TM ENERO 2020-2021

1. Haz un esquema de como realizarías una dilución 10^-6 de un cultivo

de E.coli.

2. Estudio de biomasa por dos técnicas: cuantificación de clorofila a y

análisis de la actividad del diacetato de fluoresceína. ¿Son
comparables?
No son comparables.
La determinación de clorofila a en muestras de agua nos permite una estimación de la
concentración de algas fitoplanctónicas (algas microscópicas) e indirectamente la
actividad biológica con la que se desarrollan los procesos de eutrofización debido a que
es el principal componente en la productividad primaria, que está directamente
relacionando pigmento fotosintético presente en las algas. La clorofila a también es un
indicador del grado de contaminación de los ecosistemas acuáticos y un importante
índice del estado fisiológico del fitoplancton.
Por otro lado, el análisis de la actividad del diacetato de fluoresceína consiste en que el
fluorógeno no es fluorescente y al sufrir hidrólisis pasa a fluoresceína que sí es
fluorescente, por lo que podremos medir su máxima absorbancia de la fluorescencia, se
realiza para ver la actividad de una muestra de suelos.
Microscopía de epifluorescencia -> Método directo de cuantificación de poblaciones
microbianas
Tinción de viables: mediante microscopía de fluorescencia también podemos realizar
estudios de viabilidad celular. En este caso usaremos fluorocromos que nos permiten
discriminar entre aquellos microrganismos que están viables y aquellos que no lo están.
El caso del compuesto fluorogénico diacetato de fluoresceína (FDA) se basa su respuesta
en la actividad metabólica de las células (si la célula está metabólicamente activa se
considera viable).

3. Se sospecha que hay contaminación fecal y se va a realizar un análisis

para cuantificar fagos que atacan a Shigella. Haz un esquema del
procedimiento.

1- Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo

2- Enriquecimiento en medio líquido selectivo
3- Aislamiento diferencial en medios sólidos
4- Comprobación bioquímica
5- Identificación serológica

2. El Tetrationato inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias entéricas,

excepto Salmonella. Las sales biliares estimulan el crecimiento de Salmonella e
inhibe el de las bacterias G+. El carbonato cálcico actúa de tampón para evitar el
descenso de pH provocado por la reacción de reducción del tetrationato.
3. Las sales biliares y el verde brillante actúan inhibiendo bacterias G+. El citrato y
el tetrationato inhiben el crecimiento de coliformes y Proteus. Algunos
coliformes son todavía capaces de crecer y se ponen de manifiesto por el
 colorante indicador de pH rojo neutro: las bacterias que no fermentan lactosa,
como es el caso de Salmonella y Shigella, dan colonias incoloras, mientras que
las que sí la fermentan hacen virar el rojo neutro dando lugar a colonias rosas o
rojas. Las especies productoras de SH2 dan colonias con un precipitado negro en
el centro.

4. En un lote alimenticio se quiere hacer un análisis de los mesófilos

aerobios totales. Haz un esquema e indica cómo se expresarían los
resultados.
Los mesófilos aerobios totales se miden por un recuento de viables en placa en
profundidad. Realizamos diluciones seriadas y nos quedamos con las -3, -4 y -5,
sembrando 1 ml. Como medio utilizamos un medio genérico.
Método de siembra por inclusión: la alícuota de muestra (volúmenes mayores, 1ml) se
deposita sobre una placa Petri estéril y vacía. Esta alícuota de 1ml se mezcla
posteriormente con el medio genérico fundido y atemperado. Se espera a que este
medio se enfríe y se solidifique. A partir de ahí se incuba a 35ºC con un período de
incubación de 48-72h, transcurrido ese tiempo procederemos al contaje de colonias. En
este caso tendremos en cuenta las colonias que aparezcan en la superficie, pero también
contabilizaremos las colonias generalmente de forma lenticular que aparecerán en
medio del agar. Se expresan en ufc/ml.

