DETERMINACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LOS VITÁMEROS DE LA VITAMINA

E (TOCOFEROL Y TOCOTRIENOLES) EN CEREALES UTILIZANDO

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION(HPLC)
INTRODUCCIÓN
Los tocoferoles y tocotrienoles (tocoles) son un grupo de compuestos lipídicos solubles
reconocidos como un término genérico para la vitamina E. Esta vitamina tiene una potente
actividad antioxidante ya que inhibe la oxidación de constituyentes celulares como colesterol
LDL previniendo o retrasando enfermedades cardiacas coronarias, además también protege
contra el cáncer estimulando funciones inmunitarias e induciendo apoptosis (García, 2006).
El creciente interés en las propiedades antioxidantes de los cereales y los productos a base
de cereales ha impulsado el desarrollo de un método sencillo y fiable para la determinación y
cuantificación simultánea de importantes fitoquímicos como la vitamina E (α, β, γ y δ
tocoferoles (T) y tocotrienoles (T3) (García, 2006; Cobo, 2001), lo cual ha sido probado en
diferentes especies de cereales como, el arroz, centeno, trigo, cebada, maíz. La
cromatografía líquida de alta resolución es una técnica que ha sido usada para identificar y
cuantificar estos vitámeros de la vitamina E (Ziegler y Filer, 1997).

MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos y muestras
Agua miliQ, Agua destilada, hexano, metanol, acetonitrilo, Solución Ac. Ascórbico, Solución
de KOH, Etanol absoluto. Acetona, ácido acético. Patrón de Vitamina E. Muestras de
cereales arroz, centeno, cebada, trigo.
Cristalería
Pipeta volumétrica de 10 ml, Probetas de 50 ml, Probeta de 25 ml, Pipetas Volumétricas de
20 ml, Beakers de 25, 50 y 100ml, envases de 250 ml con rosca para almacenar solvente,
Envase de 500 ml con rosca para almacenar fase móvil.
Equipos
Se utilizó un sistema HPLC Agilent equipado con un inyector automático, un desgasificador,
un termostato de columna, una bomba binaria y un detector de matriz de diodos para la
determinación de vitamina, Micro jeringa para HPLC de 50 μl, Columnas Merck, Balanza
Analítica, Sonicador, molino de martillo, vortex, filtros descartables, Espátulas de Metal,
Soportes de Metal, Agitadores magnéticos, Papel Aluminio, Pipeteador.
Métodos
Preparación de solución estandar
Se preparó una mezcla estándar que contenía los 8 vitámeros (α-, β-, ɣ- y δ -tocoferoles
tocotrienoles, en proporciones. Como patrón interno se utilizó una solución de tocol (Matreya
Inc., PA USA) con una concentración de 500 ug/ml en n-hexano. Como antioxidante se
utilizó una solución de butilhidroxitolueno (Aldrich, Madrid, España) preparada en n-hexano
con una concentración de 10 mg/ml (Amaral J. S., et. al. 2007; Ryynanen, 2004; Katsa, M.,
2021).
Preparación de muestras
Todas las muestras de se molieron en un molino (Retsch, modelo ZM 1000) con tamiz de
0,25 mm. Los granos de arroz se molieron utilizando un molino descascarillado (Taka Yama
MTH-35) (Irakli, 2011; Ryynanen, 2004).
Extracción con saponificación
En total, 0,1 g de muestra de cereal agrupada bien homogeneizada (en blanco o enriquecida
con 200 µL de soluciones de T y T3 con una concentración que oscila entre 0,1 y 20 µm/ml
se colocó en un tubo de ensayo con tapón de rosca de 15 mL con 2 mL de etanol absoluto y
0,1 g de ácido ascórbico como antioxidante. Después de mezclar en vórtex durante 1 min, el
tubo de ensayo se colocó en 801C al baño maría durante 5 min. Después de sacarlos del
baño de agua. Se añadió 10 mL de solución de hidróxido de potasio (80% p/v, en agua). La
muestra se agitó durante 20 s, luego se volvió a colocar en el baño de agua durante 15 min y
se mezcló cada 5 min durante
0.1 g muestra
la saponificación. El tubo de 2 ml Et-abs
0.1 g Ac. 10 ml KOH (80 p/v)
ensayo se dejó enfriar a Ascórbico +
Agitación 20 s
temperatura ambiente y se 1 min
80ºC,
5 min Baño maría
centrifugó a 3000 rpm durante Por 15 min y mezcla
por 5 min
Sobrenadante se retira
+
5 min. El sobrenadante se a un nuevo tuvo y el
residuo se vuelve a Centrifugación Enfriamiento
Se combinan los agitar con etanol, por 3000 rpm, 5 min a T ºC amb.
Se sónica por 1 min
retiró a un tubo de ensayo extractos dos veces

nuevo y el residuo se volvió a

extraer con 2 ml de etanol
mediante sonicación Figura 1 Ilustración esquemática de los procedimientos
experimentales
durante 1 min. El tubo
de ensayo se centrifugó y el sobrenadante se combinó con el extracto anterior. Este
procedimiento se repitió una vez más utilizando 1 mL de etanol. Los extractos combinados
se filtraron a través de un filtro de 0.22 μfiltro mRC, transferido a un vial de vidrio e inyectado
al sistema HPLC. En la siguiente figura 1 se puede observar de forma esquematica los pasos
a seguir para la extración de las vitaminas (Irakli, M. N, et. Al., 2011; Katsa, M., et. Al., 2021;
Panfili, G., et. Al., 2003; Pironen et al., 1986; Ryynänen, M., et. al. 2004).
Condiciones cromatográficas
Acondicionamiento de la columna a flujo de 1 ml/min
Lavado de la columna a flujo de 1 ml/min
Tabla 1. Condiciones cromatográficas para la determinación de Vit. E en cereales.

