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-~ l- Macarena Tallarico
CAPITULO IV
MANCHAS DE SANGRE
Ora. Rosa S. Graells de Kempny
Licenciada Maria L. Oneto
•~) Licenciada Maria Montalto de Mecca
De la Catedra de Toxicologia y Quimica Legai de la Facultad de Ciencias Exactas
y Naturales de la Universidad de Buenos Aires.
lntroducci6n
Busqueda de las posibles manchas de sangre
Color de las manchas de sangre
Tipos de manchas
Forma y posici6n de las manchas
Estimaci6n sobre la cantidad de sangre derramada. Procedencia de l_a misma
Recolecci6n y traslado de las muestras al laboratorio
Anàlisis de las muestras
1. Observaci6n de las muestras
2. Ensayos preliminares
lntroducci6n
Reactivos usados para los ensayos preliminares
Estudio de las interferencias
Oxidantes quimicos
Sales de cobre y niquel
Otras sustancias (de origen animai)
Peroxidasas vegetales
a) lnestabilidad términa
b) Reducida persistencia
e) Efecto del pH
Parte experimental
Reactivos y materiales
Técnicas
3. Ensayos confirmatorios
I) Métodos microsc6picos
Observaci6n de los elementos figurados de la sangre
Observaci6n de leucocitos (gl6bulos blancos)
a) Mancha sobre un soporte absorbente (tela)
Parte experimental
Reactivos y materiales
Técnica
b) Mancha sobre soporte no absorbente
Parte experimental ·
Reactivos y materiales
Técnica
Observaci6n de los eritrocitos (glòbulos rojos)
187
 ---·~
Reactivos y materiales
. . bsorbentes
Manchas sobre soportes opacos no absorbentes Técnicas
Manchas sobre superf~c~es a absorbéntes
Parte experimental
Dispositivos Ultropak Manchas sobre _superficie~ n~eterrninaciòn
Técnica Controles a reahzar en ca a
• N
11) Métod os microc ristalograficos Sistema MN ·
. stigar los aglutin ògeno s del sistem a M
Métod o de Telchman Generalidades
Reactivos y materiales Método de absorciòn-eluciòn para inve
Técnica Parte experirnental
Reactivos y materiales . . 5 absorb entes
Métod o de Takayama entes
Reactivos y materiales Técnica para manchas sobre superfrf~c~e no absorb
Técnica Técnica para manchas sobre supe ,cies
lii) Métod o cromatografico Sistema Rh
Parte experimental Generalidades h d sangre secas
Reactivos y materiales Genética as e
Técnica Aplicaciòn del sistema Rh a la tipifica ciòn de mane
IV) Métod o microe spectr osc6pi co Parte experimental
Descripci6n del ocular microespectrosc6pico de Leitz Reactivos y materiales
Parte experimental Técnicas
Reacti vos y materiales Manchas sobre superficies absorb entes
Técnica Manchas sobre superficies no absorb entes
4. lnvesti gaci6n de la especie Técnicas bioquimicas
lntrodu cci6n lntroducciòn
Generalidades Genera lidades rfismo en la tipifica ciòn de manch a
Ensayo de las precip itinas Método electroforético para la aplicac iòn del polimo
Gener alidade s de sangre
Condic iones que deben cumpli r los antisueros Parte experimental. Reactivos, materiales, técnic a
Torna de muest ra Fosfoglucomutasa (PGM)
sangre
Condìc iones que deben cumpli r los extractos de Generalidades
tinas
Métodos emple ados para el ensayo de las precipi Genética
1. Métod o del tubo Parte experimental
2. Métod o con capilar es Reactivos y materiales para la corrida
3. Métod o electro forétic o Reactivos y materiales para localiz ar las banda s
Parte experi menta l Técnica
Aeacti vos y materi ales a) Aplicaciòn de las muest ras
Técnic a b) Condiciones de corrida
5. Tipific aci6n de manch as de sangre human a Mecanismo de reacciòn
Técnic as inmun ol6gic as lnterpretaciòn de los resulta dos
lntrodu cci6n Antiguedad
Sistema ABO Frecuencia de los fenotip os mas comun es de PGM
Gener alidad es Estearasa D (EsD)
Antigenos y anticu erpos en el sistem a ABO Generalidades
as de sangre
Aplica ci6n del sistem a ABO en la tipifica ci6n de manch Genética
lnvestigaci6n de aglutininas Parte experimental
Reactivos Y materi ales p I .
Técnic a de Lattes (de la costra )
Reactivos y materi ales P:~: i8 co,~nda electro forétic a
oca •zar las banda s
Parte experi menta l Técnic a
React ivos y materi ales
Técnic a a) Aplica ci6n de las muest ras
Métod o extrac tivo a tubo b) Cond!c ìones de corrida
lnvest igaci6 n de aglutin 6geno s e) Locahzaci6n de las b
lnte_r~~etaci6n de los resul~ ~~s de EsO
Métod o de absorc i6n-inh ibici6n s
Aht1guedad
Parte exper.mental
~recue ncia de los fenoti
React ivos y materi a/es
Adernlato quinas a (AK) pos mas
comun es
Técnica
Gener alidade s
Observaciones
Genét ica
Mé1od o de absorc i6n-elu ci6n
Farte experi menta J
~ r -· ;!~
Parte experimental
\
Reactivos y materiales para la electroforesis
R~ac_tivos Y materiales para localizar las bandas
Tecnica
a) Aplicaci6n de las muestras
b) Condiciones de corrida
c) loçalizaci6n de las bandas
lnterpretaciòn de los resultados
Antiguedad
Frecuencia de los fenotipos mas comunes
Fosfatasa acida de eritrocitos (EAP)
Generalidades

lntroducci6n
Cometido un hecho delictuoso, es probable que queden en el escenario del
crimen , una cantidad variable de testigos mudos: impresiones digitales, pelos,
manchas de sangre o de secreciones, etc.