5. a) Batería Enterosystem. Leer resultados (foto) y conseguir el código de

identificación.
b) Test de aglutinación. Explicar en qué consiste la técnica y si en el caso de
la foto detectamos o no la presencia de Salmonella.
a)

Código numérico: 652452

Identificación: Salmonella ssp
Disponemos de una serie de pocillos. En cada pocillo va a haber un sustrato deshidratado y
procederemos a inocular cada uno de esos pocillos a partir de un cultivo puro diluido. A partir
de ahí, incubaremos a la temperatura y tiempos adecuados y una vez concluida esa incubación,
iremos observando si se ha producido un cambio de color o no para cada uno de los pocillos
presentes en el sistema miniaturizado.
En base a esa información, si ha habido un cambio de color indicará que el microorganismo es
capaz de realizar la reacción fisiológica o bioquímica que estudiamos en ese pocillo característico
e iremos obteniendo un código numérico. Finalmente, con ese código numérico iremos a las
bases de datos del fabricante y llegaremos a la identificación de nuestro cultivo puro.

b) Se preparan antisueros polivalentes contra una amplia gama de antígenos flagelares

de Salmonella para recubrir partículas de látex. Al mezclarse con una solución que
contenga Salmonella con estos antígenos, las partículas de látex se aglutinan
rápidamente, formando aglomerados visibles. Con el fin de evitar las reacciones
cruzadas con otras enterobacterias, se retiran los anticuerpos contra los principales
antígenos somáticos durante la preparación de los antisueros.
1. Dejar caer una gota del reactivo con anticuerpos sobre una de las áreas de reacción.
2. Con ayuda de una pipeta Pasteur estéril, retirar una gota del cultivo puro problema y
depositarla sobre la gota del reactivo con anticuerpos. Mezclar bien utilizando un asa de
siembra.
3. Agitar suavemente la tarjeta de reacción durante un tiempo máximo de dos minutos.
 Resultado positivo:
Si se da aglutinación de las partículas en un máximo de 2
minutos.

Resultado negativo:
Si no se da aglutinación y permanece un suspensión azul
ligera en las áreas de reacción en un máximo de 2 minutos.

6. 2 muestras de leche analizadas tanto por la técnica de la resazurina

como por recuento de placa. Comparar los resultados de las dos
técnicas.
Recuento de placa???
Prueba de la reducción de la resazurina:
Representa una modificación de la prueba de la reductasa, en que se substituye el azul
de metileno por la resazurina, colorante derivado de la oxazina. Es más sensible que el
azul de metileno para detectar ligeros cambios en el potencial de óxido-reducción, por
lo que permite obtener resultados más rápidos.
La resazurina es una oxazona que da color azul a la leche. Por la pérdida de O2 se reduce
en dos etapas: en la primera pasa por diferentes tonalidades de violeta hasta rojo-rosa,
color éste debido a la formación de resorufina. Esta etapa de reducción es irreversible.
Si la pérdida de O2 continúa, la reducción pasa a una segunda etapa reversible, en la
cual la resorufina se reduce a dihidroresorufina, compuesto incoloro que por oxidación
puede pasar de nuevo a resorufina.
Indicador: resazurina al 0,005% p/v en agua destilada estéril.
En un tubo esterilizado se mezclan 10 ml de la leche con 1 ml de
la solución colorante. Después de homogeneizar, se coloca la
mezcla durante un tiempo de incubación constante (10 min) a
37ºC y se compara el color resultante.
 7. Se requieren analizar dos microorganismos patógenos no cultivables
de un río. Se conoce su secuencia del ARN ribosómico. Explica el
procedimiento que seguirías desde la toma de muestra hasta la
expresión de resultados.
Toma de la muestra:
Aguas: Abundancia relativamente baja de microorganismos→peligro de contaminación
exterior. En superficie se utilizan frascos, bolsas, botellas, botellas lastradas, mallas.
En profundidad (recogida remota) muchos de los dispositivos están diseñados para
asegurar que la muestra proviene realmente de una localización particular. Algunos de
estos dispositivos son:
• Botellas hidrográficas (Nansen, van Dorn, botella de agua vertical): microalgas y
protozoos. No pueden ser esterilizados. A la profundidad deseada se manda un testigo
que acciona los tapones y recoge la muestra de agua a esa profundidad.
• Bolsa de Niskin: Se utiliza para muestras bacteriológicas. Consiste en una bolsa
esterilizable de polietileno con una entrada de tubo de goma sellada, que está montada
en un bastidor con un muelle. El procedimiento es similar al anterior. A la profundidad
deseada se envía un mensajero que va a provocar que el muelle extienda la bolsa y, por
lo tanto, permita la penetración del agua en el interior. Finalmente hay que subir la
botella a la superficie y proceder a su transporte y análisis posterior.

