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_TINCIONES

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TINCIONES HEMATOLÓGICAS CONTENIDOS 1. Concepto 2. Tipos de tinciones: 2.1. 2.2.

Tinciones vitales y no vitales tinciones habituales y especiales

3. Denominación de las estructuras coloreadas 4. Causas de error en las tinciones habituales de frotis sanguíneos Práctica n° VIII: Tinción de Giemsa Práctica n° IX: Tinción de Wright Práctica n° X: Tinción panóptico rápida.

1. CONCEPTO Las tinciones hematológicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloración de las estructuras que componen las células sanguíneas. Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y permite por tanto que las células sean visualizadas microscópicamente con mayor facilidad. 2. TIPOS DE TINCIONES Las tinciones hematológicas pueden clasificarse según distintos criterios: • Atendiendo al nivel de vitalidad de las células que se pretenden colorear, se dividen en tinciones vitales y no vitales.

Atendiendo a su frecuencia de realización en el diagnostico hematológico cotidiano, se dividen en tinciones habituales y especiales.

2.1. Tinciones vitales y no vitales Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre células que están vivas. Son colorantes vitales, por ejemplo, las sales de tetrazolio y el verde Jano. Las tinciones no vitales se realizan sobre células muertas. La coloración de células muertas requiere un proceso previo de fijación, que tiene por objeto el conservar inalterada la estructura de las células y el adherir a éstas firmemente a la superficie del porta. La fijación puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se realiza con etanol o metanol. 2.2. Tinciones habituales y especiales Las tinciones habituales se logran generalmente mediante el uso de colorantes derivados de la anilina. Estos se reúnen en 3 grupos. • Colorantes ácidos: tienen una especial afinidad con las estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la hemoglobina. El principal de ellos es la eosina. • Colorantes básicos: tienen una especial afinidad con las estructuras ácidas de las células, como por ejemplo los ácidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno. • Colorantes neutros: son sales de un ácido y de una base coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. Uno de ellos es el eosinato de azul de metileno. • Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad con estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y tiñen a aquellas sustancias que tiene un poder de disolución superior al del líquido empleado para prepara la solución colorante.

Uno de ellos es el Sudán III empleado para teñir las grasas. También hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones policromas. Una coloración es panóptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras y es pancrómica se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas. El primer que tuvo la idea de realizar una de estas combinaciones fue Romanowsky, y los colorantes hematológicos utilizados en la actualidad suelen derivar del que él preparó. Los colorantes de tipo Romanowsky, que más frecuentemente se emplean, son la de Wright y la de Giemsa (utilizada sola o en combinación con la de May-Grunwald). También hay tinciones panóptica rápidas que producen una coloracion fácil y rápida de las estructuras celulares. Las tinciones especiales sólo se usan en circunstancias especificas. Son de dos clases. • Tinciones fluorescentes: emplean colorantes (fluorocromos) que se fijan a las células y que, cuando son estimulados por una luz ultravioleta, emiten una radiación visible, de un color característico. Los fluorocromos más utilizados en esta clase de tinciones con el naranja de acridina y el rojo neutro. • Tinciones citoquímicas: demuestran la presencia, más o menos abundante, o la ausencia de determinadas sustancias, localizadas en el interior de los gránulos citoplasmáticos de los leucocitos. Sirven para reconocer células leucocitarias (normales o anómalas) y, por tanto, para diferenciar unas clases de leucemias de otras. Por ejemplo, un colorante preparado a base de diaminobenzidina y de agua oxigenada, descubre la presencia de peroxidas endocelular, y por consiguiente permite atribuir el origen de unas células leucocitarias inmaduras a la línea granulocítica o a la monolítica.

