ANALISIS BACTERIOLOGICO.

El análisis bacteriológico es la fase final en la

identificación de los agentes patógenos que producen
la infección en los peces del acuario. Los métodos de
análisis suelen ser complejos y necesitan de una
cierta experiencia profesional. Nosotros hemos
simplificado los procesos resumiéndolos en los más
cercanos a las posibilidades del aficionado.

Obtención de muestras y cultivo de bacterias:

Se deben tomar muestras bacteriológicas con la

ayuda de un bastoncito de algodón estéril. La
muestra se deposita en la caja de cultivo que
contiene caldo de agar.
Las muestras se van tomando durante el examen
externo e interno del pez. Se toman de forma
cuidadosa de todos los órganos que se consideren de
interés.
Una vez tomada la muestra se introduce en el caldo
de cultivo de agar. El agar es una sustancia de uso
muy extendido en los laboratorios bacteriológicos,
que presenta una consistencia gelatinosa y esta
hecha de algas marinas. La muestra dentro de la caja
de cultivo se la deja incubar a unos 20 a 25 ºC
durante una semana. Pronto veremos como se forma
una colonia de bacterias dentro de la caja, estando
lista para su análisis microscópico.

Tinción y observación microscópica de las bacterias:

Para la observación de bacterias vivas en suspensión

lo más conveniente es la técnica de la gota
pendiente. Este método permite el estudio de la
forma y movilidad de los organismos. La movilidad
ayuda a la identificación de las bacterias. Las móviles
se mueven rápidamente en una dirección
determinada; si no lo son, se mueven sólo en razón
de los remolinos y corrientes del medio que las
rodea. Para examinar una preparación en gota
pendiente se puede usar un portaobjetos excavado o
uno normal. Si se utiliza el primero, se echa una gota
de la muestra sobre el cubreobjetos, se invierte el
porta y se va bajando hasta que la gota queda dentro
de la zona excavada, sin tocar las paredes de ésta. Se
da la vuelta a todo el conjunto, quedando la gota
suspendida del cubre sin tocar el portaobjetos. Si se
utiliza un portaobjetos normal se debe crear un
espacio circular con un poco de vaselina y se repite la
misma operación que en el caso anterior.

Para el estudio de la morfología bacteriana es más

aconsejable servirse de preparaciones teñidas. Para
ello tenemos que extender las preparaciones, fijarlas,
secarlas y teñirlas encima de un portaobjetos.

Extensión:
Se pone una gota del líquido que se va a examinar en
un extremo del porta y se extiende la más fina y
ampliamente posible. Si el líquido es muy denso se
pueden realizar diluciones con agua directamente
encima del porta. Se ponen una gota de la muestra y
una gota de agua y se mezclan.

Desecación:
Se logra agitando la preparación al aire o por calor
suave de una llama.

Fijación:
Puede obtenerse por el calor, al mismo tiempo que se
seca, o también, y es lo más aconsejable, con alcohol
más éter (mezclados en partes iguales). Se vierten
algunas gotas encima de la preparación, las
suficientes para cubrirla totalmente, y se deja secar.
Se pueden combinar ambos métodos, cubriendo la
preparación con alcohol y pasándolo por una llama.

Coloración:
Se dispone de un gran número de colorantes y hay
numerosas técnicas de coloración. Nosotros sólo
vamos a utilizar los más básicos, suficientes para
nuestros propósitos.

Método Gram:
La solución colorante de mayor importancia en
bacteriología es la de Gram. Se usa para el estudio
morfológico de los organismos y para clasificarlos en
dos grupos: organismos Grampositivos cuando se
tiñen de un color violeta, y Gramnegativos cuando
adoptan un color rojo.

Se emplean tres soluciones:

a)Violeta de genanciana fenicada:

Una solución saturada de violeta de genanciana en

alcohol (10 ml) + agua fénica al 1 % (agua con ácido
fénico) (90 ml).

b)Solución de Lugol:

Una solución de yoduro potásico (2 gr.) + yodo (1

gr.) + agua destilada (100 ml.).

c)Alcohol-acetona:

Una solución de alcohol (90 ml.) + acetona (30 ml.).

Después de fijar la preparación se cubre con unas

gotas de solución de violeta de genanciana durante
dos minutos. Se vierte el exceso de colorante por
inclinación. Sin lavar la preparación, se le añaden
unas gotas de Lugol hasta que se vuelve de color
pardo . Se deja escurrir el resto de Lugol y se añade
alcohol-acetona hasta que la preparación se decolora.
Se lava y, seguidamente, se colorea con fucsina o
safranina durante dos minutos. Se vuelve a lavar con
agua y se seca.

Método de la Tionina fenicada:

Se utiliza una solución de tionina (0,50 gr.) + alcohol
(10 ml.). Una vez efectuada la disolución se añade
lentamente agua fenicada al 1 % (100 ml.).

Se fija la preparación y se colorea con esta solución

durante cinco minutos. Se lava y se deja secar. Es un
excelente colorante tanto para bacterias como para
parásitos. Las bacterias se tiñen de un color azul
oscuro; los otros elementos en color azul claro.

Para la identificación aproximada de los agentes

infecciosos, tanto parásitos como bacterias, es
necesario consultar en la literatura al respecto;
comparando las muestras obtenidas por nosotros con
las descripciones y láminas que podemos encontrar.