Procesado de la muestra (directo):

Debido a que se trata de agua y la concentración de microorganismos es baja, realizamos
la filtración. Básicamente, trabajamos con filtros de membrana que situamos en equipos
de filtración, fundamentalmente casetes de poliestireno esterilizables a través de los
cuales haremos pasar un volumen conocido de muestra. Los microorganismos que estén
presentes en esa muestra quedarán retenidos en los filtros de membrana. A
continuación, estos filtros se situarán en una placa Petri sobre el medio de cultivo
adecuado y se procederá a su incubación. Finalmente, realizaremos el recuento de las
colonias y dado que conoceremos el volumen de muestra, podremos expresar el
resultado como ufc por unidad de volumen muestreado.

Cuantificación por método indirecto (sondas de ácidos nucleicos al tener el ARN

ribosómico):
Si el número de microorganismos esperado es pequeño optamos por la amplificación
por PCR (soporte sólido Southern blot). Cuyo procedimiento es el siguiente:
1. Extraemos el DNA de la muestra.
2. La reacción en cadena de la polimerasa implica calentar el DNA para separar las
hebras, añadir los cebadores específicos al DNA blanco.
3. Extender, sintetizar la nueva hebra de DNA por adición de nucleótidos a los cebadores
por acción de la DNA polimerasa. En nuestro caso, los cebadores se diseñarán para
hibridar específicamente con las regiones de DNA que delimiten a la secuencia de
identidad contenida en el rRNA 16S del microorganismo que estamos buscando.
4. Después de una serie de ciclos (de nº conocido) que permitirán aumentar
exponencialmente la cantidad del DNA blanco, procederemos a la visualización de la
banda correspondiente a nuestra secuencia de identidad mediante la realización de una
electroforesis en gel de agarosa.
5. Comprobar que la secuencia amplificada es la correspondiente a nuestra secuencia
de identidad para poder confirmar realmente la detección de nuestro microorganismo
de interés. Para ello optamos por transferir esa banda desde el gel de agarosa a una
membrana y en esta proceder a hibridar con la sonda complementaria a nuestra
secuencia identidad o bien podemos proceder mediante una técnica denominada
secuenciación a leer la secuencia contenida en esa banda de DNA amplificada,
comprobando que esa secuencia se corresponde a la secuencia de identidad de nuestro
microorganismo de interés.

Prácticas:
1. Extracción de los ácidos nucleicos
2. Cebadores -> PCR amplificación mediante polimerasas
3. Ver resultados -> electroforesis en gel de agarosa