3. DENOMINACION DE LAS ESTRUCTURAS COLOREADAS Atendiendo a sus apetencias tintoriales, las estructuras celulares pueden nombrarse de las siguientes formas: • Estructuras acidófilas u oxífilas: son aquellas que fijan colorantes de naturaleza ácida. Si el colorante ácido que captan es la eosina, se dice que son eosinófilas. Con las tinciones habituales adquieren un color rosado. • Estructuras basófilas; son aquellas que fijan colorantes de naturaleza alcalina. Con las tinciones habituales adquiern un color azulado. Si se tiñen de lila o púrpura con colorantes de tipo azur, se llaman azurófilas. 4. CAUSAS DE ERROR EN LAS TINCIONES HABITUALES DE FRONTIS SANGUINEOS Si la tinción de una extensión sanguínea es demasiado rosa, probablemente se deba a: • • • Un pH bajo del colorante. Un tiempo de coloración insuficiente. Un lavado excesivamente prolongado. Si la tinción es demasiado azul, posiblemente, esté causado por: • • • • Un grosor excesivo de la extensión. Un pH alto del colorante. Una coloración excesivamente prolongada. Un lavado insuficiente. Si tras la tinción, aparecen artefactos o/y precipitados en la extensión, probablemente, se deba a: • Un empleo de portas sucios.

• • • •

Una falta de filtración del colorante. Una coloración excesivamente prolongada Un secado del colorante durante la tinción. Un lavado insuficiente.

Muchos de estos errores pueden obviarse utilizando teñidores automáticos de las extensiones sanguíneas. Uno de estos teñidores automáticos es. Por ejemplo, el Hematek de los laboratorios Bayer. TINCIÓN DE GIEMSA INTRODUCCIÓN Las tinciones hematológicas tipo Romanowsky utilizan azul de metileno y sus productos de oxidación (azur A, Azur B y azur C) como colorantes básicos, combinándolos con la eosína como colorante ácido. De este modo obtenemos una tinción diferencial, es decir, que es capaz de diferenciar distintas estructuras celulares según se tiñan con el colorante ácido, básico o con la mezcla de ambos. Según la proporción de azul de metileno y eosina que compongan el colorante tendremos distintos métodos de tinción. Entre ello, los más conocidos son el método de Gemsa, de Wright, de Leishman y el panóptico de Pappenheim. METÓDICA Es un extracto de las técnicas de tinción hematológicas de la casa Panreac. Fundamento Utilizamos como colorante la mezcla de azul de metileno y eosina propuesta por Giemsa. Material necesario

• • • • • • • Reactivos • • • • Muestra

Microscopio óptico Portas bien limpios Cristalizador Puentes de tinción Pipetas Pasteur con chupete Frascos lavadores Tubos de ensayo

Colorantes en solución según Giemsa de Panreac Solución tampón pH 7,2 de Panreac Metanol Aceite de inmersión.

Sangre capilar fresca o vanosa anticoagulada. El anticoagulante de elección es la heparina o el EDTA, ya que el citrato sódico y el oxalato potásico pueden dar preparaciones defectuosas. Técnica Preparamos una frotis sanguíneo según la técnica descrita e la práctica n° VII. Colocamos el frotis sobre el puente de tinción en el cristalizador en posición horizontal. Cubrimos con metanol durante 3 minutos. Escurrimos y dejamos secar al aire. Con esto procedemos a fijar el frotis. Diluimos en el tubo de ensayo 0,2 ml de azur-eosina-azul de metileno según Giemsa con 2 ml de solución tampón pH 7,2. es importante realizar esta dilución en el momento de la tinción, ya que el colorante precipita y no es válido para otro día. Mezclamos suavemente en el tubo y con una pipeta Pasteur cubrimos el frontis dejando actuar durante 25 minutos.

Escurrimos y lavamos con agua del grifo. Posteriormente lavamos con tampón pH 7,2 hasta eliminar los restos del colorante. Dejamos escurrir y secamos en posición vertical (véase figura 4.VIII.1) Lectura de resultados Una vez seca la tinción, echamos una gota de aceite de inmersión y examinamos al microscopio óptico con el objetivo de 100x. Los eritrocitos se tiñen de color rosa asalmonado y las plaquetas de color violeta. Los neutrófilos presentan el núcleo de color azul violeta, el citoplasma rosa y la granulación de un color violeta rojizo.

