Expo Micro

Options and Limitations in Clinical
Investigation of Bacterial Biofilms

Curso: Microbiología clínica y sanitaria
Docente: César Guerrero B.
Alumnos:
• Arévalo Charles • Soto Verónica
• Delgado Pamela • Ticona Ximena
• García Cristina • Urquiza Cecilia
• Moreno Steven
Univ ersidad Nacional
Federico Villarreal
Facultad de Tecnología Médica
Introducción
Los biofilms son comunidades de Superficies bióticas
• Válvulas del corazón
microorganismos que crecen • Esmalte dental
embebidos en una matriz de • Tracto respiratorio
exopolisacáridos y adheridos a • Tracto urinario, etc
una superficie Inerte o tejido
vivo.
superficie
Superficies abióticas
80% de las infecciones • Prótesis ortopédicas
• Valvulas cardiacas
bacterianas en humanos Su función es proteger Pueden adherirse a artificiales
de las amenazas una superficie biótica o • Cateteres
externas como los abiótica. • Prótesis dentales
antimicrobianos y la
respuesta inmunitaria
del huesped.
Federico Villarreal
Se investiga los biofilms Limitaciones en las

desde diferentes pruebas “in vitro”:
perspectivas: Química, coloraciones, estudios
Física, Biología de colonias
Búsqueda de nuevas Dificultad en la

estrategias contra los evaluación de
biofilms. susceptibilidad
microbiana.
Federico Villarreal
Arquitectura de los biofilms

La matriz extracelular se puede
diferenciar en función de:
• Cepas o especies que
componen el biofilm.
• Condiciones de desarrollo y
expresion de factores
bacterianos
• Ubicacion espacial del biofilm.
Federico Villarreal
Formación de un Biofilm
Federico Villarreal
•Los biofilms pueden

Condiciones de construirse en superficies
construcción solidas, liquidas O en aquellas
que existen flujo continuo.
Comunidades bacterianas intracelulares
PMN Biofilms endobronquiales en

Elastasa Pseudomonas aeruginosa
Colagenasa
Federico Villarreal
Tipos de biofilms
Superficie en
superficie sólida •Superficie líquida condiciones de flujo
Federico Villarreal
Importancia de la superficie y el •Los biofilms que

crecen en una
substrato que la compone superficie solida
dependen del
•PVC material del
sustrato
•Silicona
•Poliestireno
•fibrina, laminina, Metal

colágeno, fibronectina
e inmunoglobulinas
Federico Villarreal
Federico Villarreal
Diseminación
Dispersión de celulas bacterianas

hacia otros lugares. La dispersión.
Y colonización explica la cronicidad
de la infección.
El proceso de dispersión de la
biopelícula está controlado por señales
ambientales (oxígeno, nutrientes,
temperatura y moléculas de
señalización)
Federico Villarreal
CONFIGURACIONES DE
LABORATORIO
CULTIVO DE BIOFILMS EN
CONDICIONES ESTÁTICAS
Este método genera una

estructura estable y limita la
posibilidad de desprendimiento
de células, lo que garantiza que
las diferencias observadas en el
número de células se deben a la
muerte celular más que al
desprendimiento.
Federico Villarreal
Los ensayos basados en placas de

microtitulación se describieron por
primera vez en 1985 para evaluar la
adherencia estafilocócica a las
placas de cultivo de tejidos de
plástico.
Se incuban aeróbicamente a 37 ° C durante períodos de tiempo designados (de 1 a 4 h

para la fijación inicial y ~ 20 h para la formación de biofilms, dependiendo de la especie).
Los estudios sobre aislamientos formadores de biofilms han demostrado que las
bacterias móviles, incluidas E. coli flagelada , P. aeruginosa , Vibrio cholerae y Salmonella
entérica, tienden a coagularse en la interfaz aire-líquido. Por el contrario, los cocos
inmóviles, incluidos los enterococos (con la excepción de los organismos
móviles Enterococcus casseliflavus y Enterococcus gallinarum ) y los estafilococos,
forman agregados en la base de la placa de microvaloración.
Federico Villarreal
Un ensayo de aire-líquido permite el análisis cualitativo de la formación de biofilms a través de la

visualización microscópica directa de contraste de fase de los agregados bacterianos en etapa temprana
en pozos de fondo plano. Los inóculos bacterianos colocados en una placa de fondo plano de 24 pocillos
se incuban en ángulo o se colocan cubreobjetos en ángulo en los pocillos durante el tiempo de incubación
apropiado; los cubreobjetos se lavan y se tiñen con violeta cristal o con un anticuerpo fluorescente contra
un antígeno específico de especie o una proteína de elección. Se puede utilizar un microscopio
convencional o de fluorescencia para la visualización de biofilms.
Federico Villarreal
La prueba de anillo de Biofilms (BRT) es una herramienta recientemente disponible

para el estudio de la cinética de formación de biofilms que se desarrolló en la última
década.
(i) Las cepas de H. influenzae no tipificables (NTHi) aisladas de fluidos corporales

(sangre, esputo y líquido pleural y cefalorraquídeo) de individuos con neumonía
no bacteriémica adquirida en la comunidad y enfermedad pulmonar obstructiva
crónica (EPOC) y del líquido del oído medio de pacientes con otitis media.
(ii) S. aureus y S. epidermidis, cepas de casos de osteomielitis aguda y crónica y
artritis infecciosa.
(iii) Las cepas de P. aeruginosa de muestras de esputo de pacientes con FQ.
Federico Villarreal
Federico Villarreal
CULTIVO DE BIOFILMS EN
CONDICIONES DE FLUJO
 Entre las ventajas de los modelos de flujo continuo está:
 La capacidad de comparar los efectos que ejercen diferentes medios