1. Columnas de adsorción: hacer una pequeña cromatografía

1º. Romper células (lisis)
2º. Ácidos nucleicos quedan pegados a la membrana columna, unión
3º. Lavado de la columna para eliminar residuos
4º. Recuperar ácidos nucleicos de forma concentrada, elución para tener el extracto
• 20 ml agua problema -> centrifugar 2 min 1200 rpm
• Nos quedamos con el precipitado, incubar con 20 µl de lisozima (romper los
enlaces β 1-4 peptidoglicano, romper membrana) -> 37ºC, 30 min
• +160 µl de tampón de lisis (detergentes para desnaturalizar proteínas, romper
membrana) +20 µl proteinasa K -> incubar 55ºC, 1h
• +200 µl tampón lisis/unión (preparar para la unión) -> 70ºC, 10 min
• +100 µl isopropanol (romper las dos fases que se forman del isopropanol y los
tampones)
• Transferir a una columna todo lo previo -> centrifugar 60 sg, 8000 rpm
Después los ác. Nucleicos quedan en la membrana de la columna y los residuos
del tubo colector desechar, volver a meter con columna
• +500 µl etanol -> centrifugar 60 sg, 12000 rpm
• +500 µl tampón lavado -> centrifugar 60 sg, 12000 rpm
• +500 µl tampón lavado -> centrifugar 60 sg, 14000 rpm -> para asegurarnos de
eliminar todo el etanol
• Retirar colector residuos. Centrifugar a máx velocidad 90 sg, eliminar etanol
• Quitar colector, situar la columna en un Ependorf nuevo
• +50 µl tampón elución -> 60 sg
• Centrifugar 60 sg, 14000 rpm -> -20ºC, 24h

2. Mezcla de reacción
• Completar con H2O destilada -> 15 µl
 • Molde de DNA (extracto de ayer) -> 10 µl
• Enzima polimerasa: sintetiza la nueva cadena de DNA -> añadir 10 µl, lo último
que se añade
dNTPs (nucleótidos), incluidos en la polimerasa
cebadores (2): uno para cadena -> forward (lee hacia delante -> 1 µl) y reverse
(lee hacia atrás -> 1 µl)
• Centrifugar -> termociclar (1h 28min)
Qué ocurre en la PCR?
1º. Etapa de desnaturalización: separar las dos cadenas de DNA. Subida de Tª a 90ºC
2º. Etapa alineamiento: unión cebadores a secuencia complementaria e hibridan. 60ºC
3º. Etapa extensión: polimerasa comienza a sintetizar, repite 35 ciclos. 72ºC

3. Visualización con electroforesis en gel de agarosa

10 µl de la mezcla de reacción + 4 µl del tampón de carga (tiene glicerol (más densidad
y facilita el cargado)) y colorantes (ver dónde está el frente de electroforesis)

TMIC junio 2020-2021

1. 2 tipos de inoculación en placa los que nosotros quisiéramos.

