitud
de onda de un electrón varía con la Velocidad a la que la partícula viaja.

d= 527 nm para la luz

blanca

TEM
0.05-10 nm SEM
EL LÍMITE DE RESOLUCIÓNà (LR) Está en Conceptos importantes
proporción inversa con la longitud de
onda: a menor longitud de onda, mayor poder de resolución.
. A diferencia de un fotón de luz que tiene una longitud de onda constante, la longitud de onda de un electrón varía
con la Velocidad a la que la partícula viaja.

d= 527 nm para la luz

blanca

AN = n (índice refractivo)* sen a

¿Cómo se puede incrementar
la resolución? Disminuyendo 𝛌

Entre menor es 𝛌 menor es el

límite de Resolución y mayor el
poder de Resolución.

Para reducir 𝛌 se puede utiizar

filtros azules en la salida de la
fuente de luz
Factores que determinan el poder de Conceptos importantes
resolución
La lente del objetivo enfoca estos rayos de luz
Un tercer sistema de lentes localizado en la parte frontal
para formar una imagen real y magnificada
del ojo utiliza la imagen virtual producida por la lente
del objeto dentro de la columna del
ocular como objetivo para producir una imagen real en
microscopio
la retina
la lente ocular, emplea la La luz incidente
imagen formada por la lente proveniente del objeto
del objetivo como objeto para es desviada de su
formar una imagen virtual y trayectoria inicial y
aumentada mientras más
pequeños sea el
objeto, mayor será
la desviación.

Dos conjuntos de rayos

lumínicos que entran a la lente
del objetivo: los que ya alteró
el espécimen y los que no
modificó

Especimen que
es atravesado
por un haz de
rayos luminosos

haz de rayos luminosos (Karp, 2011)

 Conceptos importantes
Luz

Imagen final
Aumentada
Invertida
Virtualà Por que no se puede almacenar, sino simplemente se observa a través del ocular, se dice que es virtual.

(Rodríguez, 2017). Recuperado de: https://josefelixrodriguezantonweb.com/2017/10/29/el-microscopio-optico-la-ventana-de-la-histologia/

¿Cómo se puede incrementar Conceptos importantes
la resolución? Aumentando la AN
Las lentes del objetivo deben recolectar como sea posible
la mayor cantidad de rayos desviados para formar una
imagen nítida; a más rayos capturados, mayor resolución.

Al formarse el cono de
luz proveniente del
objeto se determina un
ángulo, también
llamado de apertura,
donde α representa la
mitad del mismo

objeto que es
atravesado por un haz
de rayos luminosos A partir de las observaciones precedentes, nace la
definición de apertura numérica (AN)à
capacidad del microscopio de agrupar las
refracciones de luz producidas por los detalles
finos de un objeto. Cifra a considerar para
determinar el rendimiento de una lente objetivo:
haz de rayos luminosos
AN = n (índice refractivo)* sen a

La calidad de un objetivo es tanto mayor
cuanto más elevada es su apertura
numéricaà Medida de sus calidades para
reunir la luz.
Donde a = la mitad del ángulo de apertura del
objetivo.
n = el índice de refracción del medio que se
encuentra entre el objeto y el objetivo.
(Para el aire n = 1 y para el vidrio o aceite n = 1.51)
(Karp, 2011)
¿Cómo se puede incrementar Conceptos importantes
la resolución? Utilizando condensador
Otra manera de incrementar la resolución es
creando, del lado de la fuente luminosa, un
cono amplio con un ángulo mayor. Para ello
se emplea otro juego de lentes denominado
condensador el cual posee la misma
apertura numérica que el objetivo.

formará un cono luminoso frente al objeto

El objeto es iluminado con un rayo

de luz

Se colocó otra lente que

recoge y condensa la luz
antes que ilumine al objeto.