Figura 4.VIII.1. Tinción de Giemsa Los eosinófilos se observan con el núcleo azul violeta, el citoplasma azul y los gránulos de color rojo anaranjado. Los basófilos presentan un núcleo de color púrpura y granulación de color azul oscuro. Los monolitos y linfocitos se observan con un núcleo color violeta y el citoplasma azul, un poco más claro en el monolito. 1° ¿Cuáles son los anticoagulantes más adecuados para esta técnica? 2° ¿Con qué reactivo fijamos el frotis?

3° ¿Cuánto tiempo debe actuar el colorante en el frontis? Resultados obtenidos Dibuje las células observadas con colores semejantes a los que ha visto en el microscopio. TINCIÓN DE WRIGHT METÓDICA Extracto de las técnicas de tinción hematológicas de las casa Panreac. Fundamento El colorante utilizado es una solución de eosina y una mezcla de azul de metileno (del 50 al 75%) y azur B (del 10ª 25%) junto con otros derivados del alcohol metílico. Dada la presencia de metanol en la composición del colorante, no es necesario un paso previo de fijación antes de la coloración. Sólo si se van a guardar las extensiones sin teñir de un día para otro precederemos a su fijación para evitar el deterioro del frotis. Material necesario • • • • • • • Reactivos Microscopio óptico Cristalizador Puentes de tinción Pipetas Pasteur con chupete. Frasco lavador Guantes Tubos de ensayo.

• • • Muestra

Solución de eosina-azul de metileno según Wright. Solución tampón pH 7,2 Aceite de inmersión.

Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. Los anticoagulantes más adecuados son la heparina y el EDTA. Técnica Realizar un frotis sanguíneo muy fino. Dejar secar al aire. Sobre la extensión colocada horizontalmente en el puente de tinción verter 1ml de eosina – azul de metileno. Dejamos actuar un minuto y lavamos con solución tampón pH 7,2. Dejamos escurrir y se4car en posición vertical. Inmediatamente antes de su empleo y en un tubo de ensayo, diluimos 0,5 ml, de eosina - azul de metileno con 0,5 ml de solución tampón pH 7,2. Mezclamos bien y cubrimos con esta dilución la extensión. Teñimos durante 3-5 minutos y lavamos con agua del grifo volvemos a lavar con solución tampón pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posición vertical (véase figura 4.IX,1).

Figura 4.IX.1. Tinción de Wright.

Lectura de resultados Depositamos una gota de aceite de inmersión y observamos con el objetivo de 100x. Las células se observan coloreadas de la misma manera que con la tinción de Giemsa. 1° ¿Qué tipo de colorante utilizamos en esta tinción? 2° ¿Qué sustancia empleamos como fijador? 3° ¿Cuánto tiempo debe estar en contacto el frotis con el colorante diluido? Resultados obtenidos Dibuje las células observadas coloreando adecuadamente las características morfológicas de cada una. TINCIÓN PANÓPTICO RÁPIDO METÓDICA Extracto de la técnica Panóptico rápido de la casa QCA Fundamento Este método de tinción diferencial es un sistema que aúna la policromía y la calidad que proporcionan los métodos clásicos (Giemsa y Wright) con una gran rapidez de ejecución (15 segundos solamente). Frente a las técnicas de tinción descritas anteriormente, donde el colorante se extendía sobre el frotis, ésta presenta la peculiaridad de ser un método de inmersión donde el frotis se sumerge en la solución colorante durante un tiempo determinado. Material necesario • • • Reactivos Cubetas de Wertheim o similares Cestillo para portas Frasco lavador.