\
Genética Los mismos pueden llegar a suministrar importantes informaciones respecto
Parte experimental del numero de protagonistas intervinientes, de sus desplazamientos, de las cir-
Reactivos y materiales para la localizaci6n de las bandas cunstancias causantes de la muerte o heridas, de la relaciòn entre diversos obietos
Ractivos y materiales para la localizaci6n de las bandas y el hecho criminal y, fundamentalmente, permitir la identificaciòn del homicida.
Técnica
La sangre es una de las evidencias màs frecuentes e importantes encontradas
a) Aplicaci6n de las muestras en la investigaciòn criminal. Ha sido el sueno del quimico forense estar capacitado
b) Condiciones de corrida
c) Localizaci6n de las bandas EAP para asociar una mancha de sangre con una persona en particular.
lnterpretaci6n de los resultados En la investigaciòn de manchas de sangre, los problemas que se plantean son:
Antiguedad 1 . Busqueda de las posibles manchas de sangre.
Frecuencia de los fenotipos mas comunes 2. Recolecciòn y traslado de las muestras al laboratorio.
Breve menci6n de otros sistemas de tipificaci6n de manchas de sangre secas
Valor de la tipificaci6n de manchas de sangre seca 3. Analisis de las muestras remitidas.
Aplicaci6n del enfoque isoeléctrico a la tipificaci6n de manchas de sangre secas
Bibliografia
Busqueda de las posibles manchas de sangre
Se entiende por mancha toda modificaciòn de una superficie, ya sea por una
alteraciòn del color o por el deposito de una sustancia extrana a la m1sma. Pueden
ser de sangre , semen , saliva y de la mas variada 11aturaleza.
Hay manchas que por su aspecto pue<!_~n l!~aren~r §~ de sangre, ta)e~ çomo
las de ciertos alimentos, jugos vegetales, sales metalicas, pinturas, etc.
La busqueda debe hacerse en el escenario del delito, revisando minuciosament e
todas las superficies Y. los objetos que en él se encuentren.
Las manchas pueden hallarse en la victima, en el piso, en los intersticios, entre
las tablas, en las paredes, sobre alfombras o debajo de éstas, en cortinados,
detras de un mueble, de una puerta, en armas, herramientas, etc.
En ocasiones, las manchas se encuentran facilmente. Otras veces, es dificil
su ubicaciòn. ~o seran claramente visibles cuando se ha intentado removerlas
mediante lavado, o debido a la naturaleza y color de la superficie sobre la cual
se hallan; por ejemplo: manchas sobre paredes empapeladas o pintadas de
colores oscuros.
La iluminaciòn con difere~~~ ~ces y , a distintos angulos , puede ayudar a I~
ubicacìon.
El empleo de la luz ultravioleta es muchas veces util, porque la sangre aparece
oscura, mientras que el soporte sobre el cua\ se encuentra puede presentar un
color distinto, contraste que permite loca\izar y delinear la mancha.
Tan pronto s_e ubica una p osible mancha de sangre, debe e1ectuarse una
descrìpci6n de su color , forma, posiciòn , direcciòn de la sa\picadura, altura esti-
~ e caida,_cantigad encontrad_a, e ,.._t,.,,c,.,_._ _
J ,9,
 FIG U RA N" ,
. d h es por mediod de'
La meJor forma de conservar el aspecto e una mane a 10
_ fotografias. Se deben tornar registran do una vista generai; una, de alcance me
Y otras, de detalles.
Ademas de las fotografias, es util trazar un boceto aproximado p~ra mostrar i:\ .
.·~.t: -
el aspecto generai de las manchas y su posici6n relativa a otras areas de 13 ~-
escena del delito. ~-
't,
Color de las manchas de sangre
Una_!ll ancha de sangre seca, pero relativamente fresca, tiene generalmente un
colQr rojizo y brillo.
El brillo_deSRfilece_b~jo la acci6n de la luz solar, calor y diferentes condiciones
_atmosféricas, o si se ha tenido la intenci6nde lavarla mancha. Sobre tejidos, el
brillo es a menudo menos visible.
Gotas de sangre caidas sobre una supfrficie plana, desde una altura aproximada de
Tipos de manchas
La Si!Qgre puede presentarse impregnada en un tejido, en forma de salpicadu- 50 cm.
ras, charcos, regueros por escurrimiento, etc. Otras veces se observan manchas FIGURA N' '.'
por contacto, corno impresiones digitales, de manos !Ld._e_pies.
Es de interés citar el caso, hist6rico en la criminalistica de nuestro pais, referente
a _la resoluci6n de dos crimenes cometidos en Necochea, provincia de Buenos
Aires, por E:I ~allazgo de la huella del dedo pulgar, manchado con sangre, dejada
por la hom1c1da, en el escenario del crimen.
La comparaci6n de esta èvidencia con la impresi6n dactilar del pulgar de la
principal sospechosa, empleando la técnica de identificaci6n persona! de Juan
Vucetich, sirvi6 para esclarecer el hecho, provocando en dicha época gran con-
moci6n en nuestro pais y alcanzando resonancia mundial el método propuesto
por el investigador nombrado, orgullo de la criminalistica argentina. Aspecto de las gotas cuando la altura de ca1da està comprendida entre 50 y 100 cm .
Forma y posici6n de las manchas FIGURA N° 3
Herbert McDonell y otros investigadore s, han publicado sus observaciones y
conclusione s sobre la manera en que la forma de las manchas producidas por
goteo. permite estimar el angulo de impacto y la distancia de caida desde el
punto de origen , hasta la superficie sobre la cual se encuentran las mismas.
