Prácticas Bioquímica

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Universidad de Oriente
Núcleo Bolívar
Escuela de Ciencias de la Salud
Departamento de Ciencias Fisiológicas
Profesoras:
Katina Colmenares
Evelyn Maurell
Carmen Rodríguez
María De Armas
Junio, 2016
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COMPETENCIAS A LAS QUE CONTRIBUYE LA ASIGNATURA Y SU UBICACIÓN DENTRO DEL

MAPA CURRICULAR VIGENTE.
Niveles de Desempeño en Ciencias
El conjunto de prácticas del presente manual le permitirá llegar a un desempeño de Nivel 4 de

acuerdo la clasificación de CONOCER, a saber Nivel 4.- Se desarrollan un conjunto de actividades de
naturaleza diversa, en las que se tiene que mostrar creatividad y recursos para conciliar intereses. Se
debe tener habilidad para motivar y dirigir grupos de trabajo.
Contribución al desarrollo de habilidades y destrezas:

- Asimilación de los conocimientos generales adquiridos, desarrollando la capacidad para interpretar la
información recibida, plantear y resolver problemas básicos bioquímicos.
- Capacidad para relacionar las propiedades químicas y estructurales de las moléculas biológicas con
su funcionabilidad.
- Experiencia de trabajo en el laboratorio, con la utilización de las técnicas básicas apropiadas para la
experimentación bioquímica.
- Capacidad de evaluación y clasificación de los datos experimentales, con la posibilidad de deducir

conclusiones y elaborar hipótesis de trabajo.
- Capacidad para buscar y utilizar la literatura científica, que le permita ampliar sus conocimientos en
un determinado tema cuando lo necesite, leyendo críticamente la literatura científica original.
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EVALUACIÓN
● Las actividades prácticas de la asignatura se evaluarán para cada uno de los períodos de
acuerdo al cumplimiento del estudiante. Este representa el 20% de la nota de la materia.
● Se realizará un examen final de laboratorio (dependerá de la programación del semestre).
● En cada sesión el estudiante presentará una prueba corta con relación a la práctica de
laboratorio.
● El estudiante realizará un reporte de trabajo o informe que entregará en la próxima práctica, es

individual.
LINEAMIENTOS GENERALES
1. Los estudiantes deberán cumplir con el 75% de asistencias al curso teórico y al laboratorio. Deberán
presentar los exámenes, tareas y trabajos que el profesor considere indispensables para tener derecho
a calificación final.
2. Los cambios de grupo de laboratorio deberán realizarse en la primera semana de actividades

prácticas.
3. Habrá una tolerancia de 10 minutos en la hora de entrada para cada horario de laboratorio.
4. El estudiante sólo podrá realizar las prácticas en su horario semanal y grupo que le corresponda.
5. El estudiante permanecerá en el laboratorio solo en su horario de práctica correspondiente bajo

responsabilidad de su profesor.
6. Los alumnos deberán utilizar bata blanca manga larga.
7. Se abstendrán de introducir alimentos y bebidas al aula y al laboratorio.
8. Mantendrán apagados los celulares y/o aparatos de comunicación en aulas y laboratorio.
9. Por medidas de bioseguridad queda expresamente prohibido el uso de sandalias en el recinto de

laboratorio.
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10. Cumplir con las demás normas de bioseguridad: uso de guantes, propipeta, bata abotonada, lavado
de manos, orden al trabajar y seguir instrucciones.
El Reporte
- Deberá ser entregado, sin excepción, al inicio de la práctica, al momento de tomar la asistencia y
corresponderá a la práctica anterior.
- Comprenderá las actividades que el estudiante realizó durante la sesión de laboratorio, sus cálculos y
conclusiones.
- Si el estudiante presenta la prueba corta, realiza la práctica y a la semana siguiente no entrega el

informe respectivo, queda a juicio del profesor a cargo la anulación de la nota de la prueba. El informe
de laboratorio es análogo a la boleta de resultados que entrega el Bioanalista al paciente y por ser una
constancia de su trabajo de laboratorio, es la parte más importante de la actividad experimental.
El reporte llevará las siguientes partes (en página de examen):
a) Titulo y propósito de la práctica.
b) Resultados. Presentación y descripción de registros, número de muestra y datos obtenidos (en este
punto queda fuera de lugar mezclar comentarios e impresiones sobre los mismos).
c) Cálculos. Fórmulas, promedios, porcentajes, tablas, gráficas, entre otros.
d) Discusión-Conclusión. Confrontar los datos obtenidos con conocimientos previos e indicar la

concordancia o discordancia de los mismos a manera de discusión. Comparará sus resultados con
valores de referencia y argumentará una explicación con fundamentos teóricos.
e) Referencias. Contendrá las citas bibliográficas utilizadas en la conclusión.
LAS PIPETAS EN EL LABORATORIO
Una pipeta es un utensilio de laboratorio utilizado para transferir un volumen específico o variable de
líquido.
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Existen tres tipos de pipetas:
* Para contenido.
Con soplado o enrase simple o terminales.
* Para transferir
(serológicas)
Sin soplado o enrase doble o sub-terminales.
● Para transferencia.
(Mohr)
-Pipetas para contenido o pipeta de enjuague
Estas pipetas contienen una cantidad exacta de líquido que debe ser completamente transferido
para la medición adecuada. Deben volver a llenarse o enjuagarse con el solvente apropiado luego que
dicho solvente ha sido drenado.
Ejemplo: pipeta de Sahli para hemoglobina.

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-Pipeta para transferencia (Mohr)

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PRÁCTICA Nº 1
DILUCIONES Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS
I.- PROPÓSITO DE LA PRÁCTICA
Al finalizar la práctica el estudiante deberá estar en capacidad de:

a) Preparar diluciones realizando los respectivos cálculos matemáticos y utilizando adecuadamente
las pipetas necesarias para este fin.
b) Comparar la acidez y basicidad de diversas soluciones a través del comportamiento del pigmento
vegetal antocianina que actúa como un indicador natural.
II.- INTRODUCCIÓN
a) DILUCIONES
Una dilución consiste en aumentar la cantidad de disolvente de una disolución.
En el laboratorio, en muchas ocasiones es necesario diluir las muestras o los reactivos para obtener
concentraciones adecuadas a las técnicas. La perfecta preparación de estas diluciones en
imprescindible para la obtención de resultados correctos y requiere un uso adecuado del material
volumétrico.
La dilución realizada se expresa generalmente como una unidad de la solución inicial por unidades
de la solución final. Por ejemplo, una dilución al 1/10 requiere que una cantidad de la solución inicial
sea o haya sido diluida hasta un volumen de 10 unidades.
Aquellas concentraciones en las cuales se expresa la concentración como cantidad de soluto en un

volumen fijo de disolución, como es el caso de la Normalidad, Molaridad o %p/v, se denominan escalas
volumétricas de concentración.
Cuando la concentración se expresa sobre una de estas escalas volumétricas, la cantidad de soluto
contenido en un volumen dado de solución es igual al producto del volumen por la concentración:
Cantidad de soluto = Volumen x Concentración
Si se diluye una solución, el volumen de la misma aumentará a la par que disminuye su

concentración, mientras que la cantidad de soluto presente permanecerá constante. Por ello, dos
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soluciones con distintas concentraciones, pero que contienen las mismas cantidades de soluto, están
relacionadas de la siguiente forma:
V1 . C1 =
V2 . C2
Si se conocen tres de los términos de esta ecuación, se puede calcular el cuarto. Las cantidades a
los dos lados de la ecuación deben expresarse en las mismas unidades.
DILUCIONES SERIADAS
En el Laboratorio de Bioanálisis, principalmente en el área de Inmunología, es frecuente la

utilización de diluciones seriadas, que se llaman así porque después de la primera todas son iguales.
Ejemplo: Diluir un suero al 1:2 por adición de 1 ml de suero a 1 ml de solución salina. Tubo (1).
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
1 ml de suero
1 ml de sción salina Cada uno contiene 1 ml de solución salina
Dilución final: 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32
Respuesta: A partir del Tubo (1) se preparan cuatro tubos más (tubos 2, 3, 4 y 5) que contienen
cada uno 1 ml de solución salina como diluyente. Se realiza la dilución seriada por transferencia de 1
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ml del Tubo (1) al Tubo (2), luego se debe mezclar y transferir 1 ml del Tubo (2) al Tubo (3), y así
sucesivamente hasta el Tubo (5).
La concentración del suero decrece según un factor 2 en cada dilución.
b) SOLUCIONES AMORTIGUADORAS
En los organismos vivientes el pH debe permanecer en límites fijos, los cuales difieren según la
especie, el órgano, la célula o aun la partícula subcelular considerada. Para mantener el pH en el valor
fisiológico, el organismo dispone de sistemas llamados “tampones” (buffers) o amortiguadores. Se
llama tampones a las sales de ácido débil y de base fuerte en equilibrio con su ácido débil. Cuando una
reacción química libera protones en el medio, el sistema tampón reacciona de tal forma que la cantidad
de protones permanece constante, dicho de otro modo que el pH no varía. A la inversa, si las
reacciones utilizan protones, el sistema tampón los libera y mantiene el pH.
Los organismos vivos no soportan variaciones de pH mayores de unas décimas de unidad y por
eso han desarrollado a lo largo de la evolución sistemas de tampón o buffer, que mantienen el pH
constante mediante mecanismos homeostáticos. Los sistemas amortiguadores del organismo son:
sistema amortiguador Bicarbonato-Ácido carbónico, sistema amortiguador de hemoglobina, sistema
amortiguador de proteínas y el sistema amortiguador fosfato.
El tampón bicarbonato es común en los líquidos intercelulares, mantiene el pH en valores