• • • • Muestra

Solución n° 1: Solución alcohólica de triarilmetano. Solución n° 2: Solución tamponada de xanteno Solución n° 3: Solución tamponada de tiamina. Agua destilada

Frotis sanguíneo preparado recientemente que se ha dejado secar al aire. Técnica En tres cubetas de Wertheim o similares se disponen los colorantes solución n° 1, n°2 y n°3 (véase figura 4.X.1).

Figura 4.X.1. Cubeta de Wertheim y su tapa

Colocamos los frotis en el cestillos para portas y lo sumergimos en la cubeta con la solución n° 1 durante 1 segundo. Repetimos la inmersión cuatro veces (en total 5 segundos). Dejamos escurrir (véase Figura 4.X.2)

Figura 4.X.2. Cestillo para portas

Sumergimos a continuación otras cinco veces, cada una de un segundo de duración, en la cubeta con la solución n°2. Dejamos escurrir. Finalmente, sumergimos otras cinco veces de un segundo cada una en la cubeta con la solución n°3. Lavamos con agua destilada y dejamos secar. Lectura de resultados Depositamos una gota de aceite de inmersión sobre el frotis y observamos con el objetivo de 100 x. Las coloraciones obtenidas en las células sanguíneas son similares a las de la tinción de Wright y Giemsa. Sin embargo, podemos variar la intensidad de la tinción modificando el número de inmersiones en los colorantes n° 2 y n° 3, según se desee destacar las tonalidades rosas o las azules. * Notas sobre el método: • Las cubetas con las soluciones colorantes, especialmente la del n° 1, deberán guardarse siempre bien tapadas, a fin de evitar una evaporación excesiva que podría inducir a desviaciones de color respecto a las tinciones habituales. • Antes de agotar el contenido de una cubeta, debemos ir adicionando una nueva cantidad de solución colorante para mantener, día a día, un nivel apropiado. De vez en cuando se debe renovar todo el contenido de la cubeta. • En aquellos laboratorios con pequeño número de fórmulas hemáticas, las cubetas de Wertheim pueden ser sustituidas ventajosamente por pequeños frascos de cristal con tampón a rosca. 1° ¿En qué se diferencia este método de las otras tinciones clásicas? 2° ¿Cuántos segundos deben sumergirse el frotis en cada una de las soluciones? 3° ¿Cuál cree que es la solución fijadora?

Resultados obtenidos Dibuje las células observadas con sus colores correspondientes RECUENTOS CELULARES CONTENIDOS 1. Concepto 2. Recuentos en cámara 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. Material necesario reactivos muestra limpieza del material

3. Recuentos en contadores electrónicos 3.1. 3.2. Componentes de que consta un contador electrónico Métodos electrónicos de recuento celular 3.2.1. Método de la resistencia eléctrica o de la impedancia 3.2.2. 3.3. Métodos de la dispersión de la luz o de la difracción

Parámetros que determina un contador electrónico

Práctica n° XI: Visualización de una cámara de recuento. 1. CONCEPTO Los recuentos celulares son una serie de procedimientos que tienen por objeto determinar el número de cada uno de los tipos celulares que están comprendidos en una unidad de volumen de sangre (generalmente, en 1 mm3). Todos los recuentos celulares constan de 3 fases:

1° Dilución de la sangre. 2° Cómputo del número de células. 3° Cálculo matemático del número de células presentes en 1 mm3 de sangre. Los recuentos celulares pueden realizarse mediante métodos manuales (recuentos en cámaras) o automáticos (recuentos en contadores electrónicos). 2. RECUENTOS DE CÁMARA 2.1. Material necesario Cámara de recuento También se llama cámara cuentaglóbulos o hemocitómetro. Consiste en una placa gruesa de cristal con forma de porta, cuya porción central está divida en 3 bandas perpendiculares al eje longitudinal de la cámara. De ellas, las dos laterales se hallan sobreelevadas 0,1 mm con respecto a la central, y en una última hay grabado un retículo cuadrangular. La banda central puede estar, a su vez, subdividida en 2 semibandas idénticas y separadas por un surco paralelo el eje longitudinal de la banda. En cada una de estas dos semibandas hay grabado un retículo idéntico (véase figura 5.1).