Se lleg6 a la conclusi6n que el_diametro d~ ur:i? _lll<!.IJ.Ch(!_de saQgre s61o tiene
valor en la estimaci6n de la distancia de caida cuando ésta es inferior a 1,5
m efros~ Mas alla de este valor, la variaci6n ene ldiametro es demasiado reducida
corno para ser confiable.
El aspecto de los bordes de la mancha s61o es valedero cuando se tienen en
Altura de caida entre 100 y 150 _c m .
cueiìta las caracteristic as -de ia-~uperficie sobre la gue ha caido la sangre. Son
vahdas las correlacione s entre manchas desconocida s y patrones, s6lo si se usan FIGURA N 4
idénticas supedicies...deJmp.acto. ·
Cuando mas burda y aspera es la superficie, mayor es la posibilidad de que
la gota se rompa y desparrame . . • '.
Oiversos autores coinciden en que cuando las gotas caen verticalmente sobre
una superficie lisa, a una distancia menor de 50 cm, su forma es circular con los
bordes lisos (Fig . N°1).
·,\;_(fa~ '. "··,
Cuando la altura esta comprendid a entre ~ 100 cm, los bordes ya se presen- ~ - '~'.\'ii :-i,
. -~,._...
.
_tao.festooe ad os_; a una altura entre 1O_Q_y_} 50 cm, los mismo~ son 'b1as aguzados ,
~~, :.'.. .
produciéndo se proyeccione s radiales a una '!1ayor altura (Frgs. N ~-3-4).
En lo que respecta a la direcci6n de la carda, la forma de la gota puede dar _ Altura de caida superior a 150 cm .
datos de interés s~ ~ icie es lisa. l93
192
- ---, . ll t \ Q l-.>\.,ltJfll,;tl t'"'UDllS-
 ~ ..!
;
.. ~ Una gota de sangre, al chocar contra una superf'1c1e
' en
ngulo recto';'da lugar
a una mancha casi circular. A med1da que eT angu o ecrece, a man~ a adqyjere demasiado pegueiia o grande en relaciòn a éstas , debe encontrarse una explica-
una forma mas ovoidal,_!anto_mas alargada cuanto menar es el angulo de impacto. .ci.6J:1. -- -
Si el angulo es muy pequei'io y se desprende una pequena gotita, la forma de la En el primer caso puede ser que la cantidad faltante de sangre se encuentre
mancha es similar a ladelsìgnode (Fig. N° 5). _e"i<clarna.cìon en otro sitio, donde se cometi6 realmente el crimen.
En el segundo caso, parte de la sangre puede provenir de algun otro individl.lO,
posiblemente el criminal.
' .,,,:., ·I"I , , FIGURA N" 5
El delincuente puede herirse cuando fuerza una puerta o ventana con herramien-
tas, con un trozo de vidrio, con un clavo sobresaliente, etc. También cuando
lucha con la victima, pudiendo salpicar a la misma con su sangre.
i La apariencia y distribuciòn de manchas de sangre en la victima y sus ropas,
'
puede ser de valor para interpretar y reconstruir detalles del crimen o de las
}
i'
' , . ' , I
, ' ' .
circunstancias causantes del derrame sanguineo, asi corno también conocer la
posici6n del cuerpo en el momento del crimen.
En un caso en que una victima femenina tue ultimada con un arma bianca que
I
le atraves6 el coraz6n, se encontr6 una gran cantidad de sangre coagulada debajo
: , .. ' y alrededor del seno derecho.Por otra parte, un considerable volumen de suero
sanguineo se habia derramado sobre el lado izquierdo y trasero del cuerpo,
impregnando la rapa de la victima. ·
I : ·1 I_ .
I
, .,
jt~!~;.-;_•: .. l
, Por consiguiente, era evidente que la mujer estaba sentada o parcialmente
reclinada cuando fue atacada por el homicida, cayendo hacia la derecha en el
. !""
• I . .. . .
-
. . '
.• momento en que el arma bianca fue retirada.
,
El cuerpo no fue movido durante un tiempo, produciéndose la coagulaciòn de
. _f. ,. • ~ ' • . la sangre derramada; luego fue colocado en posici6n horizontal, siendo inclinado
· -· I 1111
sobre el costado izquierdo durante el traslado, permitiendo que el suero fluyera
-~ - , I ''
Aspecto de las gotas de sangre ca1das sobre una superficie con un angulo de impacto hacia ese lado .
inferior a 90" Todos estos datos fueron utiles para reconstruir los antecedentes del caso. El
cuerpo habia sido hallado a orillas de un lago, pero el crimen habia tenido lugar
en la embarcaci6n del asesino.
Estudiando la apariencia de tales gotas o salpicaduras, es posible determinar
a veces, donde ocurrio el hecho, la posici6n de la parte herida del cuerpo durante
el asalto, donde se hallaba el criminal si la victima trat6 de hujr del misma, la
cantidad de gofpes dados, etc. Recolecci6n y traslado de las muestras al laboratorio
En generai, las salpicaduras de sangre se originan debido a un golpe contra
una parte del cuerpo ya sangrando, pero tamb,en pued~D__Qrod ~ rrse.....QOL el Esta tarea debe hacerse con el mayor cuidado y rapidamente, pues de lo
maneJo de un arma cublerta'de- sangre o
por ef movimient.Q__ge un~ er~ na contrario puede destruirse un indicio precioso para la investigaciòn criminal. Debe
_rumda. En estos casos muestran una o dos direcciones, diferenciandose de las destacarse que una inadecuada recolecciòn y preservaciòn de este tipo de evi-
que resultan de un golpe, en donde la sangre salpica en todas direcciones. dencia dificulta y, a veces, imposibilita el trabajo del laboratorio.