El objeto es iluminado con un rayo (Karp, 2011)

de luz
¿Cómo se puede incrementar Conceptos importantes
la resolución? Aceite de inmersión en 100X
Para aumentar aún más la resolución, además de agregar un condensador, se
coloca algún líquido entre la lámina cubreobjeto y el objetivo. Se ha obtenido
buenos resultados con ciertos aceites (aceite de cedro), actualmente se utilizan
aceites sintéticos, cuyo índice de refracción es igual al del vidrio cubreobjeto,
eliminando toda reflexión de los rayos luminosos

El espacio entre el El espacio es

cubreobjeto (5) y el ocupado por el
objetivo (3) es aceite de inmersión
ocupado por el aire. (6). Haciendo que el
cono de luz y el
ángulo a sean
mayores con
inmersión.

(Karp, 2011)
Medio de inmersión: Algunos objetivos ameritan el uso de
medios de inmersión y para ello se emplea un código de Conceptos importantes
colores o las abreviaciones Oil, Oel (aceite); HI
(homogeneous immersion); W, Water, Wasser (agua) y Gly
(glicerol).

Es un valor que indica el ángulo de

Rango que puede ir desde 0,5x
apertura del cono luminoso
hasta 200x

Distancia entre
En caso de objetivos que en ciertas condiciones el centro de la
tienen resultados óptimos (para luz polarizada, lenta y el punto
contraste de fase, entre otros). focal,
expresada en
mm.

Facilita la identificación A menor

del aumento distancia focal,
más aumento.
LONGITUD DEL TUBOà Longitud que separa al
objetivo del ocular, usualmente en milímetros (160, Punto focal (f)
170, 220) o con el símbolo (8) para objetivos con
corrección infinita.

DIC differential interference contrast; y la H significa que puede

emplearse en microscopios con platina caliente (heating stage)

10 X, AN= 0.30, 40X= 0.65, 100X= 1.30-1.5

 Conceptos importantes

Más información:
http://bibmed.ucla.edu.ve/edocs_bmucla/materialdidactico/celular/optica.p
df
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitu
lo4_4.htm
 El campo de visión de un
Conceptos importantes
microscopio es la zona circular - área
que se observa al mirar la preparación
bajo un determinado aumento. El
diámetro de este campo es su medida

Si el aumento es mayor,
el campo disminuye, lo cual quiere
decir que el campo es
inversamente proporcional al
aumento del microscopio

Contraste à La
diferencia en la Aberracionesà Imperfección de un sistema
apariencia entre las óptico que produce una imagen defectuosa, deficiente
partes adyacentes en nitidez o en su semejanza al objeto. Pueden ocurrir por
de un objeto o defectos propios de las lentes o por alteración en el
entre un objeto y su comportamiento de la luz al incidir sobre la muestra.
fondo Más info:
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo3_5.ht
m
https://ssyf.ua.es/va/formacion/documentos/cursos-
programados/2011/especifica/microscopia-optica/microscopia-optica-i-laser-confocal-
2a-ed/tema-2.pdf
Clases de microscopios
Microscopio de campo
oscuro
Cambio en la manera
como que incide la luz Microscopio de luz
sobre el espécimen: Empleo polarizada
Microscopio de condensadores y filtros:
óptico
Contraste por
interferencia
Límite de diferencial (Differential
resolución Interference Contrast)
0,2 – 1 um Nomarski
Microscopios
Microscopio de luz
ultravioleta.à tiene una longitud
Instrumentos Modificación de la de onda de 200 nm, por lo tanto puede
alcanzar una resolución de 100 nm
fuente emisora de luz:
que producen Cambiando la luz
una imagen blanca por luz Microscopio de Fluorescencia
ultravioleta o rayos
aumentada de láser:
un objeto. Microscopio confocal de
barrido láser

Límite de resolución 0,2 nm

Microscopio M. E de Transmisión TEM
Cortes finos
electrónico

M. E de Barrido Límite de resolución 10 nm

(Scanning) SEM Imágenes tridimencionales
CLASES DE MICROSCOPIOS

El microscopio de campo oscuro

4. El espécimen (los microorganismos
o células) se observen brillantes sobre
un fondo oscuro.

3. La única luz que es capaz de entrar en el objetivo

es la que, al ser dispersada por la muestra, incide
sobre el objetivo

2. La luz incide sobre la

muestra sólo desde los lados.