 Concentraciones de oxígeno
 Cambios de temperatura
 Sustancias sobre el biofilm en todas las fases de desarrollo.
 Evaluación de los efectos que las moléculas de ocurrencia transitoria, como los
antibióticos o los inhibidores de la adherencia, tienen sobre los biofilms.
 Sin embargo, las desventajas técnicas de los biofilms de flujo continuo incluyen:
 Una mayor complejidad experimental

 La posible formación / atrapamiento de burbujas de aire en la tubería de
instalación.
Federico Villarreal
El sistema Kadouri es un sistema intermedio entre los

biofilms estáticos y las celdas de bajo flujo.
La principal diferencia con los ensayos estáticos es que
los pozos son parte de un sistema cerrado con dos
salidas, una para el suministro continuo de medio fresco
a través de una bomba ajustada y otra para la
eliminación de desechos y células planctónicas, mientras
que la diferencia con los sistemas de células de flujo
radica en las fuerzas cortantes mínimas.
Se forma biofilms en canales (principalmente tubos de
silicio) que contienen cupones de vidrio o catéteres y se
produce una gran biomasa.
Se ha aplicado un modelo in vitro para la inhibición de
biofilms bacterianos basadas en bacteriófagos en
superficies de dispositivos médicos. Este modelo
involucró biofilms de S. epidermidis en catéteres
venosos centrales y urinarios recubiertos de hidrogel
con un reactor de biofilms de flujo por goteo
modificado.
Federico Villarreal
El dispositivo de Robbins (RD) genera biofilms sumergidos que

crecen en sistemas acuosos que pueden usarse para el
interrogatorio de comunidades multiespecies.
En la actualidad, los biofilms de múltiples especies se forman
mediante el co cultivo de diferentes cepas clínicas adquiridas
previamente o mediante la transferencia de una población
ambiental mixta a la configuración experimental. Hasta ahora,
el dispositivo más comúnmente aplicado es el dispositivo
Robbins modificado (MRD), que implica la formación de
biofilms de una o varias especies en segmentos de catéter de
diversos materiales en condiciones de flujo.
Federico Villarreal
Los reactores de disco rotatorio,

incluido el reactor de biofilm CDC,
facilitan el crecimiento bajo un esfuerzo
cortante moderado controlado y
condiciones de flujo medio continuo.
Un método alternativo implica cámaras

de reacción concéntricas con cilindros
que permiten la formación de biofilms.
Las modificaciones en la velocidad o el

diámetro del cilindro afectan la
densidad celular y la estructura del
biofilm.
Federico Villarreal
El dispositivo de biofilm Calgary con tapa de clavija

(CBD) genera biofilms en el fondo de 96 clavijas
colocadas en una tapa de microplaca de
poliestireno o una bandeja multicanal que contiene
un inóculo bacteriano de densidad óptica
estandarizada.
El estudio de cepas de P. aeruginosa formadoras de

biofilms de esputo aisladas de pacientes con FQ es
un ejemplo del uso del CBD para comparar la
eficacia de múltiples combinaciones de antibióticos.
Federico Villarreal
Federico Villarreal
Se han aplicado sistemas de modelos de biofilms de co cultivo estático y de flujo para estudiar la
formación de biofilms en superficies bióticas, así como las respuestas a diversos enfoques
terapéuticos.
Estos modelos tienen como objetivo reflejar el proceso infeccioso en tiempo real y ofrecen la
ventaja de examinar la interacción huésped-patógeno. Se han empleado varios sistemas de cultivo
en modelos de co cultivo de biofilm-células de mamífero, que incluyen:
(i) células epiteliales de las vías respiratorias humanas (células CFBE) y células epiteliales
bronquiales humanas (BEAS-2B) co cultivadas con P. aeruginosa.
(ii) una línea celular de queratinocitos oral humana co cultivaron con especies múltiples biofilms
orales que implican P. gingivalis , Fusobacterium nucleatum , Aggregatibacter
actinomycetemcomitans , Streptococcus mitis , Streptococcus oralis , intermedius
Streptococcus , Veillonella dispar , Actinomyces naeslundii , y Prevotella intermedia.
(iii) células epiteliales intestinales co cultivadas con E. coli O157: H7
(iv) osteoblastos humanos co cultivados con Staphylococcus epidermidis.