Se cita el caso de un hombre de negocios que fue hallado muerto, sentado · El mejor método para preservar manchas de sangre es enviarlas al laboratorio,
frente al escritorio de su oficina, debido a varios golpes recibidos en su cabeza p~r_a su analisis, sobre el objeto en el cual se encuentran.
con un hacba. Hay que tener en cuenta que la sangre se adhiere fuertemente a tejidos, papeles
Se encontraron manchas de sangre encima del escritorio y a los costados de
y maderas. pero mucho menos a superficies pintadas a lustradas, metales pulidos,
la victima, pero no detràs de ella. Era evidente que el homicida se ubicò detras
etc. En este ultimo caso se des!)rende facilmente en estado seco ~ uede perderse
de la victima para golpearla, de manera que las gotas de sangre esparcidas hacia
gl .!I!fil!QLfQD!c!_cto,:._Si hay riesgo al respecto. se puede humedecer un trozo de
atras, cayeron sobre sus ropas. También se pudo concluir que el asesino debia
papel trasparente delgado y colocarlo sobre la mancha antes de mover el objeto.
ser una persona conocida del hombre de negocios, para poder ubicarse detras
Si I~ manchas estan seca~. s_obre o~tetos gue rio pueden ser tras~ dados, la
de él, sin despertar sospechas. Esta teoria tue correcta, ya que el culpable result6
fo;ma ae preservarlas varia de acuerdo con las circunstancias.
ser una persona anteriormente empleada en el negocio.
Primeramente se numerara cada una de las manchas, después de haber tornado
Estimaciòn sobre la cantidad de sangre derramada y procedencia de la misma nota de su posiciòn y forma.
La sangre sera raspada con una hoja de afeitar, escalpelo o bisturi , sobre un
Debe tenerse en cuenta si la cantidad de sangre hallada en el escenario del
tr_ozo depapel bianco limpio. El papel se pliega en forma tal- de minim1zar la
5rj_men guarda relaci6n con las heri das rec161das por la v1ct1ma. ~, la cant,dad es
194 195
---- -..rr.. ~ ~v .... '• os; ~ 2V
~
"- ~
 En ningun caso se agrega . .dràn agente s preseN aào r es so'<:>
Todas las rnuestr as rem1t1 as al laborat orio deben \\e\lar " '' ,.._... "'
pérdida de sangre. d marca luego y se co Ioca en un sobre t as con los siguien tes d at o s:
El papel piega o se en su.,,...._~,..,...
adecuad amente num_erado. . i \mente absorbente, y la manch_a no - Conten ido
En otros casos, s, el materiai es pare ·-
a e
e,uede_!:2S[l_?.rs~ . se debe recoger aphcand O la m,sma un trozo de genero - Nornbre d e la victirna
o s~a rdestilad a o' soluçj6n jisiològica; Fecha del hecho
de algod6n ligeramente ~mede cido conh ag d .do comprim
también puede utilizarse papel de filtro urne ec, , _ iémto.LQ sobre la Califica ciòn del hecho
zona manchad<i. - Cornisa ria actuan te
. Una vez recogida la muestra se la caloca, mediant . · n un tubo de - Juzgad o y sec ret aria q u e corresp onde actuar .
e una p1~za, e ara Adernas d la san re ree id · I d elit o
ensayos limpio y seco, convenientemente rotulado, y se de1a corno rutina se
destapa do P ,emiteà ni,,anc as de san , e de las victìma s
que la mancha se seque al aire . d e 10s so s echoso s si los hubiei
a
La sangre aùn no . Es motivo de sospec ha que las ropas de un p resunt o
coagula da se sacara con una pipeta (alrede~ ?r ~~ 2 _m_1 d elincue nte hayan sido
sera transferida a un tubo que conteng a ,guai cantidad de lavadas inmedia tament e despué s de comete rse un hecho
soluc1on hs1olo91 Qb sangrie nto. P or lo tanto
JI. \ se tapa el tubo-y s e invìe rte suavem ente doso tres
1 deben remitirs e al laborat orio , donde se efectua ra una_pr
veces para mezclar la sa~gre olija observ aciòn de las
con la soluci6n salìna; se col oca el tubo ~n un recipiente ~on misrn as , ya gue Ru ed en quedar restos de sangre en los
h~ lo y S!:l JlQ_Vta al bolsillo s , farro , int e rior
laboratorio.
Otro metodo muy rec omendable de recolecc i6n es el de colocar de mangas y costura s. - - -
un trozo de
materiai absorbente sobre la sangre aùn liquida. Se han usado
materiales corno
papel de filtro, hisopos o tro~os de ~lgodòn . . . .
En la aclualidad se recom,e . Analisi s de las muest ras
nda ut,hzar un genero hmp10,
A\ que se caloca en la sangre liquida, deié.ndolo que se sature,bianco, de algodon ,
sostenié ndolo co_n La investig aciòn comp ~eta de manch as de
U pinzas. Se retira el género de la sangre y se caloca en un tubo de ensayos o ca1a
sangre , en lo que respec ta a la tarea
de Petri, sin tapar, para permitir que el género se seque. Se rotularé. ~;:~1: :r en el laborat orio , puede consid erarse es<::alo
n convenien- nada en cinco etapas su-
temente uno u otra.