próximos a 7,4 gracias al equilibrio entre el ión bicarbonato y el ácido carbónico, que a su vez se
disocia en dióxido de carbono y agua:
HCO-3 + H+ H2CO3 - CO2 + HO
Así, por ejemplo, el ión bicarbonato (H2CO3 - ) actúa también en los medios orgánicos. Si el pH es
ácido habrá un exceso de iones H3O+; estos serán captados por el ión HCO-3, que a su vez, se
descompondrá en CO2 y H2O. La reacción se desarrolla a la inversa si hay pocos iones H3O+. El ión
bicarbonato actúa como un tampón eficaz para valores de pH en las proximidades de 7, que es el pH
de la sangre. En los medios intracelulares el tampón más frecuente es el ión fosfato (H2PO4-).
El agua es la biomolécula más abundante
Todos los seres vivos precisan de ella, la inmensa mayoría de las reacciones bioquímicas se
desarrollan en el seno del agua y obedecen a las leyes físico-químicas de las disoluciones acuosas.
El agua es líquida en un amplio margen de temperaturas (0 – 100ºC); esto permite que la vida
pueda desenvolverse en condiciones climáticas y ambientales muy dispares; presenta una densidad
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máxima a 4ºC, en consecuencia el hielo flota sobre el agua líquida actuando como aislante térmico. De
esta manera, la gran masa de los océanos se mantiene sin congelarse por debajo de los 4ºC lo que
permite la vida de innumerables seres acuáticos. Estas y otras propiedades del agua se deben a que
sus moléculas se hallan enlazadas por fuerzas intermoleculares, especialmente enlaces de hidrógeno y
fuerzas polares.
El agua es un electrolito débil. Solo una pequeñísima fracción de moléculas se disocia en los
iones H+ y OH-. Sin embargo, esta disociación es de interés crucial en Bioquímica.
Los valores de concentraciones de iones H+ han sido reemplazados por una notación logarítmica
que permite razonar en números relativamente simples y se ha utilizado el concepto de pH.
Químicamente, el pH se define como el logaritmo negativo de la concentración de hidrogeniones. El pH
más adecuado para que una solución amortiguadora funcione correctamente, es cuando se encuentra
en un rango de pH igual a su pK + 1.
El pH se suele medir por el método colorimétrico o por el método potenciométrico. En el método

colorimétrico se encuentra el papel indicador y las sustancias indicadoras. Una medida aproximada del
pH se obtiene colorimétricamente por medio del papel indicador. Se trata de un papel absorbente que
ha sido impregnado por una sustancia o mezcla de sustancias cuya coloración varía con el pH. Suelen
ser ácidos o bases débiles cuyas formas disociadas y sin disociar tienen coloraciones distintas.
Por su parte, los indicadores pueden ser químicos o naturales, en esta actividad práctica se
utilizará la antocianina, pigmento vegetal hidrosoluble que se halla en las vacuolas de las células
vegetales y que otorga el color rojo, púrpura o azul, dependiendo del pH vacuolar, a hojas, flores y
frutas. Desde el punto de vista químico, las antocianinas pertenecen a un grupo denominado
flavonoides y se encuentran ampliamente distribuidos entre las plantas.
Las medidas más precisas de pH se efectúan por el método potenciométrico. Existen en todos
los laboratorios de Bioquímica, potenciómetros especiales llamados pHmetros. Estos aparatos miden
una diferencia de potencial que se establece entre los electrodos y que depende de la concentración de
hidrogeniones del medio que se analiza. En los pHmetros modernos, los dos electrodos se presentan
integrados en un electrodo combinado. Para que este equipo proporcione resultados fiables se requiere
calibrarlo periódicamente con soluciones patrones de pH conocido.
III.- MATERIALES
a) Diluciones
Instrumental
Tubos de ensayo 16 x 150
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Pipetas serológicas: 0.1, 0.2, 1 y 2 ml

Gradilla
Balanza analítica
Cilindro graduado
Vasos de precipitado
Matraz aforado
Reactivos
Suero
Solución salina
Agua destilada
Reactivos sólidos
Reactivos líquidos
b) Soluciones amortiguadoras:
Tubos de ensayo
Gradilla
Papel absorbente
pHmetro
Repollo morado
Buffer fosfato pH 7,3
Pipetas de 1 ml
Pipetas Pasteur
IV.- ACTIVIDAD PRÁCTICA
a) Diluciones
1) Preparar disoluciones, utilizando adecuadamente el material de vidrio y tomando medidas de

bioseguridad, según las instrucciones del facilitador.
2) Preparar diluciones seriadas utilizando suero y solución salina.
3) Identificar pipetas y otros materiales de vidrio de uso en el laboratorio.
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b) Soluciones amortiguadoras
-Preparación de las soluciones de repollo morado:
Cortar el repollo en finos trozos y colocar en un vaso de precipitado que contenga de 100 a 200
ml de agua corriente y en otro vaso con buffer fosfato, coloque en una plancha de calentamiento o
mechero hasta que hierva y el repollo se decolore.
Filtre y coloque en un frasco limpio, rotule como solución de Repollo A (agua corriente) y solución de
Repollo B (buffer).
PROCEDIMIENTO
PARTE I
1.- Enumere nueve (9) tubos de ensayo.
2.- Agregue 3 ml de la solución de Repollo A.
3.- Agregue las siguientes cantidades de ácido o de base que se especifican a
continuación:
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
HCl * 0,4 0,3 0,2 0,1 0 - - - -
NaOH * - - - - 0 0,1 0,2 0,3 0,4
(*): concentración 0,1 mol/ml
4.- Anote sus observaciones en cada uno de los tubos y complete la siguiente tabla.
Tubo Color
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5.- De acuerdo a lo explicado en relación con las sustancias indicadoras, qué cree usted que está
pasando con la solución de Repollo A?
PARTE II
1. Enumere dos tubos de ensayo.

2. En el tubo 1 agregue 5 ml de solución de Repollo preparada en buffer fosfato pH 7,3 (solución
B).
3. En el tubo 2 agregue 5 ml de solución de Repollo preparada en agua corriente (solución A).
4. Mida el pH en ambas soluciones y tome nota.
5. A cada una de las soluciones, agregue gota a gota HCL hasta que observe un cambio en la
coloración, anote cuantas gotas de ácido necesito para lograr este cambio en cada una de ellas.
6. Discuta sus resultados.
PARTE III
I.-INTRODUCCIÓN.
La hemoglobina es una proteína globular pigmentada de color rojo, transportadora de oxígeno,

que se encuentra en grandes cantidades dentro de los glóbulos rojos en los vertebrados. Es un
tetrámero con dos pares de cadenas polipeptídicas diferentes. Cada una de ellas posee un derivado de
la porfirina llamado grupo hemo, que a su vez contiene hierro.
Las dos principales funciones de la hemoglobina son el transporte de oxígeno y ser un

amortiguador del pH.
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Las concentraciones de hemoglobina están influidas por variaciones fisiológicas como la edad,
sexo, deshidratación, postura y altitud, y por procesos patológicos. Se encuentran valores patológicos
en anemias y en policitemias.
La determinación de la concentración de hemoglobina se ha convertido en una de las pruebas

más importantes en el diagnóstico y tratamiento de la anemia. Las tres causas principales de anemia
son: alteración en la síntesis de los eritrocitos en la médula ósea, pérdidas de sangre excesivas y
transporte alterado de eritrocitos hacia sangre periférica.
Se observan valores de hemoglobina elevados en policitemia vera, eritrocitosis, deshidratación,

recién nacidos, cianosis congénita o adquirida, enfermedad renal y pulmonar crónica, quistes renales y
en una serie de tumores productores de eritropoyetina.
El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un único ensayo,

sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.
FUNDAMENTO DE HEMOGLOBINA
La hemoglobina (Hb) es convertida a cianometahemoglobina por acción del cianuro de potasio

(KCN) y del ferrocianuro de potasio [ K3Fe(CN6) ], el color desarrollado se lee a una longitud de onda de
540 nm. La coloración producida es directamente proporcional a la concentración de hemoglobina
presente.
Todos los hemocromógenos, a excepción de la sulfohemoglobina, reaccionan completamente.
III.- MATERIALES
Instrumental:
Espectrofotómetro
Reloj.
Pipetas serológicas terminales.
Pipetas serológicas sub-terminales.
Pipetas de Sahli (hemoglobina)
Tubos.
Propipetas.
Gradillas.
Gasa
Recipientes para pipetas
Marcador o lápiz graso.
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Reactivos:
Reactivo de Drabkin (Cianometahemoglobina).
Agua destilada.
Determinación de hemoglobina a una muestra problema.
En una gradilla coloque tres (3) tubos numerados como Blanco, Estándar y Muestra.
B St Mx
Estándar ------------ 20λ --------------
Muestra de sangre -------------- -------------- 20λ
Reactivo Drabkin 5 ml 5ml 5ml
Las 20λ (0,02ml) deben de agregarse utilizando la pipeta de Sahli, siguiendo las instrucciones del
facilitador.
Luego de mezclar, esperar 10 minutos para después hacer las lecturas en el espectrofotómetro, a una
longitud de onda de 540nm.
V.- CÁLCULOS
Para determinar la concentración de una sustancia problema puede hacerse de tres formas:
● Factor de calibración único.