ENSAYOS DE
CUANTIFICACIÓN Y
VIABILIDAD
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• VIABILIDAD. El seguimiento de las bacterias viables dentro de una biopelícula se

puede lograr mediante cultivo, detección de actividad metabólica y evaluación de
la integridad de la membrana.
• CUANTIFICACIÓN. La enumeración convencional de UFC no genera resultados

reproducibles y confiables para la mayoría de la cuantificación de biopelículas
debido a la presencia de agregados celulares que obstaculizan el desarrollo de
colonias distintas, así como la resolución de especies individuales, en el caso de
biopelículas de múltiples microorganismos.
La agitación con vórtex o la sonicación antes de la aplicación de placas pueden

provocar la destrucción de la estructura de la muestra o el atrapamiento de
burbujas de aire y resultados erróneos debido al desprendimiento parcial de las
células
Federico Villarreal
• El ensayo de Cristal Violeta (CV), una de las técnicas asociadas con biofilm in
vitro más comúnmente utilizadas, permite la visualización óptica del grosor del
biofilm y la cuantificación de la biomasa total, especialmente en las etapas
iniciales, pero no es preciso para calcular la viabilidad celular. Además, CV
carece de sensibilidad y especificidad debido a la alta variabilidad cuando el tinte
se une de manera inespecífica a moléculas cargadas negativamente o se extrae
de manera desigual con etanol.
• El método de agar Rojo Congo investiga cepas de estafilococos coagulasa
negativos, y puntúa cualitativamente la producción de celulosa y fibra amiloide
por bacterias gramnegativas (probadas predominantemente en E. coli ,P.
aeruginosa y Salmonella).
• El azul de dimetilmetileno (DMMB) se une a glicosaminoglicanos (GAG) y
adhesinas intercelulares de polisacáridos (PIA). Este es un método específico de
especie dirigido a las biopelículas de S. aureus, restringiendo el rango de
diagnóstico de la técnica a esta especie que posee una matriz de biopelícula
relacionada con PIA.
Federico Villarreal
• El ensayo Live/Dead BacLight utiliza doble tinción con los colorantes fluorescentes
de ácido nucleico Syto 9 y yoduro de propidio (PI):
 Syto 9 emite fluorescencia verde y penetra tanto en las membranas celulares dañadas
como intactas, proporcionando recuentos celulares totales.
 Mientras que el PI emite fluorescencia en rojo y cruza solo las membranas celulares
dañadas.
La presencia dual de los tintes permite mediciones multimodales, incluidas:
Lecturas de microplacas.
Análisis de citometría de flujo.
incluso microscopía.
• La clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) se ha investigado

intensamente para la separación de subpoblaciones de biopelículas en el
laboratorio, con el potencial de utilizarse para la cuantificación.
Federico Villarreal
• Otros tintes de unión a ácidos nucleicos aplicados para microscopía de

fluorescencia incluyen
- Naranja de acridina (AO).Permea las células, y permite el recuento total de
células dentro de la biomasa.
- Bromuro de etidio (EB). Tiñe de rojo los ácidos nucleicos cuando se pierde la
integridad de la membrana celular.
- DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindol). Tiñe las células con membranas intactas. A
pesar de las complicaciones del fluoróforo, la citometría de flujo es única para el
estudio de subpoblaciones heterogéneas. Una concentración alta de DAPI es
indicativa de una biopelícula más gruesa; por lo tanto, se puede utilizar para la
detección y visualización de componentes de matriz extracelular de
biopelículas. Un ejemplo de aplicación DAPI es el análisis de la matriz
de Salmonella enterica serovar Typhi y cálculos biliares asociados a S.
typhimurium.
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• El hidróxido de 2,3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -5 - [(fenilamino) carbonil]

-2H-tetrazolio (XTT) se utiliza para identificar espectrofotométricamente células
metabólicamente activas que reducen el XTT a formazán soluble en agua. Sin
embargo, requiere bacterias con altos niveles de metabolismo aeróbico y exhibe
variabilidad intra e interespecies debido a la heterogeneidad del biofilm.
• El tinte de resazurina, también conocido como alamarBlue (AB), emite
fluorescencia y se puede medir mediante espectrofotometría. De hecho, la
resazurina es un indicador redox azul no fluorescente que se reduce al
compuesto fluorescente rosa resorufina a través de la respiración celular.
• El cloruro de 5-ciano-2,3-ditolil tetrazolio (CTC). Oxidado se disuelve en agua y la
cadena de transporte de electrones de las células metabólicamente activas
reduce el CTC a cristales de formazán fluorescentes. El tiempo de incubación y la
concentración de CTC afectan el número de células detectables, por lo que este
método es adecuado solo para estimar el número de células altamente
metabólicas activas y solo para sistemas aeróbicos o microaerófilos.
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• El ensayo de biotímero (BTA) mide el metabolismo estimando el tiempo

necesario para la visualización del cambio de color de indicadores específicos
(rojo fenol y resazurina) con respecto a la concentración bacteriana inicial según
las curvas de correlación para bacterias planctónicas. El BTA es una herramienta
colorimétrica bastante simple y conveniente para la determinación de la
susceptibilidad de la biopelícula sin requerir un equipo de laboratorio particular.
• El diacetato de fluoresceína (FDA) emite fluorescencia amarilla una vez que es
hidrolizado por esterasas. Aunque se utiliza para medir de forma reproducible la
actividad microbiana y la biomasa de biopelículas, no puede penetrar
profundamente en biopelículas gruesas.
Federico Villarreal
ENFOQUE DE "MOLER Y ENCONTRAR" A TRAVÉS DEL