Debe tenerse en cuenta, cuando se recolec tan varias muestra 1 ° - Observ aciòn de las muestr as
s de sangre , que
pueden estar present es mancha s de diferent es origenes, por 2° - _!:.nsayos prelimin ares
lo que sòlo podré.n
mezclarse las partes de una
En el caso de prendas de
misma
vestir
salpicad
mancha das
al laborato rio, si las mancha s estan todav, a hùmeda s, deben
ura.
u otros teiidos que pueden enviarse
secarse comple ta-
4:-
30 - Ensayo s cq_nti]:matorios
lnvestig ~~iòn de la especie
5 - T1p1f1cac1on de la manch a de- - __
sangre h u !Il aria..
mente antes de su envio . Se tratara asi, de evitar el proceso
de putrefac cìon que
entorpe ce o imposib ilita el analisis qui mico posterio r.
El secado se hara por corrient e de aire fr io y no por acciòn del
calar , extendi én- 1 . Observ aci6n de \as muest ras
dose las prendas sobre bastido res. En ning(m caso se doblara
n géneros moiado s;
se evitara asi._gue la sangre se transfie ra a zonas no mancha
das. El materiai recibido sera cuidad osame nte retirado de su
- -Las pren das seca-s deben embala rse por separad o e{ bolsa;> envolto rio Y esparc ido
d~ sobre una amplia superfic ie, utilizan do guante s de latex.
Siempre se evitara el envio de obietos mancha dos en· envases
estanco s, por Si se observa la presen cia de insecto s se caloca la
ejemplo , en bolsas plastica s bien cerrada s. muestr a en una bolsa
plastic a, se adicion an unas gotas de formiat o de etilo y se
En el caso de mancha s sobre superfic ies absorbe ntes, que cierra hermé ticame nte.
por su tamaiio no Luego d e una hora, tiempo que se consid
s.ea factible traslada rlas (!I laborato rio, corno por eiemplo : colchon era suficie nte para exterm inar los
es , cortinad os, insect os , el m ateriai se retira de la bolsa y se somete
etc., existen dos alternat ivas para su recolec ci òn. al exame n.
Una de ellas es seguir el proce&miento Se ob servan det enidam ente , se describ en y dibui an los
ya descrip to, usando el género de obietos recibid os; p or
algodòn humede cido . La otra es , simplem ente, c qrtar la por_çiQ11 eiemplo : una camisa . un cuchillo , etc .• i ndican do las manch
....q ue conteng a as que contien en con
la mancha el mayor detalle p osib le. - - --
de sangre, colocar la en un sobre de papel y rotularlo conven ienteme nte. ----
~ uando haya nec esidad de descos Durante el examen de una prenda se tomara nota del
er o cortar , se deberan evitar los cortes a dano causad o por pro-
través de marcas dejadas por el yectiles , cortes con arma bianca , etc . Se seflalar a la
paso de proyect iles,_çu chillos u otras armas~ posiciò n respec t1va del
Es importa nte destaca r que siemp re debe remitirs e una muestra mismo en el esq1..1em a corresp ondien te.
contrai, apli- Todos los elemen tos extraiio s se separa
cando el mismo procedi miento de recolec ciòn , emplea do para n cuidad osame nte. Puede n ser fibras ,
e la mancha , sobre
una zona del materia i no mancha do . pelos , fragme ntos de vidrio , astillas de madera , particu las vegeta les , etc .
e Una muestra que también debe recolec tarse es el agua
La extracc iòn de este materiai se realiza c on pinzas o una
de lavado en piletas, m icroasp iradora y
e sifòn de descarg a. vertede ros, caiieria s, etc., debido a que se caloca en bolsitas , pequei ios tubos o caias d e Petri, debida
es muy probab le gue mente et,queta d os.
el homicid a lave sus manos mancha das con sangre. en p.9ra su posteri or examen .
ti que se le presente. la primer oportunkl ad
·- - Si la manch a es obvia sobre un articulo claro , no es
ir necesario remarc arla
196 ~olam ente se circu nscrib ira el Jirea elegida para e\ futu
ro_analisi s .
q,
19·
2
 P-
Si la manchél no es tan_ evid~ ~ ~ r car a el contorno~ la misrna: aprove-
chando el contraste producido por la luz ultravioleta.
La marcacién puede hacerse con t iras de papel aOnesìvo de color, tapiz o tiza
de sastre. ...
Finalmente se_12rqf_e_ge ~numerar las manc~s.
2. Ensayos preliminares
lntroduccién
Tienen va!or corno ensayos de orientaci6n,_pero no aseguran la presencia de
sangre en la mancha en estudio.
. Se realizan solarn~nt~ uando hay_ suficiente cantidad de muestra para no
d 1f1cu ltar_. por fall a de la m 1sma 1 las reacciones posteriores de cer:tifuacién de la
ex1sten_q a d e sangre, d e investig_ac[Qn d e_kl especie y de su_tipifica_ggn_ _
Los_~Si=I...Y..P1LQ!:ehm1nares son oruebas__ràpidas basadas_en I~ actividad deì
pe x1d~sa ue osee.el rupo He'5.lde la hemoglobina de la sang_re y qué;-én
p resenc1a d e agu<Lill(1gena a-y-tre ciertos reactivos organicos, dan lugar a la
apaij_çién de ~oloraciones o_luminiscencia que orientan sobre la posible existencia
de s,ogre en Jas m uestras analizadas (Fig. N° 6).
L a p~ ~ é !descompone el qguà_Qxigenada, produçj_énQ.Ose .sl.9llièl y oxigeno.
@ Es este oxig eno el que actua sobre el reactivo organico reducido, trasformandolo
en su forma oxidad a, d e color caracteristico o lum in iscente.
Qadajg gransensibi lidad_d e los ensayos preliminares, ademas de ser utilizados
en el laboratorio, ~e~_rriplean también en el escenario del delito, corno un medio
P.ara resguardar aquellas manchas sospechosas de contener sangre.