● Factor de calibración promedio.
● Curva de calibración.
Para conocer la concentración de hemoglobina del paciente en estudio, se calculará un factor de

calibración único, aplicando las ecuaciones siguientes:
Fc = Cp / Lp
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Cx = Fc . Lx
Fc: Factor de calibración.
Cp: Concentración del patrón o estándar.
Lp: Lectura del patrón o estándar.
Cx: Concentración de la muestra en estudio.
Lx: Lectura de la muestra en estudio.
El estándar de hemoglobina, es una muestra de hemoglobina cuya concentración se conoce

(g/dl).
Una vez calculada la concentración de hemoglobina del paciente, ésta deberá ser comparada
con los respectivos valores de referencia y debe hacer un análisis en el reporte de las posibles
patologías que tiene el paciente, con apoyo bibliográfico.
VALORES DE REFERENCIA DE HEMOGLOBINA.
Hombres: de 13 a 16 g/dl.
Mujeres: de 11 a 14 g/dl.
Recién nacido: 18-20 g/dl.
PRÁCTICA N° 2
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS POR CURVA DE CALIBRACIÓN

Al finalizar la práctica el estudiante deberá estar en capacidad de aplicar los métodos de
cuantificación de proteínas totales y albúmina de una muestra utilizando los métodos de Biuret y Verde
de Bromocresol respectivamente, y a través de una curva de calibración establecer el perfil de
proteínas del paciente en estudio.
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II.- INTRODUCCIÓN
Las proteínas son macromoléculas, de peso molecular elevado, que están formadas por
moléculas llamadas aminoácidos que se unen entre sí por enlaces peptídicos. Existen 20 aminoácidos
diferentes que se combinan entre ellos de múltiples maneras para formar cada tipo de proteínas.
Las proteínas son introducidas en el organismo a través de los alimentos, donde se dividen en
aminoácidos para formar posteriormente las nuevas proteínas a través del proceso conocido como
síntesis de proteínas. Las proteínas realizan multitud de funciones en nuestro organismo para su
correcto funcionamiento.
Cuando se hace referencia a las proteínas totales en suero, se trata una medición aproximada
de todas las proteínas presentes en la parte líquida de la sangre. La prueba que determina las
proteínas totales en sangre, examina específicamente la cantidad total de dos tipos de proteínas:
globulinas y albúmina. Este examen a menudo se hace para diagnosticar problemas nutricionales,
enfermedad renal o enfermedad hepática. Si los niveles de proteínas totales son anormales, por
ejemplo, en caso de que el paciente presente proteínas totales bajas (hipoproteinemia), es necesario
realizar exámenes adicionales con el fin de identificar el problema específico.
Las proteínas totales son útiles a la hora de realizar el seguimiento de los cambios en los niveles
de proteínas que causan diversos estados de enfermedad. Generalmente la comprobación de las
proteínas totales se realiza junto con otras pruebas como la electroforesis de proteínas, la
seroalbúmina o las pruebas de la función hepática.
La determinación de los niveles de proteínas totales es útil en la detección de:
a) Hiperproteinemia causada por deshidratación, hemoconcentración o aumento en la concentración de

proteínas específicas.
b) Hipoproteinemia por hemodilución producida por un defecto en la realización de la síntesis proteica,

catabolismo proteico excesivo o pérdidas excesivas (hemorragias).
c) La deshidratación, las enfermedades hepáticas crónicas y el mieloma múltiple son estados que
pueden producir niveles altos de proteínas totales.
d) El descenso de los niveles de proteínas totales es propio del fallo hepático terminal y de la
enfermedad renal.
Con frecuencia se calcula una proporción de albúmina/globulina a fin de obtener información

adicional. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de
laboratorio.
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El plasma sanguíneo normal contiene de 6,5 a 8,2 gramos de proteínas por cada 100 ml (g/dl). La
cantidad considerada como valor normal de proteínas totales puede variar ligeramente entre pruebas
realizadas por distintos laboratorios.
Las proteínas plasmáticas pueden dividirse en tres grupos: fibrinógeno, globulinas y albúmina. El
fibrinógeno está ausente en el suero. La forma de obtención de plasma y suero tiene sus diferencias:
DIFERENCIAS SUERO PLASMA

Proteínas presentes Albúmina, globulinas. (∗)Albúmina, globulinas,
fibrinógeno.
Obtención Sangre sin anticoagulante Con anticoagulante
(∗) No posee fibrinógeno porque se consume en el proceso de coagulación.
La albúmina es la más abundante de las proteínas séricas. Su importancia en el funcionamiento

del cuerpo es la habilidad para transportar substancias tales como medicamentos, antibióticos,
bilirrubina y ácidos y sirve como almacén de proteínas de estructura necesarias para el crecimiento de
los tejidos. El plasma sanguíneo normal contiene de 3,5 a 5,5 gramos de albúmina por cada 100 ml
(g/dl).
Los niveles bajos de albúmina ocurren comúnmente en una variedad de enfermedades tales
como el síndrome nefrítico, enfermedades hepáticas, infecciones agudas y mala nutrición haciendo así
a las determinaciones de albúmina de primordial importancia. Muchos métodos han sido descritos para
determinar a la albúmina sérica. En 1965, Rodkey introdujo un método simple basado en la unión de
colorantes como es el verde de bromocresol. Este método ha sufrido algunas modificaciones
posteriores.
a) Reacción de Biuret: Se utiliza en la determinación cuantitativa de las proteínas plasmáticas y para

evidenciar proteínas en líquidos biológicos. El nombre «biuret» alude a un derivado de la urea que
también da positiva esta reacción.
El reactivo contiene tartrato de sodio y potasio, hidróxido de sodio, yoduro de potasio y sulfato de
cobre, importantes para evidenciar la positividad de la reacción ya que se forman complejos de
coordinación entre los iones Cu++, el nitrógeno peptídico y el oxígeno del agua.
Fundamento de la reacción de Biuret:

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Las proteínas y los péptidos al reaccionar con el reactivo de Biuret, en medio alcalino, forman
quelatos solubles con el ión Cu++, de coloración característica, desde el azul intenso al violeta o rosa.
La intensidad del color es proporcional a la cantidad de enlaces peptídicos presentes en la muestra.
Las proteínas de elevado peso molecular dan una coloración violeta. Los péptidos formados por
más de tres aminoácidos dan una coloración rosada muy clara.
b) Fundamento de la reacción Verde de Bromocresol
La albúmina sérica se enlaza de forma específica con el verde de bromocresol a un pH de 4,2

para producir un complejo coloreado con un máximo de absorbancia a 628nm. El color del complejo
obtenido es directamente proporcional a la concentración de albúmina.
c) ¿Cómo construir una Curva de Calibración?
1.- Disponer de una solución madre de concentración conocida, por ejemplo, solución madre de
albúmina si la curva de calibración se utilizará para conocer concentración de albúmina de un paciente.
2.- Preparar patrones de diferentes concentraciones, partiendo de la solución madre, estos deben
incluir valores menores, iguales y mayores a los valores de referencia del metabolito que se desea
analizar (en el caso de la curva de calibración de albúmina que se efectuará en esta práctica, los
patrones están representados por alícuotas de la solución madre de albúmina).
3.- Se aplica la técnica correspondiente del metabolito a analizar. Debe observar que todos los tubos
tengan el mismo volumen final.
4.- Obtener las absorbancias de los diferentes patrones.

