PRÁCTICA Nº 5

CINÉTICA ENZIMÁTICA

INTRODUCCIÓN
Las enzimas son protelnas que catalizan reacciones biológicas. AJ igual que otros
catalizadores, aumentan la velocidad a la que se alcanza el equilibrio pero no afectan el
equ,libno final de la reacción . Facilitan la reacción proporcionando una ruta con menor
energia libre de activación para la transformación de sustrato a producto que en la
reacc16n no catalizada.

Las enzimas son altamente especificas y su actividad puede modificarse por diferentes
factores tales como temperatura, pH , concentración de enzima, concentración de
sustrato, inhibidores, etc.

La cinética enzimática comprende el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas

por enzimas y de las condiciones que las modifican, así como los mecanismos de
reacción.

Una de las enzimas más conocidas y más ampliamente estudiadas es la sacarasa, ~

fructofuranosidasa o invertasa, que puede hidrolizar diferentes sustratos, presentando
una máxima actividad con la sacarosa.

La velocidad de la reacción de hidrólisis de la sacarosa puede medirse observando el

cambio de rotación óptica, o bien , valorando ('Í pnder reductor de los productos formados
en un tiempo definido.

OBJETIVO GENERAL

Analizar algunos factores que modifican la velocidad de la reacción catalizada por la

ínvertasa y caracterizar de esta manera a dicha enzima.

MATERIAL
Tubos de ensayo Vasos de precipitado de 100 ml
Pipetas de 1, 5 y 10 ml Cronómetro
Gradillas Baños maría a 37, 50, 75 y 92ºC
Espectrofotómetro Baño de hielo
Celdas

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 SOLUCIONES Y REACTIVOS

Sol. de glucosa 0.005 M-Fructosa 0.005 Regulador de citratos 0.2 M; pH 2.5,

M 3.5, 4.5, 5.0, 5.5, 6.5
Sacarosa 0.45 M Tartrato de sodio
Acetato de sodio O.OS M 3,5-dinitrosalicílico (DNS) al 1%
Ácido acético O.OS M Sol. de ínvertasa 1O µg/MI [mL)
Regulador de acetatos O.OS M, pH 4.7 Regulador de fosfatos 0.2 M, a pH 7.5
Ácido cítrico 0.2 M Citrato de sodio 0.2 M
Hidróxido de sodio 2 N

TICA ENZI MÁTI CA

PROC EDIM IENTO GENE RAL PARA LAS PRÁCTICAS DE CINÉ

1. PREP ARAC IÓN DE LOS TUBOS PROBLEMA

uno de los parámetros a

a) Etiquetar perfectamente los tubos como se indica en cada
determinar.

o correspondiente a
b) Preparar la serie de tubos siguiendo las indicaciones del cuadr
dor y el agua.
cada experimento; adicionar cuidadosamente el sustrato, el regula

el cuadro.
e) Preincubar los tubos 5 minutos a la temperatura indicada en

dos con cronómetro). El

d) Adicionar la enzima, agitar e incubar duran te 5 minutos (medi
¡ tiempo de incubación se inicia al momento de adiciqJlar la enzim
a.

30 segundos a un minut o
Hace r la adición de la enzima con exactitud / cc,n intervalos de
1
)
ar la solución enzimática.
entre cada tubo. Limpiar la pipeta exteriormente antes de agreg

término los 5 minut os de

e) Detener la reacción en el momento justo en que lleguen a
orden en que se adicio nó
incubación, adicionando 1 ml de 3,5-DNS siguiendo el mismo
los inmediatamente a un
la enzima. Saca r los tubos del baño de agua hirviendo y pasar
recipiente que contenga hielo.

ndo los tubos en un

f) Una vez reunida toda la serie de tubos, desarrollar color coloca
nto en que empie ce fa
baño maría a 92ºC durante 5 minutos contados a partir del mome
, sumergiéndolos en un
ebullición. Transcurrido este tiempo enfriar rápidamente los tubos
baño con hielo.

baño con hielo.

g) Diluir cada tubo con 2 mi de agua destilada y mantenerlos en

40
 h) leer todos los tubos en un espectrofotómetro a 540 nm, ajustando previamente a cero
con el tubo testigo.