1. Diafragma especial
Tiene un
diagrafma
especial que
hace que la
luz incida
sobre las
muestra
desde los
lados.

(Robertis, 2004)
 CLASES DE MICROSCOPIOS

El microscopio de campo
brillante
Se recomienda para las muestras de alto
contraste como los cortes teñidos de tejidos

El microscopio de contraste de Fase

Se desarrolló para poder incrementar las
diferencias de contraste entre las células y
el medio que las rodea, lo que permite su
visualización sin necesidad de tinción.
Permite visualizar cell vivas
Hace mas visibles los objetos muy
transparentes
Son útiles para examinar componentes intracelulares de células con una resolución
hasta cierto punto alta à ejemplo, la movilidad dinámica de las mitocondrias, los
cromosomas mitóticos y las vacuolas puede seguirse y filmarse con este sistema
óptico.
(Robertis, 2004)
Microscopía diferencial de contraste de CLASES DE MICROSCOPIOS
interferencia (DIC). Nomarski (diseñador)
Un rayo de luz atraviesa la muestra y el objetivo y luego se divide en dos rayos que se interfieren
entre sí por medio de un prisma compensador ubicado en el condensador.à LUZ POLARIZADA
Las imágenes combinadas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un
lado. Fue diseñado para observar relieves de especímenes muy difíciles de manejar, es muy
utilizado en los tratamientos de fertilización in-vitro actuales.
DIC se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar contraste de fases

Polarizador

Da resultados cuantitativos
Presenta una imagen que tiene una calidad
tridimencional aparente.
Permite determinar cambios en
el índice de refracción. (Robertis, 2004)
Microscopio de fluorescencia CLASES DE MICROSCOPIOS
Se utiliza para visualizar muestras
Detector – Cámara
capaces de emitir fluorescenciaà
fluorocromos o fluoróforos que
absorben radiación ultravioleta
Detector – Ocular
invisible y emiten porciones de la
energía en las longitudes de onda
visibles, más largas.
La fluorescencia puede ser debida a
que determinadas muestras posean
sustancias capaces de fluorescer, Fuente
de luz UV
como las clorofilas, o por haber sido
tratadas con un colorante
fluorescente.
Muestra

La fuente de luz en un
microscopio de este tipo produce
un rayo de luz ultravioleta que Aplicaciones:
viaja por un Filtro òptico de • Marcaje de moléculas en células y tejidos para su
bloqueoà bloquea todas las caracterización e identificación.
longitudes de onda excepto la • Estudio de células normales y patológicas.
capaz de excitar el fluorocromo • Estudio inmunológicosà INMUNOCITOQUÍMICA
• Mineralogía. (Robertis, 2004)
Epifluorescenciaà La fuente de luz se inserta por encima del sistema óp9co (obje9vos de aumento)
 Microscopio confocal de CLASES DE MICROSCOPIOS
barrido láser

pasa por una abertura diminuta

se refleja en un
espejo dicroico
(un tipo de
Produce una imagen de un
espejo que refleja plano delgado situado
ciertas longitudes dentro de un espécimen
de onda y
transmite otras) mucho más grueso.
Los fluorocromos
La muestra se ilumina con un
de la muestra rayo láser
absorben la luz con un enfoque fino que
incidente y emiten luz
Una fuente de luz
con mayor longitud de barre rápidamente el
láser emite luz de
longitud de onda
onda, que puede espécimen a una
pasar por el espejo
corta (azul)
dicroico y enfocarse en sola profundidad, con lo que
un plano que contiene sólo ilumina un plano
una abertura diminuta.
La luz pasa luego a un delgado (o “corte óptico”)
lente del objetivo para
tubo fotomultiplicador dentro de la muestra.
que amplifica la señal,
enfocarse en un punto en la cual se transmite a
el plano del espécimen. una computadora que
forma una imagen
digital procesada