La inoculación en placa se trata de un recuento de viables aerobios. En estas prácticas
hemos realizado 2 para 2 tipos diferentes, para el recuento de mesófilos aerobios totales
y para enterobacterias.
En el caso de mesófilos aerobios totales realizamos una serie de diluciones seriadas a
partir del agua problema, nos quedaremos con las 3 últimas diluciones (-3, -4 y -5). Para
cada una de estas diluciones realizamos dos placas de inclusión, utilizando como medio
uno genérico. Incubación 35ºC durante 48-72 h.
En el caso de las enterobacterias, también realizamos una serie de diluciones seriadas y
nos quedamos con 2 (-1 y -2). Al igual que antes, hacemos 2 placas de inclusión de cada
dilución, utilizando como medio VRBG (cristal violeta, rojo neutro, bilis y glucosa),
selectivo y diferencial. El cristal violeta y la bilis inhiben el crecimiento de las bacterias
G+ y el rojo neutro, al ser un indicador de pH, mostrará cambio de color con la
fermentación (degradación de glucosa a ácido). Una vez solidificado el agar, para forzar
las condiciones de anaerobiosis, añadir una segunda capa de agar y dejar solidificar. Esto
limitará la difusión del oxígeno al medio de cultivo, limitando el crecimiento de
microorganismos aerobios. Las enterobacterias crecerán dado que son anaerobias
facultativas. Incubación 37ºC durante 48h.
Método de siembra por inclusión: la alícuota de muestra (volúmenes mayores, 1ml) se
deposita sobre una placa Petri estéril y vacía. Esta alícuota de 1ml se mezcla
posteriormente con el medio genérico fundido y atemperado. Se espera a que este
medio se enfríe y se solidifique. A partir de ahí se incuba a 35ºC con un período de
incubación de 48-72h, transcurrido ese tiempo procederemos al contaje de colonias. En
este caso tendremos en cuenta las colonias que aparezcan en la superficie, pero también
contabilizaremos las colonias generalmente de forma lenticular que aparecerán en
medio del agar. Se expresan en ufc/ml.
 2. La siembra de los anaerobios mesófilos del análisis de alimentos,
pero en una crema.
Una vez realizado la toma de la muestra y hecho las diluciones seriadas, determinaremos
el número total de microorganismos anaerobios mesófilos siguiendo la técnica de
recuento en placa por siembra en superficie, e incubando a 32ºC en condiciones
anaerobias utilizando una jarra de anaerobiosis (medio de cultivo: agar genérico).
Incubar 72h y expresar resultados en ufc/g o ufc/ml.
Una vez sembradas las placas, la incubación se realiza en una atmósfera limitante en
oxígeno para favorecer el crecimiento de los microorganismos anaerobios y anaerobios
facultativos y limitar el de los microorganismos aerobios. Utilizaremos para ello las jarras
de anaerobiosis, recipientes herméticos en los que se modifica la composición de la
atmósfera interna. Es preferible utilizar placas Petri de plástico del tipo venteado para
ayudar a la transferencia del aire entre las placas y la jarra.
• Localizar las placas inoculadas en la jarra de anaerobiosis.
• Abrir un sobre de generador de anaerobiosis, retirar el saco de papel del
generador y localizarlo inmediatamente en la jarra en el compartimento interior
de la misma diseñado para este fin. Entre que se introduce el saco en la jarra y
se cierra herméticamente ésta, debe transcurrir menos de un minuto. Puede
añadirse un indicador de condiciones de anaerobiosis (un colorante que cambia
de color entre los estados oxidado y reducido, como el azul de metileno).
• Cerrar la tapa de la jarra inmediatamente.
• Incubar en las condiciones adecuadas y observar las placas para la presencia de
anaerobios.
Generador de anaerobiosis:
El generador consiste en unos sacos que se introducen en la jarra de anaerobiosis para
generar una atmósfera libre de oxígeno. El compuesto activo es normalmente ácido
ascórbico. El oxígeno de la atmósfera de la jarra es rápidamente absorbido con la
generación simultánea de CO2. El nivel de oxígeno se reducirá a menos del 1% en 30
min, mientras el CO2 aumentará hasta el 9-13%.

3. El análisis de aguas para coliformes que hay dos técnicas.

El análisis de aguas se realiza primero por filtración, ya que el agua tiene una baja
concentración de microorganismos y la tenemos que aumentar. Luego para el recuento
de un tipo determinado de microorganismo utilizaremos una técnica diferente.
En el caso de coliformes tenemos los coliformes totales y los coliformes fecales:
Coliformes totales: son indicadores de contaminación fecal (patógenos entéricos) y son
fermentadores de lactosa con producción de ácido y gas (también aldehídos). El medio
que se utiliza es EWDO, que tiene un reactivo de Schiff que los aldehídos reaccionan con
él, de forma que se dan colonias rojas brillantes en caso de presencia de coliformes
totales. El volumen usado son 50 ml. La incubación será a 37ºC durante 48h y para la
expresión de los resultados se realiza a 100 ml.
Coliformes fecales: son un tipo de coliformes totales, pero más específicos como
indicadores de contaminación fecal. Además, van a fermentar la lactosa a 44ºC con un
tiempo de incubación de 24h. El medio utilizado es mFC (azul de amilina) que provoca
un cambio de color con la fermentación de lactosa, dando colonias azules en caso
afirmativo. El volumen usado es de 50 ml y para la expresión de los resultados se tienen
en cuenta 100 ml.
Otra forma de recuento de Coliformes totales es mediante colimetría de NMP (número
más probable). Utilizamos un caldo lactosado de doble concentración, MacKonkey.
• Prueba presuntiva
Realizamos tres tipos de preparaciones: una con 10 ml de agua problema, otra con 1 ml
y otra con 0,1 ml. En cada uno le echamos 10 ml de MacKonkey y realizamos un
triplicado de cada uno, de forma que al final obtenemos 9 tubos. Los 9 tubos los
incubamos a 37ºC durante 48 h.
Características a comprobar:
- Si hay turbidez: sí -> crecimiento microbiano
- Cambio de color: sí fermentan la lactosa -> extracción de ácido -> púrpura de
bromocresol (indicador de pH) pasa de púrpura a amarillo
- Aparición de gas (por la fermentación de lactosa): sí gas -> queda atrapado en la
campana de Durham
• Prueba confirmativa
Mirar tubo a tubo a ver si hay cambios: sí hay cambios -> tubos presuntivos +
Sembrar a partir de los + por una técnica de siembra (agotamiento de inóculo en estría)
en un medio selectivo y diferencial -> Levine EMB (eosina azul de metileno). Es selectivo
por la lactosa y es diferencial por el indicador de pH.
• Resultados
Placa eosina azul de metileno con iridiscencia -> sí hay coliformes totales.
Luego calcularemos cuántos hay por la tabla del número más probable (NMP).