Figura 5.1. Cámara de recuento. A = Visión superior (cámara con un retículo). B = Visión superior (cámara con dos retículos). C= Visión lateral.

Hay varios tipos de retículos, de los cuales los más utilizados son el de Burker, el de Thoma, y sobre todo el de Neubauer (Véase figura 5.2).

Figura 5.2. Cuadrados de los distintos tipos de retículos de recuento A = Cuadrado grande. B = Cuadrado mediano C = Cuadrado pequeño.

Cubreobjetos Preferiblemente, debe ser algo más grueso que los normalmente utilizados. Se coloca de forma que apoye sobre las dos bandas laterales de la porción central de la cámara. De esta manera queda delimitado un espacio entre la banda central y el cubre, en el que se deposita la muestra y cuyo espesor es de 0,1 mm. Algunas cámaras también constan de dos pinzas especiales que parten, cada una, de una de las porciones laterales de la cámara y que tienen por misión la de asegurar la fijación del cubre a la misma. Cuando está bien montado sobre la cámara, se observan unas irisaciones de colores entre las dos láminas de vidrio llamadas anillos de Newton. Pipetas diluidotas de Thoma

Son una pipetas especiales de cristal que constan de un largo tubo capilar graduado y de una dilatación ampular o bulbo. El tubo capilar termina en punta, a nivel de uno de sus extremos, y se continúa con el bulbo, a nivel del otro de sus extremos. Además está dividido en 10 partes iguale, y en su superficie están especialmente bien marcadas la 5° división (con un 0,5) y la 10° (con un 1). El bulbo contiene una perla de vidrio para facilitar la mezcla de la sangre con el liquido de dilución, y acaba en un tubo capilar corto. La perla de vidrio es roja en las pipetas empleadas para el recuento de hematíes, y blanca en las usadas para el recuento de leucocitos. Además, en as pipetas para hematíes la capacidad del bulbo es 100 veces superior a la del tubo capilar largo, por lo que en el tubo capilar corto hay una marca de 101, y en las pipetas para leucocitos la capacidad del bulbo es 10 veces mayor que la del tubo capilar largo, por lo que en el tubo capilar corto hay una marca de 11. Goma de aspiración Es un tubo de goma que permite la aspiración de la muestra y del líquido de dilución. Es uno de sus extremos tiene encajada una boquilla, y por el otro se ensambla al tubo capilar corto de cualquiera de las pipetas de Thoma (véase figura 5.3).

Figura 5.3. Pipetas diluidotas: A = pipetas para recuento de glóbulos rojos B = pipeta para recuento de glóbulos blancos.

2.2.

Reactivos

Liquido de dilución Hay varias clases Su composición varía según el tipo de células que se pretende contar. Los que se utilizan para el recuento de hematíes contienen cloruro sódico para hacerlos isotónicos* con respecto al plasma y evitar, de esta forma, la hemólisis. Pero algunos incorporan también anticoagulantes como el citrato de sodio, e incluso antisépticos como la formalina. Los que se emplean para el recuento de leucocitos contienen una sustancia, como el ácido acético glacial, que rompe los hematíes y un colorante, como el violeta de genciana, que tiñe el núcleo de los leucocitos. Los que se usan para el recuento de plaquetas pueden incorporar una sustancia hemolítica y un antigregante plaquetario. Los líquidos diluyentes más utilizados son el de Harem, para el recuento de hematíes, y el de Turck, para el recuento de leucocitos. 2.3. Muestra

Sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA. Esta sangre se utilizará convenientemente diluida. 2.4. Limpieza del material