(Karp, 2011)
 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Una forma para hacer que una muestra delgada y
traslucida sea visible al microscopio es teñirla con
algún colorante, que absorba solo ciertas
longitudes de onda del espectro visible

Los distintos tintes se unen con diferentes moléculas

biológicas.
Permite identificar donde se encuentran los
diversos tipos de sustancias en la muestra.
Las tinciones casi nunca se usan en células vivas
Por lo general los tintes son tóxicos.
La tinción de Feulgen. Este procedimiento de
tinción es específico para el DNA Frotis o extendido: para estudiar
suspensiones celulares como sangre, se
Aplastamiento o "smash": se coloca el coloca una gota sobre el portaobjetos y
material previamente ablandado entre se extiende con una ansa.
porta y cubre y se presiona con fuerza
aplastando ejm cariotipo

FROTIS (“SMEAR”) smear blood technique

https://www.youtube.com/watch?v=4NkgEjPKzBA
Aplastamiento
 CLASES DE MICROSCOPIOS
Microscopio electrónico
El microscopio electrónico
utiliza electrones para
iluminar un objeto.
Dado que los electrones
tienen una longitud de
onda mucho menor que
la de la luz pueden
mostrar estructuras mucho
más pequeñas.
Hay dos tipos básicos de
microscopios electrónicos:
0.2𝝻m Micro óptico 527 nm para la luz
blanca- Micro òptico

d=
0.005 nm para haz
0.2 nm TEM de electrónes
0.05-10 nm SEM

(Robertis, 2004)
 CLASES DE MICROSCOPIOS
Microscopio electrónico de transmisión
Transmission Electron Microscope, TEM
Forman imágenes con los electrones que se transmiten a
través de un espécimen,
Para utilizarlo se debe cortar la muestra en capas
finasà los é atraviesan la muestra.
Se coloca una placa fotográfica o una pantalla
fluorescente detrás del objeto para registrar la imagen
aumentada.
Pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.
Se utiliza más en el examen de la estructura interna
de las células.

(Robertis, 2004)
 CLASES DE MICROSCOPIOS
Microscopio electrónico de transmisión

Transmission Electron Microscope, TEM

Karp G. Biología Celular y Molecular. 6ª ed. 2011

 Microscopio Electrónico de
Microscopio transmisión TEM.
Fuente de electrones:
óptico Alambre de Tungsteno
Filamento se calienta
(cátodo +) generando
exitación de los é que
se mueven rapidamente
cátodo (+) hacía el ánodo (-)
é é
ánodo (-)
CLASES DE MICROSCOPIOS
Microscopio electrónico de
barrido SEM
Filamento se calienta (cátodo +)
generando exitación de los é que se
mueven rapidamente hacía el ánodo (-)
cátodo (+)
ánodo (-)

é é
é é
é é atraviesan el tejido é

é
é é El detector captura el registro
donde los é chocaron con el

é é metal formando una imagen en

el monitor en 3D.

é Bombardean a la muestra que fue

previamente recubierta con un metal. Los é
no atraviesan la muestra. Por lo que la
imagen que se forma es de la superficie.
Magnificación hasta
Magnificación hasta 1.000.000x Magnificación hasta 300.000x
1500x-2000x

Lentes de Cristal o cuarzo

Lentes electromagnéticos
Muestra muerta y deshidratada
Muestra viva o muerta Preparación de la muestra compleja
Medio: Aire
Medio: Vacío
 Cuanto más
delgada se quiera
fijadoresà la sección más se
mantener debe endurecer
estructuras la muestra
celulares y Parafina ó
moleculares en Tetróxido de osmio resina.
sus posiciones
iniciales
2. DESHIDRATACIÓN 3. INCLUSIÓN
durante el 1. FIJACIÓN
procesamiento
posterior.