4. El recuento de bacteriófagos y cuando había que usar esa técnica.

La detección de bacteriófagos de E. coli se trata de un método para detectar episodios
de contaminación fecal cuando las bacterias del grupo coliformes ya no están viables.
Los fagos tienen mayor capacidad de supervivencia que las células hospedadoras, por lo
tanto, podemos detectar fagos de E. coli cuando no detectamos contaminación fecal.
1. Pre-enriquecimiento: multiplicación de los fagos E. coli
Para ello mezclamos 20 ml del agua problema con 20 ml de un medio líquido general
TBS (caldo de tripticasa de soya con 1% de NaCl) que se usa para que crezcan las células
hospedadoras (para enriquecer) y también con 200 µl de cultivo E. coli en fase
exponencial (le están dando E. coli al fago, maquinaria biosintética de la célula sintetice
proteínas del virus). Luego se realiza una incubación a 37ºC durante 10 h buscando la
replicación de E. coli.
2. Obtener una suspensión de fagos libre de restos celulares
Para ello vertemos 1 ml de la muestra en un Eppendorf y lo centrifugamos durante 3
min a 14000 rpm. Nos quedamos con el sobrenadante, que será una suspensión de fagos
sin células.
3. Detección de actividad fágica mediante la técnica de calvas o placas de lisis
Cogemos 200 µl de la suspensión de fagos y lo juntamos con 200 µl de cultivo E. coli en
fase exponencial y con 8 ml de TSA 0,8% fundido, se trata de un medio general
semisólido de 0,8-0,9% de agar. Mezclamos todo esto por rotación y lo vertemos todo
en una placa Petri con TSA sólido. Una vez solidificado, le damos la vuelta y lo incubamos
a 37ºC durante 18 h.

Resultados: obtenemos una placa opaca, quiere decir que hubo sobrecrecimiento, por
lo tanto, hay E. coli. Si no hubiese sobrecrecimiento, lo que veríamos sería que en
presencia de zonas de aclaramiento significaría que hay presencia de bacteriófagos (las
células han sufrido lisis).
Se trata de un estudio cualitativo, en que podemos medir presencia/ausencia de
bacteriófagos en el agua problema. No podemos hacer un estudio cuantitativo porque
ha tenido una fase de multiplicación (pre-enriquecimiento).

5. El enterosystem y por el test de aglutinación de salmonella.

a)

Código numérico: 652452

Identificación: Salmonella ssp
Disponemos de una serie de pocillos. En cada pocillo va a haber un sustrato deshidratado y
procederemos a inocular cada uno de esos pocillos a partir de un cultivo puro diluido. A partir
de ahí, incubaremos a la temperatura y tiempos adecuados y una vez concluida esa incubación,
iremos observando si se ha producido un cambio de color o no para cada uno de los pocillos
presentes en el sistema miniaturizado. En base a esa información, si ha habido un cambio de
color indicará que el microorganismo es capaz de realizar la reacción fisiológica o bioquímica
que estudiamos en ese pocillo característico e iremos obteniendo un código numérico.
Finalmente, con ese código numérico iremos a las bases de datos del fabricante y llegaremos a
la identificación de nuestro cultivo puro.