Parámetro Condiciones
columna C180, (5μm, 250 mm×4,6 mm)
(A)metanol (95%) y (B)
acetonitrilo (5%) para arroz;
fase movil Otros cereales: hexano/acetato
de etilo/ácido acético
(97,3:1,8:0,9 v/v/v)
Volumen de
20 μl
inyección
Detector 294 nm
Flujo 1,2 ml/min
Temperatura 30ºC
Fuente: Katsa, M., et. Al., 2021; Panfili, G., et. Al., 2003

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En principio de las pruebas realizadas en distintos tipos de cereal se realizó una calibración
con el patrón de la vitamina E, en la cual nos dio como resultado el tiempo de retención de
los vitámeros como se evidencia en el
cromatograma de la Figura 2. (Panfili et. al.,
2003). la cual sirvió como guía para la
determinación de tocoferoles y
tocotrienoles en diferentes especies de
cereales como el arroz, centeno, trigo,
cebada y maíz, se encontró como base de
información el contenido de vitamina E en
dichos cereales como se observa en la
Tabla 2. (Diaz, 2021; Myazawa et. al.,
2011; Primo Yúfera, 1998).
Entre los cromatogramas obtenidos se
observa claramente la separación de tocoles Figura 2. Cromatograma de patrones
en una muestra de cebada que se muestra en puros de tocoferoles (Panfili et. al., 2003)

figura 2. en una corrida de 25 min los ocho homólogos de la vitamina E se separaron en la

línea base y se eluyeron de la siguiente
 maneara: α-tocoferol, α-tocotrienol, B-tocoferol,
γ-tocoferol, B-tocotrienol, γ-tocotrienol, δ-
tocoferol y δ-tocotrienol (Panfili et. at., 2003).
De la misma manera tocoferoles y tocotrienoles
en muestras de centeno mostraron mismos
resultados que la cebada con la variación de
distintos tiempos.
En
Figura 3. Cromatograma de muestras de cereal de arroz se determinó que
tocoferoles en muestras cebada
la vitamina E aparece en el mismo tiempo de

retención de 10 min similar a los tocoferoles que

las otras muestras (Kariluoto et al., 2001;
Pironen et al., 2002).
Los vitámeros existentes en las distintas
muestras de cereales se pueden distinguir por
el número y la ubicación de los grupos metilo en
su anillo de cromanol. La tabla 3 nos
proporciona la actividad de la vitamina E,
expresada por los equivalentes de tocoferoles

Figura 4. Cromatograma de tocoferoles

en muestras de centeno (Pironen et. al.,
1986)
(TE). La cebada es la mejor fuente de vitámeros
de vitamina E, se detectan los ocho isómeros,
con un promedio de tocoles totales. Los
tocoferoles y tocotrienoles totales que se
consiguieron cuantificar fueron 72,1 mg/kg para
 avena, 56,5 mg/kg en espelta, 60,6 mg/kg en
trigo duro, 74,3 mg/kg en trigo blando, 66,9
mg/kg en maíz, 74,7 mg/kg en cebada y 68,3
mg/kg para muestras de triticale (Panifili 2003;
Piironen et al., 1986; Gasior, R., et. al., 2009).
La mayoría de los efectos en el cuerpo humano
se deben a su acción como antioxidantes
Figura 5. Cromatograma de
tocoferoles en muestras de arroz solubles en lípidos (Schwenke, 2002; García,
(Katsa M. et. al., 2021) 2006; Cobo, 2001; Rossy, F., et. al. , 2003)

Tabla 3. Contenido de tocoferol (T) y tocotrienol (T3) en µg/g expresado como

media7DAKOTA (Panfili et. al., 2003; Irakli, M., et. Al., 2011)

Distintos autores indican que el α-tocoferol es el compuesto natural que revela mayor
actividad de vitamina E. Esta sustancia tiene tres centros quirales en los cuales los grupos
metilo se presentan con la configuración R. Todos los tocoferoles y tocotrienoles naturales
exhiben menos del 50% de la actividad del R,R,R-α-tocoferol, por lo mencionado de Guiomar
Sanches se podría deducir que al ser el alfa tocoferol el compuesto con mayor actividad se
evidencia que la familia de estos presentan una mayor actividad en comparación con los
tocotrienoles(Cortés L. Y., 2012; Blé-Castillo, J. L. et. al., 2008; Zielinski, H. et. al., 2008);
Shammugasamy, B., 2013)

CONSLUSIÓN
En conclusión, el método de determinación propuesto es lo suficientemente sensible y
selectivo para la evaluación del contenido de los ocho isómeros de vitamina E en muestras
de cereales. Teniendo en cuenta las diferentes actividades antioxidantes de los ocho
vitámeros de vitamina E, los datos cuantitativos sobre tocoles individuales pueden ser útiles
en la evaluación de los valores saludables y nutricionales de una muestra de interés. El
método propuesto podría considerarse también como una herramienta útil para el análisis de
mezclas compuestas por diferentes especies de cereales, ya que el α-tocoferol es la forma
más ampliamente distribuida y activa en el ser humano mientras que el β-tocotrienol es el
menos activo. También se puede decir que la aplicabilidad del método de preparación de
muestras recomendado dio resultados satisfactorios en la determinación de vitámeros en
muestras de los cereales estudiados examinando, las cantidades y la distribución de
tocoferoles y tocotrienoles determinadas e identificadas.
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Cromatografía líquida de alta resolución determinación de tocoferoles y tocotrienoles
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