4. CORTE
Microtomo à
(Micros,
pequeño y
tomos, cortar)
Ultramicrotomo
—> más preciso
y sofisticado,
cortes ultrafinos
5. COLORACIÓN
Vibratomoà
Cortes de tejido
tanto fresco
como fijado. En
este caso la
pieza no debe
ser incluida ni Microscopia óptico à
congelada.
corte aprox. de 5 µm,
La cuchilla va
penetrando en Microscopia
el tejido gracias electrónica à corte
a una vibración aprox. menos de
controlada 0.1 µm
(Karp, 2011)
 2. DESHIDRATACIÓN àGradiente de alcohol 2. DESHIDRATACIÓN àGradiente de alcohol

3. INCLUSION EN
RESINA
3. INCLUSION EN
PARAFINA
 CLASES DE MICROSCOPIOS
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

Microscopio electrónico de barrido

(Scanning Electron Microscope, SEM).
utilizan electrones que rebotan en la
superficie del espécimen.
Crea una imagen ampliada de la superficie
de un objeto.
No es necesario cortar el objeto en capas
para observarlo
Explora la superficie de la imagen punto por
punto, al contrario que el TEM, que examina
una gran parte de la muestra cada vez.

Se emplea sobre todo para examinar las

superficies de los objetos cuyo tamaño varía
desde un virus hasta la cabeza de un animal
 CLASES DE MICROSCOPIOS
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
Microscopio electrónico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM).

Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy

concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de
electrones por la pantalla de una televisión.
Presenta toda la imagen en el monitor.
Pueden ampliar los objetos 100.000 veces o más.
Produce imágenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto.
PREPARACIÓN DE MUESTRAS
El objetivo de la preparación del espécimen para el SEM es producir un
objeto que tenga las mismas propiedades de forma y superficie que en el
estado vivo, pero que carezca de líquido.

Es necesario observar el espécimen al vacío.

La extracción de agua (alto constituyente) puede tener un efecto destructivo en la

estructura celular.

Las muestras que se examinarán con el SEM se fijan, y se pasan por una serie de
alcoholes y luego se secan en un proceso de secado de punto crítico.

El secado de punto crítico ofrece la ventaja de que cada solvente tiene

una temperatura y una presión críticas en las que la densidad del vapor es igual a la
densidad del líquido.

En este punto no hay tensión superficial entre el gas y el líquido. El solvente de las
células se sustituye con un líquido de transición (por lo general dióxido de carbono),

Una vez que el espécimen se seca

Se cubre con una capa delgada de metal, lo que lo convierte en un blanco

adecuado para un rayo de electrones.
MICRODISECCIÓN
TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE CELL
Utiliza un rayo láser, puede
separar y analizar células de
diferentes áreas de un
tumor, permitiendo así
comparar sus propiedades
o su composición molecular
con las de células normales
adyacentes.
El haz de laser recorta
directamente un grupo de
células se capturan y se
colocan en un contenedor
apropiado para su análisis
posterior.

CITOMETRÍA DE FLUJO
Marcaje de cell con Anticuerpos acoplados a
colorantes fluorescentes.

Cell pasan por un sistema de vibración y por el láser

que carga las cell positiva o negativamente.

Fuente: Alberts 2008

Se pasa por un campo eléctrico que separa las cell
(Karp, 2011)
Separa células o cromosomas según sus tamaños
o densidades. CITOMETRÍA DE FLUJO
Las células se deben marcar con Anticuerpos con sustancias fluorescentes
Se hace pasar la solución de células una en una por delante de un haz de láser

1. El impacto de cada célula con

el rayo de luz será captado por
2. En el momento de distintos detectores.
realizar las mediciones
en el citómetro de flujo,
las células pueden
estar vivas o fijadas,
pero obligadamente
en suspensión celular y
en forma de célula
única. Al obligarlas a
pasar alineadas una a
una frente a un haz
láser mediante un flujo
continuo, cada célula, 3. La digitalización à
a la vez que dispersa la permitir la medida
luz, emite luz simultánea de varios
fluorescente como parámetros en una
consecuencia de la misma célula
excitación láser a la
que es sometida.