ANÁLISIS MOLECULAR
 Los enfoques basados en la PCR pueden utilizarse para interrogar las diferencias
de expresión genética que se producen entre las especies de vida libre y las sésiles.
 Las secuencias del genoma de las proteínas de adhesión, las enzimas que penetran en
los tejidos y las toxinas se han estudiado ampliamente en el caso de los
colonizadores humanos que forman biofilms (enterococo, A. baumannii y K.
pneumoniae)
 La qPCR en tiempo real, examina un subconjunto de genes de las células
biofilmadas.
 La PCR multiplex detecta múltiples secuencias objetivo y es una herramienta útil
para el análisis genético de las comunidades polimicrobianas/multiespecies o
polimorfismos de genes.
Federico Villarreal
 La detección y cuantificación del producto de la PCR se basa en química de la

sonda.
 Los análisis de secuenciación de ARN proporcionan una mayor sensibilidad e
información relativa a los pequeños ARN no codificantes que participan
activamente en los procesos disbióticos de los patógenos orales.
 Los análisis transcriptómicos basados en el análisis de secuenciación del ARN
han proporcionado una multitud de genes asociados a la formación de biofilmas
por parte de especies bacterianas tanto Gram-positivas como Gram-negativas en
entidades clínicas.
 Los análisis de ARN-seq revelaron la proporción de la subpoblación de células
latentes dentro de la biomasa bacteriana de S. epidermidis y la coexistencia de
especies bacterianas desconocidas en la patogénesis de la cavidad oral.
Federico Villarreal
DETECCIÓN DE
GENES
RELACIONADOS
CON EL BIOFILM
Federico Villarreal
Federico Villarreal
La proteómica ha aportado al:

• Dar a conocer los determinantes del perfil proteico que regulan las interacciones
entre el huésped y el patógeno, así como los rasgos de virulencia y
patogenicidad de las bacterias amenazantes
• Responder a preguntas sustanciales sobre el fenotipo de resistencia
antimicrobiana de la biopelícula
• Fundamentar las diferencias fisiológicas con respecto a las especies
planctónicas.
El uso combinado de la proteómica con la EM fue un enfoque de mapeo adecuado

en un estudio histórico sobre el proteoma microbiano y el microbioma humano
 La metaproteómica ofrece la posibilidad de dilucidar las firmas metabólicas de
los biofilms multiespecies, incluso para las bacterias no cultivables que residen
dentro de los biofilms pero que no pueden cultivarse por medios
microbiológicos clásicos, lo que podría proporcionar nuevas herramientas para
el diseño de fármacos.
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La resonancia magnética nuclear de hidrógeno (1H-NMR):
 Se ha utilizado para el análisis de la composición química proteómica de los biofilms

 Presenta una amplia aplicabilidad a las comunidades de una y varias especies.
 Permite el análisis de componentes químicos principales, lo que apoya la
identificación de características clave entre las especies planctónicas y de biofilms de
S. aureus susceptibles a la meticilina (MSSA).
Las propiedades estructurales y morfológicas también se caracterizan por C-NMR, que

agrupa grupos de carbono de una sola muestra de ECM (contenido protéico de los
biofilms de Vibrio cholerae)
Espectroscopia de correlación total- RMN: Sirve para la detección de componentes

poliméricos en solución y de carbohidratos en biofilms de S. epidermidis
Federico Villarreal
MODALIDADES DE IMAGEN PARA VISUALIZAR LA ARQUITECTURA

COMUNITARIA
Microscopia óptica
 FISH: Utiliza sondas de ácidos nucleico que se unen a secuencias de ARN o ADN
dentro células bacterianas individuales.
Detecta todos los microorganismos viables, incluidos los no cultivables.
 IF: Emplea anticuerpos marcados con fluorescencia que se unen a antígenos diana
específicos y detectan tipos de células o subcomponentes celulares que determinan la
expresión en las fases de desarrollo del biofilm
 Las sondas fluorescencia y la FCS, combinadas con la CLSM, permiten cuantificar
la difusión de las biopelículas y evaluar su grosor.
 La tomografía de coherencia óptica (OCT) ofrece imágenes de biofilm in vivo en
tiempo real y en 3D, ideales para el desarrollo de la estructura de la biomasa y la
identificación de la porosidad.
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Microscopia electrónica y de rayos X

• TIPOS:
1. Microscopia electrónica de transmisión (TEM)
Tiene una alta resolución para visualizar componentes estructurales específicos :
fibrillas de polisacáridos y ADN extracelular
Si es combinado con la tinción rojo de rutenio , se revela las características
morfológicas de las células bacterianas dentro de una matriz fibrosa .
2. Microscopia electrónica de barrido (SEM)
Se aplica para el análisis de la estructura y función de la biopelículas (morfología,
densidad del glucocálix y espesor de la capa) en superficies vivas como en
materiales inanimados.
Variantes : • SEM ambientas (ESEM)
• Cryo-SEM
• SEM-atmosférico(ASEM)
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• ESEM No necesita una preparación muy laboriosa de la muestra para su

visualización y facilita la obtención de imágenes de polímeros de células externas.
Desventaja: resolución espacial disminuida.
• Cryo-SEM Es preciso para muestras frágiles, preserva la hidratación y ofrece
una congelación ultrarrápida (muestras nos solidas).
• SEM atmosférico (ASEM)  Combinado el etiquetado de metales pesados, el
etiquetado de nano oro cargado y el inmunomarcaje, lo que permite visualizar
nanoestructuras de la interfaz biofilm-superficie de líquidos.
3. Microscopía de rayos X de transmisión por barrido (STXM)