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5.- Se construye la curva de calibración en un papel milimetrado graficando las absorbancias de los
patrones con sus respectivas concentraciones. Estas últimas deberá calcularlas mediante una regla de
tres, tomando en cuenta la concentración de la solución madre y los ml agregados a cada patrón.
6.- Trazar una línea recta que parte del origen y debe pasar por el mayor número de puntos graficados.
Coloque título a la gráfica.
d) ¿Cómo utilizar la curva de calibración?
Ubique el valor de absorbancia que obtuvo “del paciente o muestra” en el eje de absorbancias y
por interpolación ubique la concentración en el otro eje de coordenadas.
Observe a continuación todos los elementos que debe colocar al presentar su curva en el
informe:
Curva de Calibración de Albúmina
III.- MATERIALES
Instrumental: Baño de María a 50°C, espectrofotómetro, gradilla de acero inoxidable, pipetas
volumétricas de 1, 2, 5 y 10 ml, tubos de ensayo.
Reactivos: Suero humano, patrón de proteínas 8 mg/ml, reactivo de Biuret, patrón de albúmina de 40
g/L, verde de bromocresol en tampón a pH 4,2.

a) Procedimiento para la determinación de Proteínas Totales:
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Preparar los tubos agregando las cantidades que indica la tabla, en ml.
PREPARACIÓN DE PATRONES
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Muestra Blanco
Suero --- --- --- --- 0,1 ---
Solución
madre
0,25 0,50 0,75 1,0 --- ---
(8 mg/ml)
NaCl 0,9% 0,75 0,50 0,25 --- 0,9 1

Reactivo de
Biuret 3 3 3 3 3 3
MEZCLAR
INCUBAR A 50ºC POR 10 MINUTOS
LEER EN ESPECTROFOTOMETRO A 580 nm
COMPLETAR LA PARTE INFERIOR DE ESTA TABLA CON SUS RESULTADOS
Absorbanci ---
a
Proteínas
totales (mg) (*) ---
(*) El resultado del paciente o muestra se obtiene en la curva de calibración.
Observe el contenido del Tubo Blanco, para qué se utiliza este tubo?
b) Procedimiento para la determinación de Albúmina:
Preparar los tubos agregando las cantidades que indica la tabla, en ml.
PREPARACIÓN DE PATRONES
Tub Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Muestra Blanco
o1 2 3 4 5 6 7
21
Suero --- --- --- --- --- --- --- 30λ ---
Solución --- ---
madre
0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07
(40 g/L)
NaCl 0,9% 0,99 0,98 0,97 0,96 0,95 0,94 0,93 0,97 1
Reactivo
3 3 3 3 3 3 3 3 3
Verde de
Bromocresol
MEZCLAR
DEJAR REPOSAR POR 10 MINUTOS
LEER EN ESPECTROFOTOMETRO A 628 nm
COMPLETAR LA PARTE INFERIOR DE ESTA TABLA CON SUS RESULTADOS
Absorbancia ---
Albúmina
(mg) (*) ---
(*) El resultado del paciente o muestra se obtiene en la curva de calibración.
V.- PROCESAMIENTO DE DATOS
a) Proteínas Totales:
- Debe calcular los mg de proteína contenidos en cada tubo patrón para graficar.
- El resultado del paciente obtenido en la gráfica está expresado en “mg por cada 0,1 ml” ya que 0,1 ml
fue la cantidad que Ud agregó al tubo “muestra”. Haga la conversión a g/dl. – Ha obtenido así el
resultado de Proteínas Totales del paciente.
b) Albúmina:
- Debe calcular los mg de albúmina contenidos en cada tubo patrón para graficar.
- El resultado del paciente obtenido en la gráfica está expresado en “mg por cada 0,03 ml” ya que 0,03
ml fue la cantidad que Ud agregó al tubo “muestra” (es decir, 30λ). Haga la conversión a g/dl.
- Ha obtenido así el resultado de Albúmina del paciente.
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c) Calcule el valor de Globulinas y la Relación albúmina/globulina.
VII.- REPORTE DE RESULTADOS
Proteínas totales _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ g/dl

Albúmina _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ g/dl
Globulinas _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ g/dl
Relación A/G _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ (sin unidades, es un cociente)
Los resultados deben compararse con los Valores de Referencia:
- Proteínas totales = 6,5 – 8,2 g/dl

- Albúmina = 3,5 – 5,5 g/dl
- Globulinas = 1,5 – 3,0 g/dl
- Relación A/G = 1,5 – 2,7
Elabore su conclusión, con apoyo bibliográfico, relacionando sus resultados con posibles patologías en
el caso de valores por encima o por debajo de lo normal.
PRÁCTICA Nº 3
CROMATOGRAFIA COMO METODO DE SEPARACIÓN
I.- PROPOSITO DE LA PRÁCTICA
Al finalizar la práctica el estudiante deberá estar en capacidad de realizar la separación de

aminoácidos por la técnica de cromatografía en papel relacionando su posición en la misma con su
solubilidad en cada fase y aplicar la técnica de cromatografía en columna por exclusión molecular.
I.-INTRODUCCION
La cromatografía moderna comenzó en 1906 cuando Michael S. Twest detalló la separación de
pigmentos vegetales (clorofila).
croma = color grafe = estructura
En general Cromatografía es un término colectivo referido a un grupo de métodos de separación

donde una mezcla de solutos disueltos en un solvente común, son separados unos de otros por su
23
distribución diferencial en dos fases. Una fase, el solvente, es móvil y lleva los solutos mezclados a
través de otra fase, fija o estacionaria.
El método cromatográfico resuelve con notable éxito el problema de la separación e identificación

de los compuestos de un grupo de sustancias químicamente parecidas o la demostración de
sustancias de muy baja concentración en los líquidos biológicos.
Es una prueba cualitativa, a veces con una variante de técnica cuantitativa, que se utiliza para
separar e identificar aminoácidos con respecto a sus gradientes de solubilidad.
Las técnicas cromatográficas representan el método más eficiente para separar e identificar los
aminoácidos en una mezcla. Este procedimiento primeramente fue aplicado a la separación de los
compuestos coloreados y hoy día es uno de los métodos más sencillos para la separación cualitativa y
cuantitativa de compuestos químicos de estructura muy parecida.
El propósito de una técnica cromatográfica es separar los componentes de una muestra dada a un
tiempo razonable; se separan por su distribución entre una fase fija y una móvil. Su objetivo es
detectar o cuantificar un componente particular o grupo de componentes de interés de forma pura.
Las interacciones con la fase estacionaria incluyen:
➢ Adsorción: proceso por el cual una sustancia se adhiere a otra a causa de las fuerzas de
atracción de los átomos en la superficie de ambas (es distinto de absorción).
➢ Partición: proceso por el cual un sólido se distribuye entre dos fases inmiscibles.
(inmiscible = que no se unen o mezclan)
➢ Exclusión de tamaño.
➢ Interacciones electrostáticas.
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
a.- Partición – adsorción: se basa en las propiedades de solubilidad (polaridad).
b.- Intercambio iónico: depende de la carga del compuesto.
c.- Exclusión molecular: depende del tamaño de las partículas.
TECNICAS DE LA CROMATOGRAFÍA.
1) Cromatografía en papel.
2) Cromatografía en capa fina.
3) Cromatografía en columna.
24
4) Cromatografía por afinidad.

5) Cromatografía de gases (gas- líquido).
6) Cromatografía líquida de alta precisión (HPLC).
a) CROMATOGRAFÍA EN PAPEL.
Es una técnica de la cromatografía de partición (líquido-líquido) en la cual el papel de filtro actúa

como soporte de una fase líquida estacionaria que es agua firmemente unida al papel, sobre la que
fluye una fase líquida móvil que es una mezcla de solventes o un solvente orgánico.
La cromatografía en papel puede ser de dos tipos; ascendente y descendente, según como se
coloque el sistema de solventes y el sistema de soportes que contiene la muestra. En el método
ascendente el solvente se desplaza hacia arriba por la acción de las fuerzas capilares pero ese
ascenso es frenado por la acción de la gravedad, en tanto que en el descendente intervienen la
capilaridad y la fuerza de gravedad está a favor.
A medida que progresa el solvente se establece una distribución de contracorriente de los

compuestos de la mezcla y éstos se separan a los diferentes coeficientes de partición entre ambas
fases.
El procedimiento consiste en ubicar gotas de las sustancias que se van a separar en el extremo de
la tira de papel de filtro. Luego se permite que un solvente adecuado fluya por la tira de papel
suspendida. En el proceso lento de la migración del solvente a través del papel, las sustancias son
transportadas a distintas velocidades según la solubilidad diferencial de las sustancias en cada una de
las dos fases (la acuosa y la orgánica). La separación está basada en la separación líquido - líquido de
los componentes.
Una vez que el solvente se ha desplazado una distancia prudencial, se seca el papel y se procede
al revelado de los compuestos que se están estudiando.
La relación del recorrido de los compuestos con el recorrido del solvente, desde el punto donde se
coloca la gota de muestra (origen) se llama Factor de Retención (Rf) del compuesto.
Distancia entre el origen y el recorrido de la muestra
Rf = -----------------------------------------------------------------------------------
Distancia entre el origen y el recorrido del solvente

25
Ejemplo:
Rf A = 4cm/8cm = 0,5
Rf B = 6cm/8cm = 0,75
Bajo condiciones estrictamente controladas el Rf es una constante importante para identificar

sustancias. El método anteriormente descrito es el de la "cromatografía mono dimensional".
Otros conceptos importantes son los siguientes. Resolución, es el grado de separación de los
compuestos después del desarrollo. La carga es la cantidad aplicada de muestra como mancha o
banda sobre el papel o capa fina.
La “cromatografía bidimensional” es una variante donde la muestra es colocada en una esquina

y se hace un desarrollo en una dirección con un solvente; se seca la hoja, se le da una rotación de 90°
y se hace de nuevo desarrollo con otro solvente. En este caso el poder de separación es considerable.
La técnica de cromatografía en papel se basa en la propiedad de partición- adsorción. Es de gran

utilidad para reconocer e identificar aminoácidos y azúcares. Ha sido muy útil para el aislamiento de
aminoácidos que provienen de la hidrólisis de proteínas puras; permitió lograr la identificación completa
de los aminoácidos que constituyen la insulina.
26
Las variaciones de la técnica incluyen:
➢ Cromatografía en papel ascendente o descendente.