Limpieza de las pipetas diluidotas Tras su uso, ha de ser aclarada con agua tibia y posteriormente debe secarse con un paño suave y limpio o dejándola al aire. Limpieza de las pipetas diluidoras Después de su empleo, tienen que lavarse interiormente de la siguiente forma: • Primero, haciendo pasar a través de ellas agua corriente, una vez. • Luego, haciendo pasar a través de ellas agua destilada, 3 veces

• Y, finalmente, haciendo pasar a través de ellas acetona o alcohol de 95°, otra vez Tras ello, ha de secarse su interior, preferentemente mediante un secado de aire. 3. RECENTOS EN CONTADORES ELECTRÓNICOS 3.1. Componentes de que consta un contador electrónico Disminuye la concentración de la sangre hasta el nivel adecuando para el funcionamiento del contador (generalmente diluye a 1/500 para el recuento de leucocitos, y a 1/50.000 para el de hematíes). Como líquidos diluyente utiliza una solución isotónica con capacidad conductora. Compresor - aspirador Aporta la presión y el vacío necesarios para transportar la sangre, convenientemente diluida, al dispositivo de medida. Dispositivo de medida Es la cámara donde se cuentan realmente las células sanguíneas. Su diseño depende del método de recuento utilizado por cada modelo de contador. Transductor Transforma las señales, procedentes del dispositivo de medida, en impulsos eléctricos. Suele ser un fotomultiplicador Discriminador Diferencia los impulsos eléctricos generados por cada uno de los tipos de células sanguíneas. Lector Recoge los datos obtenidos, los procesa y los proyecta en una pantalla. Registrador Imprime en papel los resultados conseguidos.

3.2.

Métodos electrónicos de recuento celular Es el utilizado por los primeros contadores, ya que fue descubierto por Coulter en 1956. Se basa en lo siguiente: • Mientras que las células sanguíneas conducen mal la electricidad, el líquido diluyente es un buen conductor de la electricidad (posee una gran conductividad eléctrica). • El dispositivo de medida consiste en un pequeño orificio, a través del cual se hace pasar la sangre diluida. Tiene colocados un electrodo a su entrada y otro a su salida. • • También se hace pasar una corriente eléctrica Si el orificio es atravesado solamente por líquido constante a través de ese mismo orificio. diluyente, la resistencia eléctrica medida por los electrodos es mínima y constante, pero cuando el orificio es atravesado por una célula sanguínea, se produce un aumento de la resistencia eléctrica y un cambio de potencial entre los electrodos. • El número de señales eléctricas generales indica el número de células presentes en la sangre y la amplitud de estas señales es directamente proporcional al volumen celular (véase figura 5.4).

3.2.1. Método de la resistencia o de la impedancia

Figura 5.4. Esquema de la dispersión de la luz o de la difracción

3.2.2. Métodos de la dispersión de la luz o de la difracción Método del campo oscuro El dispositivo de medida consiste en un capilar por el que circula la sangre diluida y que se atravesado por un haz de luz halógena. Cuando no pasan células a lo largo del capilar, el haz de luz incide sobre una zona no sensible (disco de campo oscuro); pero si una célula pasa a través del capilar, dispersa los rayos el haz luminoso hacia fuera del disco, donde son captados por un fotodetector. El número de señales lumínicas detectado indica el número de células presentes en la sangre, y la intensidad de la dispersión lumínica producida por cada una de ellas es directamente proporcional al tamaño de éstas (véase figura 5.5)

Figura 5.5. Esquema del dispositivo de medida basado en el método del campo oscuro

Método del rayo láser El dispositivo de media consta de un detector situado detrás de un capilar por el que circula un flujo continuo de sangre diluida; es pues un citómetro de flujo. Un rayo láser* atraviesa el capilar y se dirige hacia el detector. Cuando no pasan células a lo largo del capilar, el rayo láser incide sobre el detector, pero si una célula pasa a través del capilar, el rayo láser es interceptado por ella y deja de incidir sobre el detector. El número de interferencias indica el número de células presentes en la sangre, y el grado de interferencia que produce cada célula a su paso es directamente proporcional a su tamaño. En este método se basan, por ejemplo, los autoanalizadores Technicon de la serie H (véase figura 5.6).