Proporciona datos de la distribución espacial.
Análisis cuantitativos y cualitativos de los componentes de la biopelícula,
diseccionando así la heterogeneidad de las comunidades microbianas.
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Microscopía de sonda de barrido y espectrometría de

masas de imágenes
1.- La microscopía de fuerza atómica (AFM)
Capacidad de sondeo físico y estructural de la superficies celular microbiana.
Aplicación: Visualización de la estructura de la biopelícula y la detección de
interacciones fisicoquímicas entre células microbianas y varias superficies.
Investigación de la biopelícula de P.aeruginosa en sustratos superficiales.
2.- La espectrometría de masas de imágenes por ionización con desorción láser
asistida por matriz (MALDI-IMS)
Proporciona la distribución molestar espacial para cada molécula identificada
dentro de la biomasa.
Genera una gran cantidad de datos para desarrollar bases de datos “ huellas
químicas”.
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3.- La espectrometría de masas de iones secundarias (SIMS)

Proporciona la mayor profundidad y resolución espacial.
No requiere el uso de una matriz para obtener información espacial.
Cuando se complementa con MALDI método proporciona identificación y ubicaciones
específicas de proteínas y otras especies químicas, diferencias químicas macroscópicas y a nivel celular,
discriminación basada en la masa de moléculas similares y la distribución espacio-temporal de metabolitos y
moléculas de señalización, incluso para múltiples especies. Proporciona un mapeo químico in situ.
Obtención de imágenes in situ de muestras biológicas

completamente hidratadas.
Sondas definidas que permitan una combinación de
técnicas de imagen para una mejor resolución y
estructura 3D.
FUTURO DE LA Herramientas de software actualizadas las demandas
VISUALIZACION DE de análisis de imágenes de biopelículas digitales.
BIOPELICULAS
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MODELADO DE BIOFILMS EX VIVO

• Implican el crecimiento de biopelículas en tejido natural en un
entorno mínimamente alterado, lo que ofrece condiciones
experimentales mas estrictamente controladas para una investigación
exhaustiva que las de los modelos in vivo.
• Contribuyen al desarrollo de herramientas de imágenes eficaces que
pueden monitorear el establecimiento de bacterias especificas de
tejido . Ejm: Explantes de piel porcina infectados con S.aureus y
P.aeruginosa
• Son útiles para evaluar ventanas terapéuticas de tratamientos
experimentales con antibiofilm.
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Se encontró que las biopelículas formadas dentro de las primeras 24 horas
eran mas susceptibles a los antibióticos que las formaciones madura,
validando las estrategias terapéuticas actuales que apuntan a la profilaxis
temprana de heridas
La eficacia comparativa de la glicina y el fosfato tricálcico (TCP) sobre la de
la glicina o el bicarbonato de sodio en la eliminación de biopelículas se
examinó mediante el uso de un modelo ex vivo utilizando biopelículas
cultivadas en superficies de implantes de titanio (Ti) y circonio (Zr).
Se utilizó un modelo ex vivo de tejido valvular cardíaco porcino combinado
con microscopía electrónica para examinar los efectos de la sustancia de
agregación (Asc10) de la proteína de E. faecalis sobre la formación de
biopelículas y la persistencia en la endocarditis. Se descubrió que el Asc10
aumentaba la agregación celular, lo que aceleraba la formación de
biopelículas
Federico Villarreal
El patógeno respiratorio murino Mycoplasma pulmonis se utilizo

recientemente para el desarrollo de biopelículas de un sistema de montaje
de órganos del epitelio traqueal que se puede escanear con un microscopio
de fluorescencia.
Los modelos de formación de biopelículas de otitis, mucosas nasales y
faríngeas son sustratos adicionales para aplicaciones de modelos de
biopelículas ex vivo.
Un modelo de mucosa vaginal porcina (PVM) tuvo como objetivo investigar
las interacciones entre vaginales comensales Lactobacillus spp, la especie
anaerobia Gardnerella vaginalis y el organismo de transmisión sexual
Neisseria gonorrhoeae . El modelo cuantifico y desentraño diferentes
perfiles de lso efectos del ph, los acidos y Lactobacillus crispatus en el
crecimiento de G.vaginalis y N.gonorrhoeae cuando se utilizo una
superficie de mucosa vaginal viva.
Federico Villarreal
DISECCIÓN DE BIOFILMS IN VIVO

• Fin: Permite la disección de los determinantes de virulencia y
patogenicidad así como también la disección de los determinantes de
virulencia y patogenicidad , y la identificación de dianas terapéuticas
MODELOS DE ANIMALES NO VERTEBRADOS
• La aplicación de modelos animales no vertebrados ha proporcionado una
importante solución a la necesidad de investigar las infecciones asociadas a
la biopelícula.
Drosophila melanogaster Galleria mellonella Caenorhabditis elegans

Federico Villarreal
DROSOPHILA
Usado ampliamente para modelar heridas o infecciones epiteliales
por bacterias Gram –negativas
Metodología de estudio:
1. Pinchazo con aguja  Imitando la infección de la heridas
2. Alimentación  Imitando métodos de infección oral
3. Bombeo de inyección Imitando una infección sistémica similar a
la infección del torrente sanguíneo en mamíferos
Las respuestas innatas del huésped en Drosophila con P.aeruginosa
se conservan en gran medida en humanos , también se demostró que
existe una conservación notable en los factores de virulencia
utilizados por las bacterias para infectar tanto Drosophila como a
mamíferos .
Federico Villarreal
Los modelos Drosophila siguen siendo herramientas valiosas