➢ Circular o radial.
➢ Mono dimensional o bidimensional.
La cromatografía en papel tiene tres etapas.
1) Colocación de la muestra.
2) Desarrollo del cromatograma.
3) Revelado con ninhidrina.
En toda cromatografía existen dos fases, en el caso de la cromatografía en papel se tiene:
Una fase estacionaria que es agua firmemente unida al papel, esto se refiere al porcentaje de
humedad contenida en la celulosa del papel de filtro la cual se une al componente más polar del grupo
de solventes (el agua). La celulosa del papel está cubierta con una capa acuosa que sirve de fase
estacionaria o fija.
Una fase móvil que está representada por los solventes orgánicos. Estos son mezclas polares
binarias, ternarias o más complejas de agua, alcoholes y ácidos o bases. Los componentes menos
polares constituyen esta fase.
El soporte lo constituye el papel de filtro Whatman Nº 1.
b) CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA.
Es otra técnica de la cromatografía que utiliza una columna de vidrio como soporte. La fase
estacionaria está constituida por una resina o polímero que recubre el interior de la columna y de cuyas
características va a depender el fundamento de la separación, por ejemplo, si la resina tiene carga
separará compuestos de distinta carga que sean atraídos o repelidos por ella (cromatografía de
intercambio iónico); y si la resina tiene poros separará compuestos en base al tamaño, los más
pequeños quedarán atrapados en los poros (cromatografía de exclusión molecular o de filtración en
gel).
La fase móvil estará constituida por un solvente o sistema de solventes que finalizará la
separación; es decir, permitirá separar las demás fracciones del compuesto que quedaron atrapadas
en la resina.
27
Uno de los polímeros más usados en la cromatografía de exclusión molecular es el Sephadex,

consiste en unidades de dextrano entrecruzadas que dan origen a una estructura tridimensional
porosa.
Elución
En la cromatografía en columna se utiliza el término elución, que implica el transporte de una

especie a través de una columna por la adición continuada de nueva fase móvil. El proceso empieza
cuando una única porción de la muestra se introducen a la parte superior de la columna (tiempo t0)
después de lo cual los componente de la muestra se distribuyen entre las dos fases, La introducción de
fase móvil adicional, el eluyente, hace que la fase móvil que contiene una parte de la muestra avance
por la columna, donde tienen lugar un posterior reparto entre la fase móvil y las porciones frescas de la
fase estacionaria a las que accede (tiempo t1). Al mismo tiempo, tiene lugar una distribución entre el
disolvente nuevo y la fase estacionaria en el lugar en el que inicialmente se ubicaba la muestra.
II.- MATERIALES
a) Cromatografía en papel:
Hojas de papel Whatman N° 1 de 21x21 cm.
Soluciones patrones de aminoácidos.
Sistema de solventes:
a) Alcalino: butanol normal / amoníaco 2.8% / etanol 96% 10:4:3 v/v
b) Acido: Butanol normal / ácido acético / agua 4:1:1 v/v
Campanas de cromatografía.
28
Tubos capilares.
Revelador: solución de ninhidrina al 0.2% en acetona.
Ganchitos de metal.
Hilo de coser blanco.
b) Cromatografía en columna:
Mezcla de 0,4 ml de gelatina 3% p/v y 0,2 ml de riboflavina 0,3% p/v.
(Preparar al momento de usarla).
Sephadex G50.
Reactivo de Biuret.
Columna de cromatografía.
III.- ACTIVIDAD PRÁCTICA
a) Cromatografía en papel.
1.- Colocación de la muestra:
Sobre una hoja de papel filtro Whatman N° 1, marque con un lápiz de grafito, dos líneas paralelas, al
borde inferior y lateral izquierdo de la misma, a una distancia aproximada de 1,5 cm.
Deposite con el recurso de los tubos capilares 1 μl de una solución hidrolizada de proteínas. La
misma debe ser manejada cuidadosamente, para evitar contaminación del material. En uno de los
ángulos libres de la hoja anote previamente el tipo del material sembrado, sentido del flujo de cada
solvente y fecha del experimento.
Enrolle la hoja en forma de cilindro, y coloque el hilo de coser blanco en forma de lazo.
2.- Desarrollo del cromatograma.
a) Primera dimensión: Prepare la cantidad apropiada del solvente alcalino, colóquela en las placas
de Petri (utilizados como cápsulas) e impregne los papeles secantes, para la adecuada
saturación dentro de la campana.
Coloque las hojas de papel de filtro, (cromatograma) previamente preparadas en las placas de
Petri con solvente, sobre su borde inferior. Cubra el conjunto del sistema con una campana,
sellando los bordes con vaselina.
29
Terminado el proceso cuando el frente del solvente alcanza el borde superior de la hoja, de 8 a
10 horas, retire el cromatograma y déjelo secar.
b) Segunda dimensión: Se corta una banda en el borde superior del cromatograma, la hoja resulta
cuadrada. Enrollar nuevamente la hoja en forma de cilindro, con su eje perpendicular al sentido
de la primera dimensión. Preparar solvente ácido y continuar igual desarrollo anterior, apoyando
el cilindro de papel, sobre su borde lateral derecho.
3.- Revelado. El cromatograma desarrollado y seco, se revela por inmersión o aspersión con la
solución de ninhidrina. Una vez seco, incubar a 60°C por cinco (5) minutos.
IV.- INTERPRETACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA.

30
Si se realizara una cromatografía en papel con los 20 aminoácidos presentes en las proteínas, luego
del revelado con ninhidrina, se obtendría la siguiente ubicación de ellos:
-Aminoácidos con grandes cadenas laterales no polares migran más que aquellos con cadenas
laterales más cortas no polares y migran menos aquellos aminoácidos con cadenas laterales polares.
Esto refleja la mayor solubilidad relativa de las moléculas en la fase estacionaria hidrófila y de las
moléculas no polares en solventes orgánica o fase móvil.
EJEMPLOS:
 El aminoácido Acido aspártico (Asp), luego del revelado, quedaría ubicado cerca del origen, porque
se solubiliza con la fase estacionaria -fase más polar- debido a que es un aminoácido con grupo R
polar con carga. Este grupo de aminoácido es más soluble en agua.
 El aminoácido Serina quedaría en posición intermedia porque se solubiliza a medias con cada fase
debido a que es un aminoácido con grupo R polar sin carga. Este grupo de aminoácidos puede formar
puentes de hidrógeno a través de sus grupos polares.
 La Isoleucina (Ile), se situaría lejos del origen, migra junto al sistema de solventes porque se
solubiliza con la fase móvil - fase menos polar – debido a que es un aminoácido con grupo R no polar
de cadena larga. Los de este grupo son menos solubles en agua que el resto de los aminoácidos.
 El aminoácido Alanina migra un poco menos que la isoleucina, este también se solubiliza con la
fase móvil pero su cadena lateral alifática no polar es más corta.
En conclusión para poder interpretar la cromatografía, es importante analizar la estructura de cada

aminoácido, para ubicarlo en la clasificación según la polaridad del grupo R y entender con cuál fase
se solubiliza.
31
V.- CÁLCULOS
1.- Mídase la distancia desde el punto de colocación de la solución de aminoácidos al centro de las
manchas.
2.- Mídase la distancia del mismo sitio de colocación de los aminoácidos al lugar donde llegó el
solvente.
3.- Calcúlese el Rf para cada uno de los aminoácidos utilizados.
- RESULTADOS
Describa la probable identidad de cada uno de los aminoácidos.
**Recuerde: Para la comprensión de la interpretación de la cromatografía debe conocer la

