Curva estándar

• Con ayuda de un espectrofotómetro hago

determinaciones de absorbancia/transmitancia con una
solución patrón para generar una gráfica que nos permite
interpolar la absorbancia de una muestra problema y
calcular la concentración de un analito
A

Conc.
Prof. Fernando F. Hdz C.
 Curva estándar
• Mediante determinaciones de absorbancia con una
solución patrón (una sustancia de composición y
concentración conocida) se genera una gráfica de
Absorbancia vs Concentración

Elegir por lo menos 4 [ ] Absorbancia

distintas del patrón
6
6
5
5
44

3
3
22
11
0 1 2 3 4 5 6
Concentración
Prof. Fernando F. Hdz C.
 Curva estándar
Obteniendo la Absorbancia de una muestra
problema, la interpolo en la curva estándar y
obtengo su concentración !!!!!

Absorbancia

5
absorbancia 4
de una muestra
problema
3

2
1
concentración obtenida
Concentración.
para la muestra problema
Prof. Fernando F. Hdz C.
Tomado de https://docplayer.es/15289522-Aplicar-un-metodo-
espectrofotometrico-para-medir-la-concentracion-de-una-proteina.html

Coloración azul-violácea

Prof. Fernando F. Hdz C.

 Curva Estándar:
condiciones requeridas

Prof. Fernando F. Hdz C.

1.-Conocer la [ ] aproximada de la sustancia/compuesto 1.-[albúmina] en clara de huevo=
problema (de la bibliografía, en este caso de nuestro 11 g/100 ml= ? mg/ml
manual)

2.-Contar con una sustancia patrón 2.-Patrón de albúmina

Se pesa el polvo en balanza analítica y se disuelve en el
volumen necesario de NaOH 0.1 N (instrucciones del
método)

3.-Si es necesario hacer diluciones de la muestra Comparar la [albúmina] esperada en la muestra

problema para que quede aprox. a una concentración problema (de la bibliografía) con la del patrón. ¿diluyo la
similar al patrón. ¿Otra alternativa? muestra problema?, ¿cuánto?

4 y 5.-Determinar un intervalo de [patrón] para generar la Sabiendo la [albúmina ] en la clara de huevo del punto
curva estándar con 4 [ ] anterior, decido un intervalo de volúmenes de la soln.
patrón que incluya [ ] menores y mayores a lo
esperado para el problema

6.-Preparar un blanco de reactivos Contiene todos los reactivos pero no contiene el analito
(albúmina en este caso)
Prof. Fernando F. Hdz C.

7.-El volumen final de todos los tubos deberá ser el mismo

8.-Realizar la curva por duplicado Para Journals x triplicado

 Patrón y curva estándar

2.-Contar con una sustancia patrón 2.-Patrón de albúmina 10 mg/100 ml=

? mg/ml

4 y 5.-Determinar un intervalo de [patrón] Tubo 4: ?mg

para generar la curva estándar con 4 [ ] Tubo 5: ? mg
Para ello multiplico el volumen de patrón que Tubo 6: ? mg
se añade a cada tubo x la [albúmina en el Tubo 7:? mg
patrón] Estos datos van en el eje de las «X»
6.-Preparar un blanco de reactivos para Contiene todos los reactivos pero no
calibrar el espectrofotómetro a A= cero contiene el analito (albúmina en este
(T=100%) caso)
7.-El volumen final de todos los tubos deberá ? ml en este caso
ser el mismo
8.-Realizar la curva por duplicado Prof. Fernando F. Hdz C.
 Mtra. Leonor Aguilar Santelises , M. en C. Araceli García del Valle, Dra. Teresa Corona Ortega
Manual de Prácticas de Bioquímica Celular y de los Tejidos I

0.1 mg/ml

Prof. Fernando F. Hdz C.

 Curva Estándar: condiciones requeridas
1.-Conocer la [ ] aproximada de la 1.-[albúmina] en clara de huevo=
sustancia/compuesto problema 11 g/100 ml= ? mg/ml

3.-Se necesita que ¿Diluyo la muestra problema?