Figura 5.6. Esquema del dispositivo de medida basado en el método del rayo láser.

3.3.

Parámetros que determina un contador electrónico Los contadores electrónicos pueden llegar a determinar los siguientes parámetros: • Número de hematíes por mm3 de sangre • Número de leucocitos por mm3 de sangre • Número de plaquetas por mm3 de sangre.

• Valor hematocrito • Concentración de Hb en la sangre • Índices hematimétricos • Fórmula leucocitaria. Para el recuento de leucocitos es necesaria una lisis previa de los hematíes mediante sustancias tensioactivas (detergentes). Para el recuento de plaquetas es necesaria la separación de los hematíes, por ejemplo, mediante centrifugación. La concentración de la Hb se mide colorimétricamente con el método de la cianmetahemogobina. Los índices hematimétricos pueden ser calculados electrónicamente. Los autoanalizadores Technicon de la serie H determinan la fórmula leucocitaria mediante el estudio de los leucocitos bajo dos aspectos: • El aspecto morfológico de su núcleo, mediante su análisis con técnicas de difracción* luminosa. • Su actividad biológica, mediante la cuantificación del contenido en peroxidasa de su citoplasma (véase figura 5.7).

Figura 5.7. Esquema de un automatizador hematológico

VISUALIZACIÓN DE UNA CÁMARA DE RECUENTO METÓDICA Material necesario • • Un microscopio Una cámara de recuento con un retículo de Neubauer mejorado

Procedimiento 1. Observar con el microscopio el retículo de la cámara de recuento • Primero, con el objetivo de pequeño aumento (4 x) • Luego, con el objetivo de mediano aumento (10 x) • Después, con el objetivo de gran aumento (40 x) 2. enfocar, con el objetivo de 10x, uno de los cuadrados grandes situados en las cuatro esquinas del retículo. Contar el número de cuadrados medianos contenidos en ese cuadrado grande periférico: Teniendo en cuenta que la longitud de cada uno de los lados del retículo es de 3 mm, calcular: • • La longitud de los lados de cada cuadrado grande periférico: La longitud de los lados de cada uno de los cuadrados medianos englobados en un cuadrado grande periférico: Teniendo en cuenta que la longitud del espacio comprendido ente el retículo y el cubre es de 0,1 mm, calcular el volumen de sangre diluida que hay en la cámara de recuento montada, a nivel de: • • • El retículo entero: ……………………………………………………………………………………... Un cuadrado grande periférico ……………………………………………………………………………………... Un cuadrado mediano incluido en un cuadrado grande periférico. 3. Enfocar, con el objetivo de 10 x, el cuadrado grande central.

Contra el número de cuadrados medianos contenidos en ese cuadrado grande central. Contar el número de cuadrados pequeños englobados en uno de esos cuadrados medianos. Teniendo en cuenta que la longitud de cada uno de los lados del retículo es de 3mm, calcular. • • • La longitud de los lados del cuadrado grande central. La longitud de los lados de cada uno de los cuadrados medianos incluidos en el cuadrado grande central Al longitud de los lados de cada uno de los cuadrados pequeños contenida en uno de esos cuadrados medianos: Teniendo en cuenta que la longitud del espacio comprendido entre el retículo y el cubre es de 0,1 mm, calcular el volumen de sangre diluida que hay en la cámara de recuento montada, a nivel de: • • • El cuadrado grande central. ……………………………………………………………………………………... Un cuadrado mediano englobado en el cuadrado grande central ……………………………………………………………………………………... Un cuadrado pequeño incluido en uno de esos cuadrados medianos. ……………………………………………………………………………………...

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