para explorar los determinantes moleculares de biopelículas.
Dos factores de adherencia necesarios para la virulencia in
vivo de P.fluorescens son : amd (codifica la enzima GDP-
manosa deshidratasa), homologo del fadL (implicado en el
transporte de ácidos grasos de cadena larga) .
D.melanogaster ha servido como modelo para el estudio de
la correlación funcional de los miembros de la familia de las
paraoxonasas con la formación de biopelículas. Esta
correlación ha demostrado el papel protector de la enzima
humana paraoxonasa en la inmunidad innata.
Federico Villarreal
Galleria mellonella
Proporciona una alternativa ventajosa desde el punto de vista competitivo
frente a otros huéspedes en cuanto a tamaño y aptitud para la evaluación
de tratamientos antimicrobianos
Se emplea orugas larvarias a las cuales se inyectan con bacterias en el
hemocele a través del ultimo prolego izquierdo.
La polilla de cera ha facilitado el cribado de una biblioteca aprobada para
la FDA para identificar compuestos de antibiofilm contra Francisella
novicida
Tambien se ha utilizado para modelar la formación de biopeliculas por
Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia, Burkholderia multivorans y
Campylobacter spp.
Se ha aplicado para la evaluación de las actividades antibacterianas y
antibiofilm de estrategias terapéuticas alternativas contra una multitud de
patógenos
Federico Villarreal
Nematode C.elegans
Nematodo de vida libre a sido usado para modelar infecciones por la
mayoría de las bacterias Gram negativas : E.coli, Burkholderia
pseudomallei, P.aeruginosa y Yersenia pseudotuberculosis.
Proporciono información sobre la identificación de los roles de los
factores de virulencia de biopelícula como la lactona acil-homoserina
autoinductor-dependiente , el regulador de la biosíntesis de fenazina
y las lipoproteínas asociadas a la superficie del fago Q (hfa) del factor
huésped.
Federico Villarreal
MODELOS ANIMALES VERTEBRADOS
Pez cebra (Danio rerio) Se ha descrito la formación de biopelículas en modelo de ratón para:
 Una infección de herida murina por A. baumannii persistente con múltiples

Se ha aplicado para la obtención de imágenes de
fármacos para evaluar soluciones terapéuticas contra traumatismos e infecciones
biopelículas de P. aeruginosa y para la cuantificación de la
quirúrgicas en pacientes hospitalizados
formación de biopelículas del patógeno de peces
bacteriano Edwardsiella tarda y el patógeno de cerdo
Streptotoccus suis. También para estudiar Mycobacterium  Ratones BALB/c y C3H/HeN para estudiar establecimiento de infección crónica de
haemophilum y para evaluar la adhesión de patógenos por heridas por P. aeruginosa después de una quemadura de tercer grado con necrosis
vía oral en un modelo orintestinal de vertebrados. cutánea.
Federico Villarreal
TERAPIA FOTODINAMICA
ANTIMICROBIANA (aPDT) MODELO DE RATA MODELO DE RATON
Se utilizan constantemente debido a su facilidad Emplean jaulas de tejido e infección de catéter

para la colonización de la herida y el sitio de pueden proporcionar información sobre la
Se ha aplicado contra una variedad de patógenos
infección sin el requisito de factores eficacia antimicrobiana de los recubrimientos de
implicados en infeccione asociadas a biopelículas perturbadores, lo que permite una correlación biomateriales y las interacciones huésped-
agudas y crónicas. Para probar la eficacia de la con la edad de la rata, la ubicación de la herida y patógeno.
fotosensibilización, se han aplicado varios modelos el tamaño del inoculo.
animales. Los modelos de heridas de ratón, rata y
cerdo, osteomielitis y artritis, así como modelos En el campo de las infecciones asociadas a
de infección dental en perros, revelaron el dispositivos implantados, un modelo importante
implica puertos de acceso venoso totalmente
potencial terapéutico de la TFD contra patógenos,
implantables (TIVAP) implantadas en ratas. Este
incluidos estreptococos, MSSA, MRSA, P.
modelo permite monitorear el desarrollo de
aeruginosa, A. baumannii, P. gingivalis y
biopelículas bacterianas, fisiología y estrategias de
Fusobacterium nucleatum prevención mediante el uso de inoculos de cuatro
patógenos bioluminscentes, incluidos S. areus, S.
epidermidis, E. coli y P. aeruginosa. Mediante el
uso de un modelo de rata con dispositivo
permanente se encontró un efecto inhibidor de la
interrupción de QS a través del péptido inhibidor
de RNAIII (RIP) en las infecciones por S.
epidermidis
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 Se utilizo un modelo de rata de osteomielitis aguda por cuerpo extraño para evaluar el
IMPLANTES DE TITANIO
papel de E. faecalis ahrC y eepgenes en la formación de biopelículas y virulencia. Donde
se inocularon alambres ortopédicos de acero inoxidable con mutantes isogenicos
Ω ahrC y Δ eep de E. faecalis OG1RF y se implantaron en las tibias proximales de ratas.
Se ha utilizado para examinar los efectos
inhibidores y profilácticos de los recubrimientos
de gentamicina sobre superficies de oxido de
 En un modelo de osteomielitis murina asociada a S. aureus, se empleo una placa de
tinanio. Asimismo, se han desarrollado modelos
fijación para el desbridamiento de la fractura durante una cirugía de revisión, seguido de
de osteomielitis murina para controlar respuestas
la colocación de un implante cargado de vancomicina. El control de la infección se logro
inmunitarias que se producen durante la infección
mediante imágenes de bioluminiscencia, rayos X y micro tomografía computarizada (μCT)
y curación por S. aureus, después de la colocación
para la evaluación tanto de la osteolisis como de la formación ósea.
de implantes y fracturas óseas.
 Se desarrollo un modelo de infección por MRSA en jaula implantable utilizando cobayas