“Clasificación de los aminoácidos según la polaridad del grupo R”
b) Cromatografía en columna.
PROCEDIMIENTO
1. Enumere 6 tubos de ensayo y márquelos con un volumen de 3,5 ml.
32
2. Con cuidado quite el tapón de la parte inferior de la columna para que salga el agua destilada
presente en la parte superior. NO DEJE QUE EL GEL SE SEQUE.
3. Una vez eliminada el agua, cierre momentáneamente la parte inferior de la columna y añada
cuidadosamente la mezcla a separar, por las paredes de la columna, empleando una pipeta
Pasteur.
4. Permita que la muestra entre en la resina abriendo cuidadosamente la salida y agregando

simultáneamente solución de cloruro de sodio 0,85% en la parte superior para evitar que se seque
la resina. Hacer esto con una pipeta Pasteur y por goteo a través de las paredes.
5. Comience a colectar las fracciones. Cierre la salida cada vez que colecte una fracción.
6. Siga adicionando solución de cloruro de sodio en la parte superior de la columna manteniéndola así
hidratada.
7. Una vez terminado de colectar el eluido de la sexta fracción, lave la columna con agua destilada
agregando agua destilada en la parte superior hasta que por la salida se complete
aproximadamente 25 ml.
8. Cierre la columna verificando que no haya fuga de agua por la salida.
9. Tome las 6 fracciones colectadas y lea la densidad óptica a 430 nm.
10. Tome una alícuota de 1 ml de cada fracción y proceda a realizar la prueba de Biuret, tal como lo
hizo en la práctica de cuantificación de proteínas.
11. Agregue a cada tubo 3 ml de reactivo de Biuret, mézclese bien el contenido de cada uno de los
tubos.
12. Lleve a baño de María a 50ºC, durante 10 minutos. Deje enfriar.
13. Leer en espectrofotómetro a 630 nm, utilizando un blanco reactivo.

33
RESULTADOS
En una cromatografía en columna lo habitual es recoger fracciones del líquido que sale (o eluye),
para analizarlas individualmente y así trazar el perfil de elución de la cromatografía.
Con los resultados obtenidos de densidad óptica y prueba de Biuret para cada fracción, haga
dos gráficos que le permita llegar a conclusiones sobre la experiencia realizada. Las gráficas se
denominarán Gráfica 1. Perfil de elución de la Riboflavina y Gráfica 2. Perfil de elución de la Gelatina.
CONCLUSIÓN
Tomando en cuenta las representaciones gráficas, concluya en su informe cuál de las

sustancias eluye primero y justifique su respuesta. Señale además en cual(es) de las fracciones
colectadas se observa la mayor elución tanto de gelatina como de riboflavina.
PRÁCTICA Nº 4
EFECTO DE TEMPERATURA Y pH SOBRE LA ACTIVIDAD CATALITICA DE LA AMILASA

DEL MAIZ
Al finalizar la práctica el estudiante deberá estar en la capacidad de analizar el efecto de la

temperatura y el pH sobre la actividad catalítica de las amilasas del maíz al hidrolizar el almidón.
II.- INTRODUCCION
El almidón es el principal polisacárido de reserva de las plantas superiores y se almacena en

grandes cantidades en muchas semillas y en tubérculos, constituyendo una fuente de alimentos que
servirán para la formación de nuevos tejidos cuando la planta vuelva a iniciar su crecimiento luego de
un período de latencia.
Cuando el vegetal necesita emplear estas reservas, son de fundamental importancia las enzimas
hidrolíticas α-amilasa, β-amilasa y almidón fosforilasa.
34
La producción de α-amilasa es importante durante el proceso de germinación de las semillas.

Ellas actúan hidrolizando el almidón para generar unidades de glucosa necesarias para la germinación
del embrión.
Almidón. Químicamente es un hidrato de carbono complejo (C6H10O5), inodoro e insípido, en

forma de grano o polvo. Se acumula en las hojas de las plantas, en los cloroplastos, donde es un
producto directo de la fotosíntesis. En los órganos de almacenamiento, se acumula en los amiloplastos,
en los cuales se forma después de la translocación de sacarosa u otro carbohidrato proveniente de las
hojas.
En los vegetales, el almidón se encuentra en uno o más granos amiláceos en un plastidio. La

cantidad de almidón en diversos tejidos depende de muchos factores genéticos y ambientales. El
almidón se acumula a la luz del día cuando la fotosíntesis excede las tasas combinadas de respiración
y translocación, después parte de él desaparece por la noche.
Se presentan dos tipos de almidón en la mayoría de los granos amiláceos: amilosa y

amilopectina, ambos compuestos por unidades de D-glucosa unidas por enlaces α(1 4). Cada almidón
de cada grano difiere de la proporción en que se encuentren estos dos polisacáridos; para el caso del
maíz difiere de la proporción en que se encuentran 27% de amilopectina y 73% de amilosa.
La formación de almidón ocurre sobre todo por un proceso que implica la donación repetida de
unidades de glucosa provenientes de un nucleótido-azúcar activado similar al UDP-Glucosa y que se
denomina difosfoglucosa de adenosina, ADP-Glucosa.
Hidrólisis del almidón. La hidrólisis implica la ruptura de un enlace mediante la adición, en

medio del mismo, de los elementos del agua. Los polisacáridos de la dieta se metabolizan mediante
hidrólisis a monosacáridos.
La mayoría de los pasos de la degradación de almidón a glucosa pueden ser catalizados por tres
enzimas distintas, si bien hay otras más que se necesitan para completar el proceso. Las tres primeras
enzimas son α-amilasa, β-amilasa y almidón fosforilasa.
a) α-amilasa: Al parecer solo puede atacar gránulos de almidón intactos, por lo que cuando
participan la β-amilasa y la almidón fosforilasa, es probable que actúen sobre los primeros productos
liberados por la α-amilasa. La α-amilasa ataca de manera aleatoria enlaces (1 4) en las moléculas
35
de amilosa y amilopectina, al principio creando huecos al azar en los granos de almidón y liberando
productos que aún son grandes.
En cadenas de amilosa no ramificadas, el ataque repetido por la α-amilasa produce maltosa, un

disacárido que contiene dos unidades de glucosa. Sin embargo, la α-amilasa no puede atacar los
enlaces (1 6) localizados en los puntos de ramificación de la amilopectina, por lo que la digestión de
amilopectina cesa cuando aun quedan dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta. Muchas
α-amilasas son activadas por Ca++, lo cual es una de las razones por las que el calcio es un elemento
esencial.
b) β-amilasa: Hidroliza al almidón en β-maltosa; la enzima actúa primero solo sobre los extremos no
reductores. La β-maltosa cambia con rapidez, por mutarrotación, para formar las mezclas naturales de
isómeros α y β. La hidrólisis de amilosa por la β-amilasa es casi completa, pero la degradación de
amilopectina es incompleta porque no son atacados los enlaces de los puntos de ramificación. La
actividad de ambas amilasas implica la incorporación de una molécula de agua por cada enlace roto,
por lo que son enzimas hidrolasas.
Las reacciones hidrolíticas no son reversibles, de modo que no se pueden detectar síntesis de
almidón por amilasas. Las amilasas están diseminadas en diversos tejidos pero son mas activas en las
semillas que están germinando, ricas en almidón. Es probable que la α-amilasa tenga más importancia
que la β-amilasa para la hidrólisis de almidón. Gran parte de la α-amilasa se localiza dentro de los
cloroplastos, muchas veces unida a los granos de almidón que atacará. Actúa tanto en el día como por
la noche aunque, por supuesto, durante la luz de día hay producción neta de almidón por la
fotosíntesis.
c) Almidón fosforilasa: Degrada parcialmente a la amilopectina. La reacción procede de manera

consecutiva a partir del extremo no reductor de cada cadena principal o cadena ramificada hasta llegar
a unos residuos de glucosa de las uniones α-(1 6) de las ramificaciones, por lo que de nuevo dan
dextrinas. La amilosa, que tiene pocas ramificaciones, se degrada casi por completo, por eliminación
repetida de unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena. La enzima almidón
fosforilasa está ampliamente distribuida en la planta y a veces resulta difícil determinar cual enzima
digiere la mayor parte del almidón en las células de interés.
A continuación, valores de pH y temperatura óptimos para las amilasas del trigo, los cuales no
difieren mucho con los valores de amilasas para maíz:
36
Enzima pH óptimo Temperatur Temperatura de

(trigo) a óptima inactivación (ºC)
(ºC)
α- amilasa 4,6 60 - 66 73
β- amilasa 4-5 55 65
III.- MATERIALES
Instrumental:
Morteros
Bisturí
Baños de María
Tubos de centrífuga
Pipetas graduadas serológicas
Tubos de ensayo de 15x150
Centrífuga
Espectrofotómetro
Balanza
30 semillas de maíz
Balones de 50 ml
1) Preparación de la semilla de maíz y extracto enzimático.
Se realizará tres días antes de la práctica. Se desinfectarán 60 semillas de maíz en cloro