b) Se preparan antisueros polivalentes contra una amplia gama de antígenos flagelares

de Salmonella para recubrir partículas de látex. Al mezclarse con una solución que
contenga Salmonella con estos antígenos, las partículas de látex se aglutinan
rápidamente, formando aglomerados visibles. Con el fin de evitar las reacciones
cruzadas con otras enterobacterias, se retiran los anticuerpos contra los principales
antígenos somáticos durante la preparación de los antisueros.
1. Dejar caer una gota del reactivo con anticuerpos sobre una de las áreas de reacción
2. Con ayuda de una pipeta Pasteur estéril, retirar una gota del cultivo puro problema y
depositarla sobre la gota del reactivo con anticuerpos. Mezclar bien utilizando un asa de
siembra.
3. Agitar suavemente la tarjeta de reacción durante un tiempo máximo de dos minutos.
Resultado positivo:
Si se da aglutinación de las partículas en un máximo de 2
minutos.

Resultado negativo:
Si no se da aglutinación y permanece un suspensión azul
ligera en las áreas de reacción en un máximo de 2 minutos.

6. El FDA.
Los compuestos filogenéticos se transforman enzimáticamente en productos
fluorescentes que se pueden visualizar mediante microscopía de fluorescencia. La
fluoresceína presenta un anillo central y dos lugares de sustitución que pueden estar
ocupados por diferentes radicales, que en el caso del diacetato de fluoresceína (FDA)
son dos radicales acetatos.
Los derivados de la fluoresceína pueden ser hidrolizados por lipasas, esterasas y
parcialmente por proteasas. La reacción puede ser catalizada por las células completas
y por enzimas extracelulares. Los microorganismos, algas, protozoos y algunos tejidos
animales son capaces de catalizar esta reacción. Los ésteres de fluoresceína no son
polares y pueden ser transportados fácilmente a través de la membrana de las células
activas. Por el contrario, los productos fluorescentes son polares y permanecen en el
interior de la célula. Debido a ello, esta técnica puede ser utilizada para teñir células
microbianas activas en cultivos puros y también en suelos, pero no para esporas o
células en la fase estacionaria del crecimiento.
La hidrólisis de FDA (3,6-diacetil-fluoresceína) se ha utilizado para estimar la actividad
microbiana en diversos sustratos.
El método se basa en la estimación de la fluoresceína producida en una muestra tratada
con FDA e incubada a 20ºC
• Primero de la muestra hacemos 2 tubos de 4 ml cada uno, uno será el control y
otro el ensayo
 • Luego los centrifugamos a 800 rpm durante 10 min
• Nos quedamos con el sedimento y lo resuspendemos en 4 ml de PBS (condición
fisiológicamente óptimas)
• Añadimos el FDA a una concentración final de 20 µg/ml
Control: añadir inmediatamente acetona 50:50 para desnaturalizar proteínas y
matar células
Ensayo: incubar a 20ºC durante 3 h (registrar tiempo) y luego añadir la acetona
50:50 para parar la reacción
• La suspensión de ambos la centrifugamos 4000 rpm 5 min
• Medir la absorbancia a 490 nm y calcular (µg FL/10^6 · h)
Microscopía de epifluorescencia -> Método directo de cuantificación de poblaciones
microbianas
Tinción de viables: mediante microscopía de fluorescencia también podemos realizar
estudios de viabilidad celular. En este caso usaremos fluorocromos que nos permiten
discriminar entre aquellos microrganismos que están viables y aquellos que no lo están.
El caso del compuesto fluorogénico diacetato de fluoresceína (FDA) se basa su respuesta
en la actividad metabólica de las células (si la célula está metabólicamente activa se
considera viable).