[muestra problema]= [patrón]
Si es necesario hacer diluciones ¿Qué dilución? ¿ 1 a ....... ?

Dividir la [albúmina esperada en clara de Con la dilución la [albúmina en clara de

huevo] entre la [patrón de albumina] para
saber cuántas veces más concentrada está
la muestra problema
Y el razonamiento anterior nos permite
entender el procedimiento del manual Prof. Fernando F. Hdz C.
huevo] se espera que quede
aproximadamente en ? mg/ml
Ojo: Lo anterior es un cálculo, pero
llevando a cabo el procedimiento analítico
se obtendrá el resultado experimental de
la concentración de albúmina en la
muestra problema (clara de huevo)
Mtra. Leonor Aguilar Santelises , M. en C. Araceli García del Valle, Dra. Teresa Corona Ortega
Manual de Prácticas de Bioquímica Celular y de los Tejidos I

Prof. Fernando F. Hdz C.

Nos faltaría decidir qué volumen de la muestra
problema diluida se debe tomar.

Para ello, selecciono un volumen de muestra

problema (clara de huevo diluida) que tenga un
volumen (y por lo tanto una concentración similar
teórica) dentro del intervalo de los de la solución
patrón.

Prof. Fernando F. Hdz C.

En este caso, el volumen de muestra problema diluida puede ir desde 0.1 ml hasta 0.8
ml, y el volumen de agua se obtiene por diferencia del volumen total en el tubo.

Prof. Fernando F. Hdz C.

 ml mg
ml mg
ml mg
ml mg

Para calcular [albúmina] en los tubos 4 al 7:

Tubo 4: Patrón= 0.1 mg/ml x 0.1 ml= .01 mg
Tubo 5: Patrón= 0.1 mg/ml x 0.2 ml= .02 mg
etc.
Prof. Fernando F. Hdz C.
Prof. Fernando F. Hdz C.
 Título correcto
pero 3 errores en esta curva estándar:
ortografía, unidades, e indicar el # tubo de cada punto

¿unidades?

.20
.18

¿a qué tubo
corresponden?

¿unidades?

Prof. Fernando F. Hdz C.

Prof. Fernando F. Hdz C.
Para obtener la concentración de albúmina en la muestra problema (tubos 1,2,3)
interpolo al valor de absorbancia de cada uno de esos tubos en la curva
estándar

Prof. Fernando F. Hdz C.

tubo vol [ mg ] Absorbancia al interpolar la absorbancia
de las muestras problema
en la curva estándar
obtengo su [albúmina] en el
eje de las «X»

.20
.18

.060 .067

Prof. Fernando F. Hdz C.

 está en el
classroom

Prof. Fernando F. Hdz C.

 Curva ideal

Noten que grafican Concentración vs Absorbancia lo cual es debatible.

Los autores lo justifican por facilidad de cálculos a partir de la ecuación
de la recta Prof. Fernando F. Hdz C.
Ejemplo de una curva estándar hecha en un laboratorio de la UMIES

valor de r2 ≥ .96

Prof. Fernando F. Hdz C.

 Diferentes maneras de obtener la concentración del analito
(albúmina) en la muestra problema

1) Interpolando la absorbancia de la muestra problema en la gráfica de la

curva estándar
a) a mano en papel milimétrico o b) con Excel (si te interesa, ve el video:
gráfica con Excel para cuantificación de proteínas en el classroom)
2) A partir de la ecuación de la recta, se despeja «x» para cada
valor de absorbancia (y)
y=mx + b; siendo
y= absorbancia (conocida)
x= concentración de albúmina (despejar)
3) A partir de una de las alternativas anteriores se elaboran tablas
de valores (Absorbancia vs Concentración, o Transmitancia vs
Concentración. Muy útil para métodos manuales y con muchas muestras.
4) Se ajusta el software del espectrofotómetro para que nos de los valores de
concentración-
Prof. Fernando F. Hdz C.
Cálculos correctivos para obtener la concentración original de
albúmina en las muestras problema (clara de huevo)