(Karp, 2011)
 STEM CELL à Cell madre CULTIVO CELULAR
embrionarias

Las células ES, derivadas de embriones

humanos en fases tempranas del
desarrollo, suponen una fuente
inagotable de material que puede ser
usado para reemplazar y reparar tejido
humano maduro.

Las células normales (no malignas) pueden dividirse una cantidad limitada de veces
(por lo general 50 a 100) antes de envejecer y morir.
Fuente: Alberts 2008
Razón por la que muchas de las células que suelen usarse en los estudios con cultivo
de tejido se someten a modificaciones genéticas que les permiten crecer por tiempo
indefinido. (TELOMERASA à Enzima responsable del mantenimiento de los telómeros).
Oncogenes promotores de cáncer.

Las células de este tipo se conocen como LÍNEA CELULAR y casi siempre crecen para
formar tumores malignos cuando se inyectan en animales de laboratorio susceptibles.
(Alberts, 2014)
Pequeño, 2017. Imagen tomada de: https://ruc.udc.es/dspace/bitstream/handle/2183/20347/PequenoFreire_Nerea_TFG_2017.pdf?sequence=2&isAllowed=y
 n
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The N r
logy o
Physio 09
ed ic ine 20
M

https://www.ted.com/talks/elizabeth_blackburn_the_science_of_cells_that_never_get_old?language=es
 CULTIVO CELULAR

Las células cultivadas pueden obtenerse en grandes cantidades. Casi todos los cultivos contienen
sólo un tipo de célula. Permite estudiar actividades como: endocitosis, movimiento celular, división
celular, tráfico de membrana y la síntesis de macromoléculas

Las células cultivadas responden al tratamiento

con fármacos, hormonas, factores de
crecimiento y otras sustancias activas.

Los cultivos celulares requieren nutrimentos,

hormonas, suero, factores de crecimiento y
cofactores para mantenerse sanas y proliferar.

Uno de los principales objetivos de los cultivadores de

células es desarrollar medios definidos libres de suero
que mantengan el crecimiento de las células.
(Karp, 2011)
Imagen tomada de Introducción al cultivo celular, http://www.ehu.eus/biofisica/juanma/mbb/pdf/cultivo_celular.pdf
La composición de estos medios químicos es relativamente
compleja à Nutrientes, vitaminas, diversas proteínas CULTIVO CELULAR
purificadas (insulina, factor de crecimiento epidérmico, transferrina).
Mantener condiciones estrictas de esterilidad.

AISLAMIENTO Romper la matriz Con agitación

suave se disocián
DE LA CÉLULA extracell y las uniones
intercell los tejidos

El tejido se lava para eliminar

La disociación se realiza con
ayuda de enzimas proteolítica
(tripsina) à digerir proteínas
extracell de adhesión celular.
la enzima y se suspende en una
El calcio desempeñan una
solución salina que carece de
función clave en la
iones Ca2+ y que contiene
(EDTA), quelando con los iones adhesión celular
de calcio.

CULTIVO PRIMARIO:
Las células se obtienen del organismo.
Los cultivos primarios de cell animales
normalmente se toman de embriones, cuyos
tejidos se disocian con más facilidad en células
que los tejidos de los adultos.