albinos machos, y se evaluó la eficacia del tratamiento contra las infecciones planctónicas
y de biopelículas para los agentes antimicrobianos prescritos con mayor frecuencia. Las
pruebas antimicrobianas concluyeron con una combinación optima de fosfomicina y
rifampicina contra las infecciones por MRSA asociadas a implantes. Los conejos también
se han utilizado en modelos de infecciones por S. aureus de implantes espinales para
evaluar el potencial antimicrobiano de los recubrimientos de tornillos pediculares de Ti
modificados, así como la eficacia de los fármacos antiestafilococicos de primera línea.
Federico Villarreal
 Se desarrollo un modelo de inhalación murino para conectar el transporte

Se utilizo los modelos de ratón para el estudio de la colonización
nasofaríngeo crónico de P. aeruginosa con la infección pulmonar, que
gastrointestinal y la formación de biopelículas identificando la importancia
complica y aumenta la resistencia a los agentes terapéuticos.
del estricto regulador de respuesta DksA para la patogenicidad, virulencia y
 En un modelo de CF de ratón de coinfeccion por P. aeruginosa y S. aereus,
formación de biopelículas de Sallmonella. Durante las primeras etapas de la
se encontró que los aislados de P. aeroginosa superan a S. aureus en las
infección por S. Typhimurim, la DksA se induce en el midcecum murino y es
primeras etapas de la infección crónica. Además, se probo el potencial
necesaria para la infección sistémica.
terapéutico de la amikacina liposomal inhalada en un modelo de infección
pulmonar de rata por P. aerugionosa. Las biopelículas de P. aeruginosa
formadas en tumores murinos también se han utilizado para examinar la
eficacia de ciprofloxaxina, colistina, tobramicina y sus combinaciones.
Asimismo, se demostró la contribución de otras especies bacterianas a la
colonización gastrointestinal temprana mediante el uso de un modelo de
ratón de Clostridium difficile colon y mucus ciego con aplicación FISH.
También se han aplicado modelos de ratón para imitar las IU asociadas a

biopelículas, así como para evaluar la correlación entre el sistema
inmunológico del huésped y los factores de defensa locales, la infección
atribuida y el tratamiento. Los modelos futuros de UTI pueden utilizar
quimeras humano-raton basadas en ratones inmunodeficientes combinados
graves para lograr una mejor compatibilidad con las condiciones humanas.
Federico Villarreal
En un esfuerzo de detección para identificar un hospedador

optimo para monitorear. Aggregatibaacter
actinomycetemcomitans, la principal causa de periodontitis en
humanos, los monos Rhesus RH se clasificaron como la primera
opción. Los monos Rh proporcionan un hábitat oral establecido
para validar la periodontitis mediada por A.
actinomycetemcomitans.
 Los monos Rh también se han probado para determinar la

expresión génica de la apoptosis mediada por la edad en los
tejidos de la mucosa oral. El análisis transcriptomico de la
expresión génica apoptótica refleja una disminución de los Se utilizo un modelo de rata de periodontitis inducida por A.
fenómenos apoptóticos en la mucosa oral de los animales actinomycetemcomitans se combino con RT-PCR para aplicaciones versátiles, que
envejecidos que, en consecuencia, pueden aumentar la van desde la reducción genética hasta la evaluación de la eficacia terapéutica
desregulación de las respuestas antiinflamatorias e inducir la según las variaciones de exopolisacaridos. Otro modelo de rata, el modelo de
enfermedad. biopelicula extraradicular in vivo, es mas inclusivo, ya que puede facilitar la
identificación y cuantificación de bacterias formadoras de biopelículas mediante
el uso de PCR en tiempo real y tomografía microcomputada.
Federico Villarreal
 Las chinchillas (chinchilla lanígera) se han empleado para el estudio de las

infecciones del oído medio en un intento de establecer modelos de infección
realistas, superar las limitaciones en el análisis de biopelículas y correlacionar
la secuencia de eventos en las infecciones polimicrobianas con el sistema
inmunológico del huésped. Se implemento un modelo de otitis media de
chinchilla que involucraba un aislado NTHi 86-028NP y un mutante isogenico
de fosforilcolina (Pcho) transferasa (licD) para demostrar que Pcho facilita la
estabilidad de la biopelicula y alivia la respuesta inmune del huésped,
promoviendo la infección por NTHi y aumentando la persistencia.
 Un modelo de otitis de conejo examino la eficacia de un recubrimiento de

implante de oído medio nanoporoso que libera cirpofloxacina contra P.
aeruginosa.
 En otro estudio, se utilizo un modelo animal de cobaya combinado con
otoendoscopia, histologiay TC osea para examinar el efecto inhibidor de una
estera de nanofibras liberadoras de vancomicina contra las biopelículas de
MRSA formadas en protesis osiculares e infecciones del oído medio.
Federico Villarreal
HERRAMIENTAS DE IMAGEN IN VIVO
Las imágenes de bioluminiscencia aprovechan los vectores