Si el resultado de los ensayos preliminares es negativo, la mancha no contiene
~ngre en cantidades detectables corno para permitir su PQ.~ terior analisis. Si el
resultado es positi'!_o, se reg uiere continuar con los ensayos para confjrmar su
presencia.
Todos los ensayos preliminares que se detallaran, sufren en mayor o menar
grado, I? interferencia de las peroxidasas d ~ creciones biqlégicas y peroxidasas
~ etales. También interfieren agentes fuertemenie oxidan.tes,...aJguno.s...rnetales
y sales metalicas.
FIGURA N° 6
[ una cantidad reiativamente apreciable de sangrn y dan reaç cipne~ bast ant~ int en-
H 20 2 [ react1vo
pc,o,idasa[sa:gna[ /--> . o,idado
➔ coloro luminiscencia
H 20 + O reactivo
reducido
Ensayos pre/iminares
198
Reactivos usados para los ensayos preliminares
. (1 861) que consiste en
El i::irimero en emplearse tue et react1vo _de Va..!J_ _0 een . . de sangre Y agua
resinade... guaya_ço...d_isuelta en _alcohol etilico. En p resencia
oxigenada, desarrolla co~ r i8zul. b scaron ot ras sustancias
Su empleo no sat,sffzo P enamente, por lo que se u v aler histérico.
En la actualidad , practicamente, no se usa Y solo _t_,ene venta·as principal-
En 1 9 04 et empteo del reactivo de Adler ofrec10 grand es 1
· . -'d o ace·ticoc:i-\ ,._,__ ç-._.00 I. \
. .. e •t
mente por su gran sens1b 1hdad. ons,s e en en':' .
b ·dina d1sue1ta en ac, ""
I zul verdoso en
glacial o en mezcla~-9.!Lalcotiot _etilic o y àcid o_acet1co. Da cQ.._or a ·
, •esencia de sangre y agua 0><1g enada. . . .
La sens1b1hdad de la reacci6n de Adler ha hecho d e la benc1dma_el reactivo
predilecto de gran numero de expertos; sin emba_ r go, _en l a act ualldad, no se
recomienda su uso debido a sus p ropied ades carcmogerncas . .
Otro reactivo utilizado es el de Medein~er: leuc obase del Verd e de m alaquit a
disuelta en solucién de acido acético; se oq_serva color verde en presenc1a d e
sangre y agua oxigenad a. . . .
- Mayor confiabilidad en tos resultados ofrecen los react1vos qu~ ac tuao eo medio
~ alcalino, pues disminuye la posib ilidad de falsos p ositivos._ . ... C:: z, o H1t-t O Lf
Entre estos reac tìvo s se encuentra e\ gue em plea tenolttal~ educ1d a en
-..i
m edio alcalino (reac tivo d e Kastle Meyer) y et que utiliza 3 - aminottalhid razida
(luminol).
. .
La alta sensib ilid ad en m edio liq uid_o ~ I<! reacciòn con fenolftaleina reduc1da_
(1 en 1.000.000), se p one de manifiesto en la localizaciòn d e sang~ ~ oluciones
. muy diluidas. c orno son tas muestras recogidas en l avapos,_c ~ en as, etc.
Al agregar gotas del reactivo y de agua oxig ena d a , se desarrolla, en presencia
de vestigios de sangre, una coloraciòn rosada intensa.
La reacciòn con luminal es sumament e ·sen sible (1 en 5.000.000). Esta prueba
d e orientaciòn, result a ideai para ap licar a gran d es superficies , corno pisos o
esc aleras qu~ hayan sido lavados co.!l_Jll ob ~ t ç> d e remover l a sangr_e .
El inconvenieote de~st e..método es que la reacciòn posit iv a se manifiest a por
la apariciòn de' tu miniscenci~poLJo_gye ~e d ebe ob seryar en la osc.urida d . -
Algunos autores han expresado que las manch as viejas de sang re reaccio nan
mejor que las recientes , con lumino\ y agua oxig enada, y que l a sensib ilidad de
la reacc iòn con sangre fresca se mejoraba si se roci a p rim ero c o n acido clorhid rico
al 2% la superficie a ensay ar. Posteriores exp eriencias han d emostrado q u e este
tratamiento previo es innecesario.
Las superficies porosas y las que no fueron limpiadas inmediat ament e, reti enen
sas con el lumino!.
Lamentablemente el lumino! no p o s ee especific idad abso luta p ar a sangre, pue s
... reacciona aunque d ébilment~ on p~ roxidasas de origen vegetai y algunos me-
tal es, tale:LCQITIO cobre y aleaci ones de cobre. No se e ncontraron interferenci a s
de flu id o s humanos, corno por e jempl o : saliva, semen, sudar y orina .
La aplic_a ciòn p ractica de la reacciòn con lum ino\ puede ve rse en l a figura N ° 7 .