7. La FISH para familias.

Hibridación in situ fluorescente (FISH):
La unión de una sonda a los ribosomas de una célula puede observarse por microscopia
ya que dicha sonda ha sido marcada previamente con un marcador fluorescente. Las
células deben tratarse con los reactivos apropiados para que sus membranas se vuelvan
permeables y permitan la entrada de la mezcla de sonda con el marcaje fluorescente. Al
hibridar la sonda con el rRNA de los ribosomas, las células se vuelven fluorescentes y
pueden observarse bajo el microscopio de fluorescencia. Esta técnica, FISH, se utiliza
ampliamente en ecología microbiana para la identificación y la estimación de
comunidades microbianas mediante observación directa al microscopio y también se
utiliza mucho en diagnóstico clínico para la identificación rápida de patógenos
específicos de muestras clínicas sin necesidad de obtener cultivos puros previamente.

Este método es útil cuando buscamos grupos de microorganismos con un elevado

número de representantes en la muestra o cuando buscamos microorganismos que
pertenecen a un taxón a un nivel no muy específico (representantes pertenecientes a
una determinada familia).
Las sondas de ácidos nucleicos penetran en el interior de la célula sin lisarla, donde
hibridarán con su secuencia complementaria, la secuencia diana, presente en el
microorganismo que estamos buscando. El procedimiento es el siguiente:
1. Fijamos las células para mantener su estructura (formaldehído).
2. Inmovilización den filtros de membrana o fibra.
3. Las células se tratan para hacerlas permeables y permitir la entrada de la sonda al
interior celular.
4. Si la sonda debe hibridar con DNA, se separan las hebras del DNA celular.
5. Se añade la sonda marcada. Existen dos tipos de marcajes, con radioisótopos (se usa
menos) o con fluorocromos.
6. Se produce la hibridación (tiempo variable 1-3h).
7. Se lava para eliminar el exceso de sonda o si está unida de manera inespecífica.
8. Se detecta la hibridación por autoradiografía si estamos usando radioisótopos o
mediante microscopía de fluorescencia si utilizamos fluorocromos.
Una de las grandes ventajas de esta técnica es que, utilizando diferentes sondas de Ac
nucleicos marcadas con un fluorocromo específico, es posible tratar la misma muestra
microbiológica con varias sondas a la vez y por tanto identificar y cuantificar diferentes
tipos de microorganismos al mismo tiempo.

Prácticas:
• Conseguir permeabilización de la membrana para que la sonda entre
Mantener la estructura intacta -> fijación con formol
10 ml de cada agua fijada con formol 3%, 3h, 4ºC
• Inmovilizar las células con filtros
Filtrar con poros de 0,2 µm
Obtener células todas en el mismo plano
• Permeabilizar (alcohólica)
Sonda llegue a los ribosomas
Soluciones de diferentes concentraciones crecientes de etanol
+3ml H2O (lavado)
+3ml etanol 50%
+3ml “ 80%
+3ml “ 100%
• Incubación en presencia de la sonda universal EUB 338
Quitar los filtros
Secuencia sonda: 5´- GCT GCC TCC CGT AGG AGT -3´
En el extremo 5´ marcado con fluorocromo SYTO-13
+30 µl sonda +220 µl tampón de hibridación
46ºC en termobloque (desnaturalizar), 1 h, en oscuridad (para proteger
fluorocromo)
• Lavado con tampón de lavado -> para eliminar restos de sonda
+250 µl tampón de lavado, 48ºC, 5 min, oscuridad
• Secado + montaje al microscopio
Sacar filtro, lavar con etanol y pinzas
 Portaobjetos -> aceite -> filtro -> aceite -> cubre
Aplastar
Microscopio fluorescencia
Final:
Absorber energía luminosa de una determinada longitud de onda
Los electrones saltan a orbitales de energía superior y vuelven a bajar -> emiten energía
luminosa
Longitud de onda emisión > longitud de onda absorción
SYTO-13: absorbe 428 nm de long. De onda
Emite 525 nm de long. De onda -> color verde
Secuencia identidad por todo el citoplasma (ribosomas)
La sonda entra en la célula por disminuir permeabilidad, si encuentra complementaria
para hibridar y será excitada apareciendo de color verde.