(hipoclorito de sodio) durante 20 minutos y se enjuagarán varias veces con agua hervida; luego se
pondrán a germinar en un plato hondo limpio que contenga una capa de algodón húmedo. De igual
manera se realizarán otras germinaciones dos días antes de la práctica y otra un día antes de la
práctica.
- Para empezar la práctica se ponen a remojar en agua las semillas de maíz de 1, 2 y 3 días de
germinación, por separado.
- Se les quita el embrión y el escueto con ayuda de un bisturí, para que solo quede el endospermo
almidonoso.
37
- Una vez limpios los maíces, se prepara un extracto enzimático:
a) Tomar 20 semillas de la misma clase y en las mismas condiciones, colocarlas en un

mortero.
b) Triturar el endosperma y agregar 20 ml de buffer acetato.
c) Filtrar por gasa o tela.
d) Centrifugar el filtrado 10 min a 3000 rpm. El sobrenadante contendrá las enzimas para
nuestro propósito.
2) Efecto de las distintas temperaturas sobre la actividad enzimática de amilasa:
a) Preparación de tubos problema: Rotule 5 tubos de ensayo, y agregue los reactivos según la
siguiente tabla. Debe prepararlos uno por uno para poder controlar el tiempo exacto de reacción.
TABLA 1
1 2 3 4 5
Solución de 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

almidón (1,4 g/l)
Extracto
enzimático con
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
1 día de
germinación (ml)
Temperatura 0º C 37º C 40º C 65º C 80º C
Incubar 10 min
Solución de lugol 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

(ml)
38
Retirar los tubos y 10 10 10 10 10

agregar agua (ml)
● Mezclar por inversión y leer en el espectrofotómetro a la absorbancia de 660 nm, ajustando el

equipo con agua destilada. Color estable 1 hora.
● Repetir este procedimiento utilizando los extractos enzimáticos con 2 días de germinación y con
3 días de germinación.
b) Preparación de tubos controles: Rotule 5 tubos de ensayo.
TABLA 2
1 2 3 4 5
Solución de 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

almidón (1,4 g/l)
Temperatura 0º C 37º C 40º C 65º C 80º C
Incubar 10 min

(ml)
Extracto
enzimático con
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
0 día de
germinación (ml)
39

agregar agua (ml)
-Mezclar por inversión y leer en el espectrofotómetro a la absorbancia de 660 nm, ajustando el equipo
con agua destilada. Color estable 1 hora.
3) Efecto de los distintos pH sobre la actividad enzimática de amilasa.
a) Preparación de tubos problema:
Rotule 5 tubos de ensayo, y agregue los reactivos según la siguiente tabla. Debe prepararlos uno por
uno para poder controlar el tiempo exacto de reacción.
TABLA 3
1 2 3 4 5
1 ml de 1 ml de 1 ml de 1 ml de 1 ml de
buffer buffer buffer buffer buffer
Buffer a distintos
pH 4 pH 5 pH 7 pH 8 pH 11
pH
40
Solución de 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

almidón (1,4 g/l)
Extracto
enzimático con
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
1 día de
germinación (ml)
Incubar a 37° C por 10 minutos

(ml)

agregar agua (ml)
● Mezclar por inversión y leer en espectrofotómetro a la absorbancia a 660 nm, ajustando el

● Repetir este procedimiento utilizando los extractos enzimáticos con 2 días de germinación y con
3 días de germinación.
b) Preparación de tubos controles:
Rotule 5 tubos de ensayo, y agregue los reactivos según la siguiente tabla.
TABLA 4
1 2 3 4 5
1 ml de 1 ml de 1 ml de 1 ml de 1 ml de
buffer buffer buffer buffer buffer
Buffer a distintos
pH 4 pH 5 pH 7 pH 8 pH 11
pH
41
Solución de 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

almidón (1,4 g/l)
Incubar a 37ºC por 10 minutos

(ml)
Extracto
enzimático con
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
0 día de
germinación (ml)

agregar agua (ml)
● Mezclar por inversión y leer en espectrofotómetro a la absorbancia a 660 nm, ajustando el

V.- CÁLCULOS
1) Efecto de las distintas temperaturas sobre la actividad enzimática.
- Calcular la actividad enzimática para cada temperatura. La actividad
enzimática se calcula como descenso de la Absorbancia por minuto.
Actividad enzimática/minuto = ∆ Absorbancia / minuto = Ac - Ad
10
Ac = Absorbancia del control
Ad = Absorbancia del tubo problema (desconocido)

42
- Graficar la Actividad enzimática (en el eje de las ordenadas) en función de
las temperaturas ensayadas (en el eje de las abscisas).
Título de la gráfica: “Efecto de temperatura sobre la actividad enzimática
de amilasas del maíz”.
- Sacar conclusiones.
b) Efecto de los distintos pH sobre la actividad enzimática.
- Calcular la actividad enzimática para cada pH.
- Graficar la Actividad enzimática (en el eje de las ordenadas) en función de
los pH ensayados (en el eje de las abscisas).
Título de la gráfica: “Efecto de pH sobre la actividad enzimática de amilasas
del maíz”.
- Sacar conclusiones.
PRÁCTICA Nº 5
CURVA DE CALIBRACIÓN DE GLUCOSA
l finalizar la práctica el estudiante deberá estar en capacidad de realizar una determinación de

A
glucosa en sangre mediante el método enzimático y relacionar el resultado obtenido con el estado
metabólico.
II.- INTRODUCCIÓN
43
La glucosa es el carbohidrato más importante del grupo de las aldosas perteneciente a los
monosacáridos. No puede ser hidrolizada en moléculas más sencillas. Es una hexosa y en su fórmula
estructural tiene cinco carbonos ocupados por funciones alcohólicas y uno con una función aldehído en
su forma lineal. Es dextrógira.
Entre los carbohidratos presentes en la sangre sólo ciertas hexosas como la glucosa, galactosa y
fructosa así como las pentosas ribosa y desoxiribosa son de importancia bioquímica. Sin embargo la
glucosa presente en sangre y en los tejidos es el azúcar utilizable por excelencia que se oxida
fácilmente para liberar energía.
La fuente de glucosa sanguínea puede ser exógena y endógena y a partir de ella pueden formarse
los demás carbohidratos en el cuerpo:
1.-Exógena: proviene de los alimentos (disacáridos y polisacáridos) que sufren transformaciones en el

aparato digestivo hasta formar glucosa y otros monosacáridos como fructosa y galactosa. Entra a la
sangre donde es captada por el hígado principalmente y el tejido muscular (glucogénesis tisular).
2.- Endógena:
a) Proviene de la conversión de glucógeno en glucosa (glucogenólisis).
b) Algunos aminoácidos y lípidos pueden ser convertidos en glucosa (gluconeogénesis).
c) Galactosa y fructosa también pueden ser transformados en glucosa por el hígado

(interconversión de hexosas).
Los valores normales de glucosa sanguínea son 70 a 100 mg/dl. Después de una comida que
contenga carbohidratos, esta cifra se incrementa para volver en unas dos horas a los niveles basales.
Si el ayuno es prolongado el nivel de glucosa desciende, pero nunca por debajo de 50-60mg/dl, la
razón fundamental es que el sistema nervioso requiere un aporte continuo de glucosa.
Cuando la glicemia sanguínea se eleva por encima del umbral renal (180 mg/dl) se produce la
aparición de glucosa en la orina o glucosuria. En condiciones normales no debe existir glucosuria, por
lo tanto NO se puede hablar de valores normales de glucosa en orina.
Las enfermedades que se relacionan con carbohidratos incluyen diabetes sacarina, galactosemia,
enfermedades por almacenaje de glucógeno e intolerancia a la leche.
MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE GLUCOSA:
1.-Métodos basados en la capacidad reductora de la glucosa:

44
La forma enediol de la glucosa es muy reactiva y se oxida fácilmente. Consecutivamente a la

oxidación, la cadena de carbonos se rompe dando lugar a la formación de cadenas ácidas más cortas.
Sea cual sea el grado de oxidación se forman diversos productos, esto dependerá del pH, temperatura,
concentración salina y concentración del oxidante el cual puede ser cobre, ferricianuro o ácido pícrico.
Han sido utilizados los métodos clásicos de Folin –Wu, Hagedorn y Jensen entre otros, hoy en día en
desuso.
2.-Métodos basados en la condensación aldosa-amina aromática:
La glucosa y otras aldosas se condensan con aminas aromáticas en soluciones de ácido acético
en caliente dando lugar a la formación de glucosil-aminas. Numerosas aminas aromáticas han sido
empleadas, entre ellas:
O-aminodifenil, ácido p-aminosalicílico, ácido p-aminobenzoico, O-toluidina.
3.- Métodos enzimáticos:
Son los más empleados en la actualidad. Los métodos enzimáticos son específicos, se emplean
enzimas purificadas que actúan sólo sobre glucosa y esto ha permitido la aplicación de técnicas
altamente específicas en la valoración de glucosa en líquidos biológicos.
Algunas enzimas utilizadas son:

● glucosa oxidasa, se utilizará en esta práctica.
● hexoquinasa.
● glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.
MÉTODO DE LA GLUCOSA OXIDASA
Fundamento:
La β-D-glucosa es oxidada específicamente por la glucosa-oxidasa con la producción de

peróxido de hidrógeno (H2O2) el cual oxida al cromógeno (4-AAP/fenol), para producir un compuesto
coloreado, mediante una reacción catalizada por la peroxidasa.
glucosa oxidasa
Glucosa H2O+ O2 ácido glucónico + H2O2
peroxidasa
45
H2O2 + 4 aminoantipipirina + Fenol Compuesto coloreado
I.- MATERIALES
Instrumental:
Tubos de ensayo
Gradilla
Balón de 500 ml.
Balanza.
Baño de María a 37 °C
Espectrofotómetro.
Pipetas serológicas
a) CURVA DE CALIBRACIÓN
Solución madre: pesar analíticamente un gramo (1g) de glucosa, colocarla en balón volumétrico
de 500 ml. Disolver y completar volumen con agua destilada hasta el aforo. Mezclar. Concentración
de la solución madre = 2 mg/ml
Soluciones patrones: Rotular cinco tubos y prepararlos de la siguiente manera.
TUBOS 1 2 3 4 5
Sol madre 0,25 0,50 0,60 0,75 1,00
(ml)
Agua
destilada
0,75 0,50 0,40 0,25 --
(ml)
Concentración
50 mg/dl 100 mg/dl 120 mg/dl 150 mg/dl 200 mg/dl
final
1. Mezclar el contenido de los tubos.

2. Rotular otra serie de tubos (5) en forma similar por duplicado.
46
3. Colocar en cada uno 0,02 ml de la dilución respectiva. (patrones)
Estos 5 tubos son llamados “patrones”, se prepararon a partir de una solución madre (en este caso
de glucosa). Se les hará la determinación por el método de glucosa oxidasa. Los tubos patrones son
los que se necesitan para realizar la curva de calibración.
b) TÉCNICA DE LA GLUCOSA OXIDASA
Tome 2 tubos de ensayo, rotúlelos “blanco” y “muestra”. Los patrones corresponden a los 5 tubos
preparados anteriormente, solo tiene que agregarles el reactivo de color:
BLANCO MUESTRA PATRONES
Suero o plasma -- 0,02 ml --
Agua destilada 0,02 ml -- --
Patrón de glucosa -- -- 0,02 ml
Reactivo de color 2 ml 2 ml. 2 ml.
En este momento deberá tener 7 tubos.
1. Mezcle bien e incube 10 min. a 37 °C ó 30 min. a temperatura ambiente.

2. Ajustar el fotocolorímetro o espectrofotómetro a densidad óptica de cero utilizando el blanco y leer
luego las soluciones contenidas en los otros tubos en forma sucesiva, a 510 nm. El color es estable
1 hora.
V.- TABLA DE DATOS
TUBOS LECTURAS concentración

mg/dl
1 50
2 100
3 120
47
4 150
5 200
muestra (*)
(*) Esta concentración se averigua por medio de la

curva de calibración.
VI.- CÁLCULOS
1. Verifique mediante cálculos matemáticos si la concentración de la solución madre realmente es de 2

mg/ml. Haga lo mismo con la concentración de glucosa de cada tubo patrón.
2. En papel milimetrado realizar una gráfica de calibración representando en el eje vertical las lecturas
en absorbancia y en el eje horizontal las concentraciones correspondientes.
3. Según la lectura obtenida para la muestra, ubique en eje de las concentraciones de glucosa el valor
que le corresponde.
V.- RESULTADOS
1. Compare el resultado de la muestra (mg/dl) con los valores normales de glucosa.
2. Elabore su conclusión con apoyo bibliográfico relacionando el valor obtenido con patologías, si
fuese necesario

Prácticas Bioquímica

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COMPETENCIAS A LAS QUE CONTRIBUYE LA ASIGNATURA Y SU UBICACIÓN DENTRO DEL

Niveles de Desempeño en Ciencias

El conjunto de prácticas del presente manual le permitirá llegar a un desempeño de Nivel 4 de

Contribución al desarrollo de habilidades y destrezas:

- Capacidad de evaluación y clasificación de los datos experimentales, con la posibilidad de deducir

● Se realizará un examen final de laboratorio (dependerá de la programación del semestre).

● El estudiante realizará un reporte de trabajo o informe que entregará en la próxima práctica, es

2. Los cambios de grupo de laboratorio deberán realizarse en la primera semana de actividades

5. El estudiante permanecerá en el laboratorio solo en su horario de práctica correspondiente bajo

6. Los alumnos deberán utilizar bata blanca manga larga.

7. Se abstendrán de introducir alimentos y bebidas al aula y al laboratorio.

8. Mantendrán apagados los celulares y/o aparatos de comunicación en aulas y laboratorio.

9. Por medidas de bioseguridad queda expresamente prohibido el uso de sandalias en el recinto de

- Si el estudiante presenta la prueba corta, realiza la práctica y a la semana siguiente no entrega el

El reporte llevará las siguientes partes (en página de examen):

a)​ ​Titulo y propósito de la práctica.

c) Cálculos.​ Fórmulas, promedios, porcentajes, tablas, gráficas, entre otros.

d) Discusión-Conclusión. Confrontar los datos obtenidos con conocimientos previos e indicar la

e) Referencias.​ Contendrá las citas bibliográficas utilizadas en la conclusión.

LAS PIPETAS EN EL LABORATORIO

Existen tres tipos de pipetas:

Con soplado o enrase simple o terminales.

Sin soplado o enrase doble o sub-terminales.

-Pipetas para contenido o pipeta de enjuague

Ejemplo: pipeta de Sahli para hemoglobina.

-Pipeta para transferencia (Mohr)

I.- PROPÓSITO DE LA PRÁCTICA

​Al finalizar la práctica el estudiante deberá estar en capacidad de:

Una dilución consiste en aumentar la cantidad de disolvente de una disolución.

Aquellas concentraciones en las cuales se expresa la concentración como cantidad de soluto en un

Cantidad de soluto = Volumen x Concentración

Si se diluye una solución, el volumen de la misma aumentará a la par que disminuye su

En el Laboratorio de Bioanálisis, principalmente en el área de Inmunología, es frecuente la

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

1 ml de sción salina Cada uno contiene 1 ml de solución salina

Dilución final: ​1:2 1:4 ​1:8 1:16​ ​1:32

El tampón bicarbonato es común en los líquidos intercelulares, mantiene el pH en valores

HCO​-​3​ + H​+​ H​2​CO​3 -​​ CO​2​ + HO

El pH se suele medir por el método colorimétrico o por el método potenciométrico. En el método

Pipetas serológicas: 0.1, 0.2, 1 y 2 ml

IV.- ACTIVIDAD PRÁCTICA

1) Preparar disoluciones, utilizando adecuadamente el material de vidrio y tomando medidas de

-Preparación de las soluciones de repollo morado:

1.- Enumere nueve (9) tubos de ensayo.

2.- Agregue 3 ml de la solución de Repollo A.

3.- Agregue las siguientes cantidades de ácido o de base que se especifican a

HCl * 0,4 0,3 0,2 0,1 0 - - - -

NaOH * - - - - 0 0,1 0,2 0,3 0,4

(*): concentración 0,1 mol/ml

1. Enumere dos tubos de ensayo.

La hemoglobina es una proteína globular pigmentada de color rojo, transportadora de oxígeno,

Las dos principales funciones de la hemoglobina son el transporte de oxígeno y ser un

La determinación de la concentración de hemoglobina se ha convertido en una de las pruebas

Se observan valores de hemoglobina elevados en policitemia vera, eritrocitosis, deshidratación,

El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un único ensayo,

La hemoglobina (Hb) es convertida a cianometahemoglobina por acción del cianuro de potasio

Todos los hemocromógenos, a excepción de la sulfohemoglobina, reaccionan completamente.

IV.- ACTIVIDAD PRÁCTICA

Determinación de hemoglobina a una muestra problema.

Estándar ------------ 20λ --------------

Muestra de sangre -------------- -------------- 20λ

Reactivo Drabkin 5 ml 5ml 5ml

a) Titulo y propósito de la práctica.

c) Cálculos. Fórmulas, promedios, porcentajes, tablas, gráficas, entre otros.

e) Referencias. Contendrá las citas bibliográficas utilizadas en la conclusión.

Al finalizar la práctica el estudiante deberá estar en capacidad de:

Dilución final: 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32

HCO-3 + H+ H2CO3 - CO2 + HO

b) Fundamento de la reacción Verde de Bromocresol

croma = color grafe = estructura