En la m1sma se observa la acciòn de este reacti\/o sob r e la cubi erta de la rueda
derech~ ~e. un vehiculo. Se sospechaba que el auto mòvil h ab\a sido uti\iza do en
un hom1c1d10 en el cual la victima fue herida por un d i sparo de arm a de fu ego y
luego atropellada. La intensa reacciò n con lumin o \ e n la c u b ierta coinc i diò con
,99
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FIG UR A N ° Sb
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ar co n lum ino / y
/ue go de pu lve riz
La misma ma nc ha
do en la Fig. 8b tue
do circular ob se rva
lusi6n que el traza
Sé lleg6 a la conc para la limpieza. ngre,
bre la del balde utilizado ma nc ha do s co n sa
abarro, ubicado so dejado por el fondo manos, pies descalzos y calzados 08
el interior de l guard Las impresiones de • 9, 10 y
11).
ng re hu ma na en reactivo (Figs. N
el ha lla zg o de sa a clara r también con este
tra el efecto de un se han podido revela
mi sm a. Ba y 8b), se mues y Juego
uie nte s (Fig. No s. habia derramado , FIGURA N° 9
En las fig ur as sig un a casa do nd e se
ino l en el pis o de
re ac ci6 n co n lum gr an de de sangre.
da d re lat iva me nte
lim pia do , un a ca nti A N°8a FIG UR
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FIGURA N° 10
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Sales...de. cobre...y___niquel:.Jnterfieren solamente en soluci6n concentrada, pero

reaccionan de forma diferente a la sangre.
Una coloraciòn débil aparece antes del agregado de agua oxigenada y se
intensifica lentamente después del mismo.
La reacci6n es todavia incompleta a los 15-20 minutos.
~ sustancjas (de origen animai}: Son aquellas que por contener
trazas
de sangre dan reacci6n positiva, Por ejemplo: pus, secreci6n nasal, etc. La obser-
vaci6n microscopica de estas sustancias permite su reconocimiento. ·
.
·. ~.,· i'- P_eroxidasas ~Jl'!les: Son las de !)'layor incidencia en la producciòn de
fal sos positivos.
~ t" • El color de la mancha debe observarse antes de los ensayos. Generalmente
l su color difiere del de las manchas de sangre, ya que el verde y el bianco son
l. los colores asociados con el materiai proveniente de plantas.
Por otra parte, el comportamiento de las peroxjdasas yegetales difiere del
observado de las p[0veoientes de animales por su:
a) lnestabilidad térmica: Todas se vuelven jnactjyas cuando se calientan a
,·;. '\_ 100° e A esta temperatura las peroxjdas as de la sangre son estables. Un
·' il ~ ort.9_~e!\odo de calentam~_!'ltq_(5 minutos) a 100° C, servirà. para diferenciar
_en_!r e ellas,
b) Su reducida persistencia: Las peroxidasas que se encuentran en manchas
de sangre, daran fuertes reacciones durante meses. En cambio, las de
Comparac ion de la marca dejada por un pie desnudo, reve/ada con lumino/
sion del pie izquierdo de un sospechoso.
y la impre- 6) Qrigen vegetai practicamente no reaccionan después de unos pocos dias.
c) Efecto del pH: Las peroxidasas vegetales reaccionan bien con sustratos
acidos y noreaccjo_n an o lo hacen débilmente en un medio fuertemente
FIGURA N° 11 __atcalino . Por esta raz6n, los reactivos en medio alcalino , corno Kastle-Meyer
y luminal son mas e2 pecifìcos quel.9~ue utiliz~ n m~di9 acido. .
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Si cuando emplean estos dos reactivos , las reacciones netamente
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.:,•••,--:,1. tJ 1 positivas aparecen rapidamente , el profesional con experiencia, guiandose
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ademas por el aspecto, color y forma de la mancha puede llegar a obtener
, ~,pf" { ,;:_.___, ) l',tj".'li ..,_ .., ,.,,. .,J..~~J~•-~
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r1J.,...,1.·, •:':-1':t~· ...v.~~.~?~.:: ,~~y~::t;, , :· 7'iit'~l ~h~:i;,,r;,; ~~tj).·... 'J!t h,,\. ,i,... '.: ;.
conclusiones bastante precisas.
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Parte experimental
Reactivos y materia/es
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-..,,. '..; J :~t.!•,l!' 1"'·.••~;t.~;.,~ Reàctivo de Van Deen: tintura de resina de guayaco. Se disuelven 0,05 g de
.... ..
1~,, • ·. ,..; :,· ---~:....---:--..
~
• 4M-
resina de guayaco en 1O ml de alcohol de 80°. Debe prepararse en el momento
·•-,i,--'..l ..... C."'"".:~ · -~: ~ -:.. " 'P'·- · ·>t ·~ .».-; '~v~~,,,.
-,~> . "•·_,. ·. :- . l"".".'cfl• .:....
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·t /~"'~;""'l•:,":•~_,-1,"·•. ~, •,1 , · ':' :-~ ,:~
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~ ~;
:-:-·~---f:.·~.,; :' :- f-i:;Jt .~.,, ·-••---•s·~-g ..,., ,.-_..·
•··:..t de su uso.
Reactivo de Adler: soluciòn acética de bencidina . Se disuelven 0,01-0,05 g de
1-,-~....A
-.;,,~ .· . 'if-!1.~-
;:?ti_ --,_ \ ·--•"•-,". --.. ,~.,.-
•· · ~-, . . >--:.ri;; J-- .-.._.,..r . .,.., ....,.. ~--~- bencidina en 1O ml de acido acético glacial. No se recomienda su empleo por
;.
..,~ ..... .-. . . ..
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~ if~~-~~;f~~~\;:;11it?;.~-:;;l:~~-f~;;tf1~~;~
-:~ ;{ r •__: __·~~ _:,,...• .... .... _. , x; :\ . · ,.. •.., c.~· ,. r_,.
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r,;.. lm
;:
su_s pr:9.pi~dades__car~inogénic~s. _ - - - -- -
Reactivo de Medeinger: soluciòn acética de la leucobas e del verde de malaquita
(tetrametildiaminotrifenilmetano). Se disuelven 0,05 g de la leucobase del verde
de malaquita en 2,5 ml de acido acético y luego se agregan 7 ,5 ml de agua
Estudio de las interferencias i! destilada . Debe prepararse en el momento de uso.
