CARACTERIZACION GENETICA DE CINCO POBLACIONES DE

TIMPINCHILE (CAPSICUM ANUUM) DEL ESTADO DE CHIAPAS

García Senosiain, A.(1); Álvarez Gutiérrez, P. E.(2); García Almendarez, B. (1)
(1)
Facultad de Química
Universidad Autónoma de Querétaro
(2)
Ingeniería Agroindustrial
Universidad Politécnica de Chiapas

RESUMEN
En este trabajo se estudiaron cuatro poblaciones de timpinchile (Capsicum annuum) procedentes
de diferentes municipios del estado de Chiapas, México. Las poblaciones fueron: Chiapa de
Corzo, Ixtapa, Ostuacán y Santa Rosa para un total de 41 plantas estudiadas. Se estudiaron la
relación filogenética entre cada uno de los grupos y dentro de cada grupo. Para esto se emplearon
técnicas de biología molecular. Específicamente se emplearon DNA satélite como marcador
molecular para establecer los parentescos.

INTRODUCCION
El chile (Capsicum annuum) es el nombre común de una planta y su fruto pertenecientes al
género Capsicum ampliamente cultivada alrededor del mundo.
El chile se originó en Mesoamérica y a partir del descubrimiento de América inició su expansión
hasta llegar ser ampliamente cultivado alrededor del mundo. Registros fósiles demuestran que la
planta era cultivada hace por lo menos 6,000 años. Esta planta tenía una gran importancia en la
gastronomía de los pueblos mesoamericanos y era también usado en la medicina tradicional.
Inicialmente, los botánicos europeos pensaron que se trataba de una planta relacionada con la
pimienta (género Piper). Actualmente se clasifica al chile dentro del género Capsicum.
El fruto (una baya) es de tamaño y coloración variable. Es hueco en el centro y contiene muchas
semillas pequeñas, circulares, aplanadas y amarillentas. En este fruto se encuentra precisamente
la importancia comercial de la planta.
México ocupa el segundo lugar mundial en producción de chile y tiene un gran peso en la
economía de algunas regiones. A pesar de esto, México tiene un promedio de rendimiento por
hectárea bajo, muy inferior al promedio mundial. Esto se debe a la poca tecnología empleada y al
escaso aprovechamiento de la amplia diversidad existente en el país. La demanda mundial de
chile está desde hace varios años en un continuo crecimiento, lo cual representa un área de
oportunidad. Hasta ahora el incremento de la demanda ha sido cubierto principalmente por China
mientras que la producción en México se ha mantenido prácticamente estancada. Mejorando el
rendimiento por hectárea de este cultivo se podría aprovechar el mercado en continuo aumento.
Esto representaría un significativo incremento en el nivel de vida de miles de familias en México,
en su mayoría de escasos recursos.
La producción en México se ha mantenido estancada en los últimos años a pesar de que el
volumen mundial de las importaciones se incrementó un 128% entre 1993 y 2004. En este mismo
periodo el valor de las importaciones de chile aumentó 196%. Un incremento del que no hemos
sabido sacar provecho.
Se trata en definitiva de un área de oportunidad muy importante. Las causas de este rezago son
principalmente el escaso empleo de la tecnología y el poco aprovechamiento de la riqueza
genética que posee México.
EXPERIMENTAL
Para la extracción de ADN se tomaron tres o cuatro hojas de cada planta. De cada población se
eligieron las plantas que estaban libres de virus. Las hojas se colocaron en nitrógeno líquido para
evitar su degradación durante el transporte. El material se molió en un mortero con nitrógeno
líquido previamente rotulado hasta formar una pasta. Esta se colocó en un tubo Eppendorf y se
agregó 1ml de solución de extracción (tabla1). Inmediatamente se añadieron 100µL de una
solución de cloroformo-alcohol isoamílico en una proporción de 24 a 1. Los tubos se incubaron a
65º C durante 45 minutos.

TABLA 1 COMPOSICION DE LA SOLUCIÓN DE EXTRACCION

REACTIVOS CONCENTRACION CANTIDAD PARA 500 ML

Tris base 100 mM 6.05 g
EDTA 20 mM 20 ml
NaCl 1.4 M 40.9 g
CTAB 2% 10 g
PVP 1% 5g
Bisulfito sódico .1 % .5 g
Beta-mercaptoetanol .4 % 2 ml

Una vez pasado el tiempo de incubación los tubos se dejaron enfriar a temperatura ambiente y se
equilibraron con la solución de alcohol-isoamílico. Luego se centrifugaron las muestras a 10,000
rpm durante 7 minutos a 4º C para evitar la degradación. Se rescató el sobrenadante de cada
muestra y se le añadió 1ml de etanol al 95%. La mezcla se incubó durante 30 minutos a 4º C para
someterla posteriormente a una nueva centrifugación a 10,000 rpm durante 5 minutos para
provocar la sedimentación del ADN. Se desechó el sobrenadante. Posteriormente se procedió a
incrementar su pureza.
Se agregaron 300µL de solución de lavado 1 (tabla 2) y se centrifugó a 10,000 rpm durante 5
minutos. Se volvió a desechar el sobrenadante y se agregaron 300µL de solución de lavado 2
(tabla 3). Una vez más se centrifugaron los tubos a 10,000 rpm por 5 minutos y se eliminó el
sobrenadante.