CULTIVO SECUNDARIO
Proviene de un tejido primario, y las células están
Imagen: Tavira et al., 2009
https://www.redalyc.org/pdf/579/57912962006.pdf
criopreservadas en nitrógeno líquido. (Alberts, 2014)
Separadas las células se pueden iniciarse dos tipos básicos
de cultivos celulares.
CULTIVO DE MASA
Una cantidad más o menos grande de células se
agrega a una caja de cultivo; se asientan y
unen al fondo para formar una capa
relativamente uniforme de células.
Las células que sobreviven crecen, se dividen,
tras varias generaciones, forman una
monocapa que cubre el fondo de la caja.
CULTIVO CELULAR
CULTIVO CLONAL
se agrega una cantidad hasta cierto punto
pequeña de células a la caja para que cada
célula esté a cierta distancia de sus vecinas.
En estas condiciones cada célula sobreviviente
prolifera para formar una colonia o clon
separado.
Cuyos miembros provienen de la misma célula
original.
(Karp, 2011)
 ALGUNAS LINEAS CELULARES CULTIVO CELULAR

Muchas de estas líneas celulares derivan de

tumores.
Todas son capaces de multiplicarse
indefinidamente.

STEM CELL à Cell madre embrionarias

Fuente: Alberts 2008

LÍNEAS CELULARES TRANSFORMADAS

Líneas celulares preparadas a partir de células humanas cancerosas
Pueden crecer sin adherirse a ninguna superficie y proliferan en placa de cultivo hasta
una densidad mucho mayor a la de las células normales.
(Alberts, 2014)
 RADIOISÓTOPOS
RASTREADOR: sustancia que revela su presencia de una
forma u otra y por tanto puede localizarse o vigilarse durante
el curso de un experimento.

ISÓTOPOS
Átomos con el mismo número de protones y distinta cantidad
de neutrones.

Los isótopos son radiactivos cuando

contienen una combinación inestable de
protones y neutrones. Los átomos que son
inestables tienden a romperse o
desintegrarse, con lo que alcanzan una
configuración más estable. Cuando un
átomo se desintegra, libera partículas o
radiación electromagnética que puede
vigilarse con los instrumentos apropiados.
 Formas principales de radiación:
RADIOISÓTOPOS Durante su desintegración. Es posible que el
átomo libere:

Partícula alfa à libera Dos protones y dos

VIDA MEDIA (T1/2) de un radioisótopo neutrones. (es un núcleo del elemento helio)
es una medida de su inestabilidad. Eje. Uranio 232, Plutonio 238.
Entre más inestable, mayor es la
probabilidad de que un átomo
determinado se desintegre en un
tiempo específico.
Partícula beta à que
equivale a un electrón

Radiación gamma à radiación

electromagnética o fotones.

(Karp, 2011)
Isotopos radiactivos en la medicina
Isotopos radiactivos en la medicina
Isotopos radiactivos en la medicina

TOMOTERAPIA:
https://www.youtube.com
/watch?v=YujSuBbE_pY
 AUTORRADIOGRAFÍA

Método que utiliza material radioactivo para marcar a nivel molecular, celular y
tejidos.
La muestra que contiene la sustancia radioactiva se coloca en contacto directo con
una capa gruesa de emulsión fotográfica.
Los átomos radioactivos de la muestra se desintegran y la radiación emitida activa los
granos individuales de Bromuro de plata de la emulsión y los hace susceptibles de
convertirse en plata metálica.
Por medio de un revelado fotográfico, el patrón de granos resultantes indica la
distribución del material radioactivo en la muestra. (Karp, 2011)
 3 Se realiza un corte del tejido
Similar al explicado anteriormente AUTORRADIOGRAFÍA
Método que utiliza material radioactivo (radioisótopos)
para marcar a nivel molecular, celular y tejidos.
5 El preparado queda a temperatura ambiente hasta que la
emulsión fotográfica forma una película de gelatina sobre el
tejido.
Partícula emitida
1 2

Cristales de BrAg

4 Se sumerge en la emulsión
fotográfica a 45°C Átomo de Tritio

7 La radiación que emite el radioisótopo incide sobre los

cristales de BrAg de la película y convierte los iones de
plata (Ag) en plata metálica.