de clonación bacteriana optimizados para permitir la
 La bioluminiscencia combinada con un modelo de puerto de acceso venoso totalmente
expresión de luciferina en diferentes células bacterianas.
implantable se ha utilizado para evaluar infecciones localizadas y sistémicas relacionadas
Como resultado, estas células microbianas “brillan en la
con CVC en rata, reproduciendo situaciones clínicamente significativas de infecciones
oscuridad” y una cámara de imágenes sensible es capaz de
asociadas a cuerpos extraños. Estos modelos han sido valiosos en la investigación de
capturar imágenes de animales pequeños, revelando tanto
aPDT, que implica tintes fotosensibilizantes aplicados tópicamente al sitio de infección y
la ubicación como la intensidad de los microorganismos
la generación de especies reactivas de oxigeno (ROS).
infectantes en tiempo real, de una manera no invasiva.
 Las imágenes de bioluminiscencia de infecciones localizadas no solo es muy adecuada

para monitorear la eficacia de terapias antimicrobianas experimentales, sino que también
tienen un papel importante en el estudio de la virulencia y patogenicidad microbianas.
 La tecnología de bioluminscencia se ha expandido para incluir imágenes en tres
dimensiones para infecciones de biopelículas que de otra manera serian un desafío para
monitorear y tratar.
Federico Villarreal
 Las sondas moleculares de fluorescencia del infrarrojo cercano se han

administrado mediante inyección local y se han utilizado para visualizar
la inflamación y las infecciones de biopelículas relacionadas con los
implantes de una manera rápida y mínimamente invasiva, con el
objetivo de detectar infecciones relacionadas con la ortopedia.
 La sonda de hidro-sulfoCy5 detecta la generación de ROS después de la

aplicación de un implante libre de bacterias o que contiene biopelicula.
Por otro lado, se utilizo sulfonato de diaminocianina para detectar la
producción de oxido nítrico asociada a la biopelícula.
 El tinte C-SNARF-4 junto con la imagen radiométrica permitió la

visualización 3D en tiempo real de la variación del pH extracelular en el
crecimiento de las biopelículas dentales.
La OCT 3D no invasiva se pude utilizar para identificar y visualizar, en tiempo real,
microcomunidades bacterianas in vivo implicadas en la otitis media asociada a
 Los agentes de contraste de ultrasonido (UCA) dirigido a ligandos, junto biopelículas. La OCT se ha combinado con interferometria de baja coherencia para
con microscopia óptica y acústica de alta frecuencia, han facilitado la obtener imágenes de la capa de biopelícula en la membrana timpánica sensible y
detección, visualización y cuantificación de matrices de biopelículas de ultrafina del oído medio. Otra técnica óptica, OCT de fuente de barrido de
S. aureus en cultivos de superficie ajustados en tubos de ensayo y en polarización cruzada intraoral (CP-OCT), proporciono una herramienta adicional para
modelos animales. visualizar la densidad in vivo de la biopelicula formada entre el esmalte y la interfaz.
Federico Villarreal
Finalmente, se aplico una combinación de bioluminiscencia-fluorescencia que contiene una cepa

 De manera análoga, se uso tomografía electrónica de micro-
de S. aureus bioluminiscente emisora de luz natural y neutrófilos fluorescentes de una cepa de
positrones junto con la sonda radiactiva fluoro-desoxiglucosa
ratón que expresa proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) (LysEGFP) para la visualización de
para monitorear infecciones por biopelículas de S. aureus y
una infección del sitio quirúrgico en la articulación de la rodilla en un modelo de ratón. Se
terapia antimicrobiana en un modelo de ratón.
utilizaron imágenes de bioluminscencia in vivo para cuantificar la carga microbiana. En
consecuencia, in vivo se utilizaron imágenes de fluorescencia para evaluar la respuesta
inflamatoria de los neutrófilos. En los mismos ratones, las imágenes ópticas de biolumiscencia y
 Las modalidades de imágenes ópticas, radiográficas y de μCT fluorescencia combinadas con imágenes μCT permitieron la visualización de detalles anatómicos
se han utilizado como herramientas para monitorear las en 3D. Esta combinación de imágenes triples se propuso para rastrear simultáneamente las
infecciones de biopelículas de implantes ortopédicos infecciones de biopelículas óseas, incluidas las respuestas inflamatorias y las modificaciones
longitudinalmente, para evaluar la carga bacteriana y para anatómicas locales, de manera no invasiva.
detectar la osteolisis.
 Las imágenes de resolución multiple junto con el etiquetado

in vivo revelaron las tareas complementarias de los
componentes de la matriz de las biopelículas de V. cholerae.
 Las sondas de imágenes basadas en maltodextrina (MDP),
una familia de agentes de contraste emisores de luz
acompañados de maltohexaosa, permiten in vivo detección
bacteriana con una capacidad de respuesta primordial a
través de un mecanismo especifico de la célula.
Federico Villarreal
Federico Villarreal
Federico Villarreal
Federico Villarreal
Federico Villarreal
Federico Villarreal
Federico Villarreal
Federico Villarreal
Federico Villarreal
• MIS CONCLUSIONES
• El biofilm es una comunidad e microorganismos que crecen en una
matriz de exopolisacaridos y están adheridos a una superficie inerte o
un tejido vivo.
• Son responsables de la mayoría de infecciones por el uso de
catéteres, u otros equipos invasivos.
• Una de las funciones del biofilm es la protección contra los
antimicrobianos
• Se utilizan métodos de coloración para observarlos primordialmente.

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