1) Convertir el dato de mg obtenido a mg /ml

Para ello divido los mg obtenidos entre cada volumen respectivo de alícuota de muestra
problema. Para nuestro ejemplo:

tubo vol [ mg ] Absorbancia

0.0603 mg / 0.3 ml= 0.201 mg/ml

0.0672 mg /0.3 ml= 0.224 mg/ml

2) Si la muestra se diluyó, los mg obtenidos en el punto anterior de cada muestra

problema, se multiplican por el factor de dilución. (Recordemos que la clara de huevo que
contiene la albúmina, en ESTE CASO, se diluyó 1:1000)
Por lo que la concentración ORIGINAL de albúmina en la clara de huevo es:
tubo 1: 0.201 mg/ml X 1000= 201 mg albúmina /ml
tubo 2: 0.224 mg/ml X 1000= 224 mg albúmina/ ml (se calcula el promedio)
Prof. Fernando F. Hdz C.
 Resultados, discusión, conclusiones para el
informe

El valor promedio de los datos experimentales obtenidos (mg albúmina/

ml) en la clara de huevo, se transforman a g/dL y se comparan con el dato
Teórico de la bibliografía (11 g/dL).
Se discute su similitud o diferencia, las posibles razones o errores. así
como las posibles medidas para prevenirlos.

Discusión
¿Se cumple la linealidad de la curva estándar en nuestras condiciones de
trabajo? ¿Es adecuado el valor de r2? ¿Qué tan confiable es nuestra curva
estándar? ¿Qué dificultades o errores se detectaron, así como las posibles
medidas para prevenirlos.

Conclusión
¿Qué se logró de los objetivos planteados para este experimento.?
 ¿Cómo selecciono el Método?
• En nuestro experimento, el método ya está seleccionado (es el de Lowry).
• Algunas cuestiones importantes a considerar para seleccionar el método son: (se discuten con
detalle en relación a proteínas en el texto de Olson y Markwell, que encuentras en el classroom)
• Concentración esperada en la muestra problema así como el volumen disponible de la misma.
• Composición de aminoácidos en la proteína a analizar (si se tiene esta información) ya que la
presencia de algunos aminoácidos, p.ej arginina, cisteína, tirosina, triptófano en mayor
concentración ocasiona resultados anómalos en algunos métodos.
• Sensibilidad del método (lo que a su vez determina el límite de detección y el de cuantificación).
Las diluciones introducen cierto grado de error.
• Linealidad/confiabilidad del método.
• Estabilidad de la especie a medir (p. ej. color en función del tiempo).
• Interferencia de otros compuestos presentes en la muestra (p.ej detergentes o agentes reductores)
• Facilidad/complejidad (a mayor # de pasos más error experimental acumulado) y que repercute en
el tiempo para realizar la prueba.
• Disponibilidad de equipo/material/reactivos.
• Costos/ número de muestras que se espera analizar

Prof. Fernando F. Hdz C.

 Comparan
varios
métodos para
cuantificación
de proteínas

Está en el
classroom

Prof. Fernando F. Hdz C.

 Observaciones
1) Las consideraciones para elaborar la curva estándar tienen la limitante de que se enfocan a
graficar absorbancia vs mg de albúmina del patrón(masa) lo cual es debatible. Para que fuera
concentración (mg/ml) habría que dividir los mg de patrón en cada uno de los tubos 4 al 7 entre el
volumen final que es de 3.1 ml, y los datos obtenidos de concentración irían en el eje de las «X»
como mg/mL