Después del Revelado se examina en el TEM.

6 Cuando se saca el Los cristales de BrAg
portaobjetos se no impactados por la
guarda varios días radiación se disuelven durante la
en una caja
fijación fotográfica
hermética y a
oscuras hasta que
este listo para el
REVELADO, se
realiza como en
(Robertis, 2004)
una foto común
8 El montaje se revela y los granos de
plata se visualizan como puntos
oscuros

El radioisótopo que mas se usa es

tritio (3H) ejm marcaje de timidina
para DNA.
(Karp, 2011)
 FRACCIONAMIENTO CELULAR
Fraccionamiento celular por centrifugación.
Centrifugaciones repetidas a velocidad
velocidad baja: 1000
veces la fuerza de la progresivamente mayor permiten
gravedad durante fraccionar los extractos celulares en
10 minutos
sus componentes. En general, cuanto
Fracción nuclear menor sea el tamaño del componente
subcelular mayor será la fuerza
centrifuga necesaria para sedimentario.
velocidad media: 20.000
veces la fuerza de la 1. Se debe realizar a la rotura mecánica de las
gravedad durante 20
minutos células con un homogeneizador mecánico.
2. Las células se homogeneizan en una
Fracción mitocondrial solución amortiguada isotónica (que a
menudo contiene sacarosa), lo que
velocidad alta: 80.000
veces la fuerza de la previene la rotura de las vesículas de
gravedad durante 1 hora membrana por ósmosis.
3. El homogeneizado se somete a una serie de
Fracción microsómica
Fragmentos del ER y centrifugaciones secuenciales cada vez
AG con mayor fuerza centrífuga.
velocidad muy alta: La composición de varias fracciones puede
150.000 veces la fuerza
de la gravedad
determinarse con el examen microscópico o la
durante 3 horas medición de las cantidades de proteínas particulares
conocidas como específicas de organelos
Fracción soluble particulares.
(Alberts, 2014)
(Karp, 2011)
ANÁLISIS DE PROTEÍNAS
Permite identificar la cantidad de proteína o ESPECTROFOTÓMETRO
ácido nucleico presente en una solución
determinada por medio de la medición
de la cantidad de luz de una longitud de
onda específica que absorbe esa solución.

La solución se deposita en un recipiente

especial de cuarzo con lados planos
(se usa cuarzo porque, a diferencia del
vidrio, no absorbe la luz ultravioleta)
llamado cubeta, que se coloca en el haz de
luz del espectrofotómetro.

La cantidad de luz que pasa por la solución

sin ser absorbida (es decir, la luz transmitida)
se mide en fotoceldas del otro lado de la
cubeta.
Dos de los 20 aminoácidos incorporados en las proteínas, la tirosina y la fenilalanina,
absorben la luz del espectro ultravioleta, con una absorbancia máxima cercana a 280
nm.

Si las proteínas en estudio tienen un porcentaje típico de estos aminoácidos, la

absorbancia de la solución en esta longitud de onda proporciona una medida de la
concentración de proteína.
CRISTALOGRAFÍA POR RAYOS X (O DIFRACCIÓN DE RAYOS X)
La radiación que se dispersa (difracta) por los
electrones de los átomos de la proteína, golpea un
detector sensible a los electrones situado detrás del
cristal.
Los cristales de proteína se bombardean
con un fino haz de rayos X de 0,1 a 0,2
nm de longitud de onda

haz de rayos X

Fotografía 51 es el nombre dado a una imagen del El patrón de diferenciación que el cristal
DNA obtenida por Rosalind Franklin mediante produce depende de la estructura
interna de la proteína.
difracción de rayos X en 1952

(Alberts, 2014)
Imagen tomada de: Proyectos de aula, ND. https://media.timetoast.com/timelines/proyecto-de-aula-la-celula