TABLA 2 COMPOSICION DE LA SOLUCION DE LAVADO 1

REACTIVOS CONCENTRACION CANTIDAD PARA 100 ML

Etanol 76 % 76 ml
Acetato sódico .2 M 2.72 g

TABLA 3 COMPOSICION DE LA SOLUCION DE LAVADO 2

REACTIVOS CONCENTRACION CANTIDAD PARA 100 ML

Etanol 76 % 76 ml
Acetato de amonio 10 mM .077 g
Las muestras se dejaron secar a temperatura ambiente durante 24 horas para favorecer su
conservación y facilitar su transporte.
En total se hicieron 41 extracciones que correspondían a las siguientes poblaciones: Chiapa de
Corzo 10, Ixtapa 10, Ostuacán 16 y Santa Rosa 5.
Para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se seleccionaron cinco primers para dirigir la
amplificación del ADN (Tabla 4)

TABLA 4 CARACTERISTICAS DE LOS PRIMERS EMPLEADOS

NOMBRE TEMPERATURA DE SECUENCIA

HIBRIDACION
UBC 827 54.9º C ACACACACACACACACG
UBC 862 68.6º C AGCAGCAGCAGCAGCAGC
UBC 870 70.9º C TGCTGCTGCTGCTGCTGC
UBC 877 65.0º C TGCATGCATGCATGCA
UBC 878 55.9º C GGATGGATGGATGGAT

La PCR se llevó a cabo en un volumen final de 10µL en tubos con una capacidad de 500 µL. En
la tabla 5 se detallan los componentes de la mezcla de amplificación utilizada.

TABLA 5 MEZCLA PARA LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

COMPONENTE CONCENTRACION VOLUMEN

ADN molde --- 1 µL
Buffer para PCR 10 X 1 µL
Cloruro de Magnesio 25 mM 1 µL
Mezcla de dNTP’s 2.5 mM 1 µL
Primer 10 pM 1 µL
Taq polimerasa --- .1 µL
Agua estéril --- 4.9 µL
Volumen final 10 µL

El programa que se utilizó fue: un paso inicial a 94º C durante 5 minutos, después 30 ciclos de 1
minuto a 94º C, 1 minuto a la temperatura de alineación indicada para cada primer y 1 minuto a
72º C con un periodo final de 7 minutos a 72º C.
El análisis se hizo en geles de agarosa al 1.2% que contenían bromuro de etidio (10mg/ml) para
su visualización. La agarosa se licuó en un horno de microondas para solidificarse posteriormente
en el portageles con el peine de carga. Una vez solidificado el gel se cargó cada carril con 3µL de
muestra y 3µL de buffer de carga 2X. Se sometió el gel a 120 V durante 45 minutos para
provocar la separación de los polinucleótidos de acuerdo a su peso molecular. Una vez
transcurrido el tiempo se visualizaron los geles sometiéndolos a luz en la franja ultravioleta en un
fotodocumentador.

DISCUSION DE RESULTADOS
Aún cuando las mediciones de concentración y pureza del ADN dieron resultados satisfactorios
la amplificación por medio de la PCR resultó negativa.
Por esta razón se decidió correr geles de agarosa con cada muestra sin realizar PCR previa para
comprobar su integridad. Al revelar los geles se descubrió que el ADN se encontraba
fragmentado.

CONCLUSIONES
El sistema de conservación del material genético resultó deficiente pues las muestras se
encontraban en malas condiciones al momento de realizar las pruebas. Cuando la cadena de ADN
se encuentra degradada o fragmentada en varios pedazos los primers no pueden unirse de manera
eficiente a su secuencia y la amplificación no se lleva a cabo al fallar ese crucial paso del
protocolo.
Como alternativas sugerimos la congelación inmediatamente después de la extracción o la
liofilización que consiste en eliminar el agua por desecación al vacío a bajas temperaturas.
También es conveniente aplicar pasos sucesivos de purificación del ADN para obtener una
pureza mayor aunque el rendimiento sea menor.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Perry L., et al. “Starch Fossils and the Domestication and Dispersal of Chili Peppers ( Capsicum
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Solís-López, M. “Diversidad genética de tres poblaciones de timpinchile (Capsicum annuum L.

var gabriusculum Dunal) de la Depresión Central de Chiapas”. Tesis de Licenciatura en Ing.
Agrónomo. Universidad Autónoma de Chiapas. México. 2008.