2. PREPARACIÓN DEL TUBO TESTIGO

a). Etiquetar perfectamente un tubo como TESTIGO.

b). Adicionar el sustrato, el regulador y el agua, siguiendo las indicaciones del cuadro
correspondiente.

c). Preincubar e incubar el mismo tiempo y a la misma temperatura de los problemas.

d). Adicionar al tubo, sin sacar del baño, 0.5 ml de 3, 5-DNS y acto seguido, adicionar la
enzima y mezclar, evitando así la actividad enzimática.

e). Reunir el tubo testigo con los tubos problema para desarrollar color como se indica en
el paso 1f.

f). Usar este tubo para ajustar a cero el esp0.-)ctmúJfómetro, a una longitud de onda de 540
nm.

3. CÁLCULO DE LA VELOCIDAD EN UNIDADES DE INVERTASA

Interpolar en la curva tipo los valores de absorbencia obtenidos en cada experimento para
conocer la cantidad correspondiente de micromoles de azúcar reductor, y con este dato
calcular la actividad de la enzima en Unidades de lnvertasa o Unidades Internacionales
(UI), considerando que: una unidad de invertasa (UI) es la cantidad de enzima necesaria
para hidrolizar un micromol de sacarosa en un minuto.

Vo =actividad =µmoles sacarosa hidrolizados / min

La velocidad o actividad obtenida está dada en Unidades Internacionales o de lnvertasa
(UI) en este caso.

41
 PRÁCTICA N° 5.1
CURVA DE CALIBRACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES

ción gráfica de valores de

Una curva de calibración o curva tipo es la representa
un analito.
absorbencia en función de concentraciones conocidas de
calibración mediante la cual se
Este experimento tiene por objeto obtener una curva de
idas en los experimentos de
puedan transformar las lecturas de absorbencia obten
así obtener la actividad de la
cinética enzimática , en micromoles de azúcar reductor y

~ enzima invertasa en unidades Internacionales (Uf).

PROCEDIMIENTO

~
~
a) Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente
tabla:

nto general
NOTA: Antes de iniciar este experimento revise el procedimie
~
í-"l TABLA 1. CURVA TIPO DE AZÚCARES REDUCTORES
Problemas
p TUBO No.

'1 T 1 2 3 4 5
-
·1 Glucosa 0.005 M
o 0.1
(l .,
'J . ,!. 0.4 0.8 1.0
Fructosa 0.005 M (ml) 1

-1 Sacarosa 0.2 M (ml)

0.5 0.5
! z1 t;
-·- ~-·
0.5 0.5 0.5

-1
-, Regulador de acetatos 0.05
M, pH 4.7 (ml) 0.5

1.0
0.5

0.9
0.5

0.8
0.5

0.6
0.5

0.2
0.5

o
n Agua (ml)

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

3,5 DNS (ml)

~
5 minutos a 92° C (en baño maría)
Desarrollo de color

Dilución Colocar en baño con hielo y diluir con 2 ml de agua destilada

Leer en un espectrofotómetro a 540 nm

Absorbencia

Azúcar reductor
(µmoles)/ 2.0 ml

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 Método de DNS

HO
+ ~3-ndrO
HO T=92ºC saí1C11ato -
reducido
2 t=S min
CHpi +
3.5 dinitrosalicilato
(.,,..,) O-Glucosa
3-am1no-5-4lrtro
oxidado salicilato _
reducido

2"{Ol20i
0-gluconato

Figura 2. Reacción para identificar la formación de azúcares reductores

INFORME
1.- Introducción.
2.- Objetivos.
3.- Resultados en forma de tabla.
4.- Cálculos.
5.- Gráfica de absorbencia contra concentración de azúcares reductores, en µmoles/2.0
mL.
6.- Escriba la reacción química llevada a cabo, con fórmulas.
7.- Discusión.
8.- Conclusiones.
9.- Bibliografía.
10.-Preguntas extra.

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