Sin embargo, como es la primera aproximación a Curva Estándar, si se manejara en mg/ml se

necesitaría incluir un factor numérico de corrección adicional (multiplicar X este volumen 3.1 para
obtener la concentración original de las muestras problema) resultando frecuentemente más
confuso. Lo podemos revisar cuando hagamos sus cálculos para el informe. Todo esto es importante
que lo hagas tú mismo(a) para que lo comprendas bien ya que se retomará para la curva estándar
en práctica de Proteínas Plasmáticas y es una herramienta que seguirás usando en otro módulos (Q.
Analítica y otras más) y en el ambiente laboral

2) Otra manera de hacerlo: se podrían incluir las correcciones del factor de dilución desde el
momento inicial de generar los datos en el eje de las «X» de la gráfica, y si se quisiera también la
conversión de unidades necesaria (lo que normalmente se hace en un ambiente laboral donde se
trabajan mucho más muestras).

Para ello sería necesario que el volumen de muestra problema añadida a los tubos (clara de huevo
diluida en este caso) fuera el mismo para todos los equipos. Sin embargo, en el Manual de Prácticas
el experimento está diseñado para que los alumnos prueben con volúmenes diferentes de muestras
problema generando una infinidad de factores de corrección y limitando la posibilidad de una
generalización para todo el grupo.
.
Prof. Fernando F. Hdz C.
 Observaciones
3) Otro aspecto que, a mi parecer, conviene que reflexiones es el siguiente:
¿Cómo saber si el resultado que reporto es «correcto»?

En la diapositiva de discusión ya se mencionó algo respecto de la confiabilidad de los

datos de la curva. Si el resultado de mi determinación se aleja de lo esperado,
normalmente convendría repetir la determinación antes de reportar el resultado (si se
trata de muestras de pacientes sería aventurado empezar a proponer diagnósticos
antes de cerciorarnos de la confiabilidad del resultado).

Además, los laboratorios certificados en cuanto a Control de Calidad de sus

Procedimientos (adicional al sistema de gestión de calidad que tenemos ahorita que
está enfocado a % de cumplimiento de actividades y de satisfacción del cliente, y de
retroalimentación de factores que obstaculizan esos objetivos), deben tener
procedimientos de control de calidad internos y externos.

Prof. Fernando F. Hdz C.

 Observaciones
• En el control de calidad interno, el laboratorio debe incluir diariamente junto con las muestras
nuevas que se van a analizar en ese momento, otras muestra(s) de concentración conocida
(generadas por el laboratorio o adquiridas de un tercero, p. ej https://www.bio-rad.com/es-
mx/sku/694-liquid-assayed-multiqual-level-1?ID=694#) y cuyos resultados deben tener un
intervalo de variación estadística permisible, por lo general más o menos 2 o 3 desviaciones
estándar del valor esperado, apuntando a lo confiable de mis resultados que voy a reportar. Si los
resultados obtenidos superan los límites permisibles, indicaría la necesidad de hacer una revisión y
corrección (el operador que realizó la determinación, lo adecuado de la muestra usada, si el
individuo está tomando algún medicamento que esté interfiriendo en su metabolismo o en el
método, los reactivos/instrumentos/equipo).

• En el control de calidad externo en el ámbito de Análisis Clínicos, alguna entidad externa (p.ej. aquí
en México en un tiempo lo hizo la Asociación Mexicana de Química Clínica y en USA la American
Association of Clinical Pathologists, FDA, AABB, CMS, etc) proveen muestras (de las que ellas ya
saben sus datos de concentración de muchos analitos, incluso hasta de anticuerpos contra algún
antígeno de eritrocitos, p ej.) varias veces al año para que el laboratorio las procese y les reporte
sus resultados. La entidad externa los revisa y emite su dictamen sobre ello, y eso permite saber
que tan confiables son los resultados de «X» laboratorio y también puede servir como criterio de
acreditación. (https://clinicalcenter.nih.gov/dtm/accreditation.html).

• Otro aspecto, no considerado en los objetivos de nuestro módulo pero que verás en otros
semestres posteriores, es el aspecto de validación (en el classroom hay un artículo al respecto)

Prof. Fernando F. Hdz C.