Reactivo de Kastle-Meyer: fenolftaleina reducida con cinc en medio alcalino.
las reacciones prelim inares que se han visto puede_n dar fals9_s positivos ; es
En un matraz se disuelven 20 g de hidròxido de pota:5io en 100 ml de agua
decir, resultados positivos producidos por sustancias diferentes de la sangre,
- -
·i destilada . Se agregan 2 g de fenolftaleina y unos 10-30 de polvo de cinc.
corno las gi,ie a continuac i6n se detallan : ~
~ ~iaante s quimicos: Se pone de manifiesto esta interferencia, pues sin el .
-~
'
Se caloca un refrigerante a r~flujo y se caliente a ebulliciòn hasta decolorac iòn
de la mezcla. Una vez tria la misma, se decanta y se incorpora n 20 ml de
J agregado de agua oxigenada ya se observa cambio de color. -~ ,
t' alcohol etilico absoluto.
202 203
'
 ,,,,
Es conveniente guardar el reactivo con granallas de cinc para mantener el
ambiente reductor.
- Reactivo iuminol: luminol (3-amino-ftalhidrazida) disuelto en medio alcalino. En
el momento de uso se disuelven en 1O ml de agua destilada, 0,5 g de carbonato
de sodio y 0,01 g de luminol.
- Etanol.
- Agua oxigenada de 20 volumenes.
- Pulverizador de vidrio o plastico.
t.
Técnicas
Difieren segun el tipo de muestra analizada.
1. Telas bfancas con supuestas manchas de sangre.
Se corta una minima porci6n de cada mancha (previamente numerada), y se
macera con unas gotas de soluci6n fisiologica en un pequeno tubo de ensayo
rotulado. Se ayuda a la disoluci6n de la mancha con una varilla de vidrio.
Se hacen toques con la soluci6n obtenida, sobre papel de filtro. En cada uno
de ellos se agrega primero una gota de los reactivos que se desean ensayar. Se
espera unos segundos, por si hubiera oxidantes presentes, y si no hay reacci6n ,
se agrega una gota de agua oxigenada. La aparici6n del color caracteristico de
fos reactivos ensayados, indica la posible presencia de sangre.
En el caso de la reacci6n de Kastle Meyer, se recomienda agregar una gota
de etanol antes de la gota de reactivo, con el objeto de aumentar la sensibilidad
de la reacci6n.
Si el materiai manchado es muy extenso y las manchas poco nitidas, corno
por ejemplo una sabana sometida a lavado, se pueden efectuar los ensayos
directamente sobre porciones de las mismas.
2. Telas de color con supuestas manchas de sangre.
Se pueden efectuar los ensayos de varias maneras:
a) Como en el caso de telas blancas, se macera una pequena porci6n de la
muestra con soluci6n fisiologica. Se hacen toques sobre papel de filtro y
se procede a efectuar los ensayos sobre los _mismos. ·
b) Se raspa la mancha suavemente con el vértice de un cuadrado de papel
de filtro doblado en cuatro. Se despliega el papel y en el centro del mismo,
donde qued6 parte del materiai de la mancha, se agrega una gota de etano!.
A continuaci6n se incorpora una gota del reactivo de Kastle Meyer. Luego
de unos segundos, si no hay desarrollo de color, se anade una gota de
agua oxigenada. Una coloraci6n inmediata rosada intensa, indica resultado
de color. Este es el método mas sensible pudiendo cte\ec\ a r s
sangre muy diluidas. "'"'"""""- .....
La misma técnica puede repetirse con los otros reactivos , reg\s\tan ùc \e s
resultados obtenidos.
3. Aguas de lavado, vertederos, canerias, etc. _
Si se sospecha que el agua puede-estar contaminada con muy pequena can-
tidad de sangre, se colocan 5-1 O ml de la misma en un tubo de ensayo Y se
agrega una gota del reactivo de Kastle Meyer; se esp~~a unos segundos Y se
adiciona una gota de agua oxigenada. Al agitar la solu':1~n suavemente, la apa-
rici6n inmediata de color rosado indicara resultado pos1t1vo.
4. Objetos varios (maderas, baldosas, hojas de cuchillos, etc.), con supuestas
manchas de sangre.
Se raspan con cuidado pequenos fragmentos de cada una de las manchas,
sobre vidrios de reloj rotulados.
Se agregan sobre los trocitos reunidos en la concavidad del vidrio, 2-3 gotas
de soluci6n fisiologica y con una varilla se ayuda a la disoluci6n de los fragmentos.
Con la soluci6n obtenida se hacen toques sobre papel de filtro. Se agrega
sobre los mismos una gota de los reactivos elegidos; se espera unos segundos
y si no hay aparici6n de color, se agrega en cada caso una gota de agua oxigenada.
!
5. Superficies amplias corno pisos, escaleras, etc.
'~I_,I
I Se pulveriza la superficie a investigar con la soluciòn de luminal y carbonato
~- de sodio.
Se espera unos instantes y se rocia con agua oxigenada. La apariciòn de
luminiscencia azul, nos or_i~ntara sobre la posibilidad de la existencia de sangre
en la muestra. Esta reacc1on debe efectuarse en la oscuridad.
Si los ensayos ~relim!~ares resultan positivos, la mancha en estudio puede ser
de sangre. A contmuac1on se procede a realizar los ensayos de confirmaciòn.
Ensayos confirmatorios
Son ensayos especificos qu~ la existencia de sangre en la mancha
investigada.
l
!"

Se dividen en:
I Métodos microscòpicos
Il Métodos microscristalograficos
lii Métodos cromatograficos
positivo.
c) Se humedece un trozo de papel de filtro con soluci6n fisiologica y se aprirne l.f
·).
IV Métodos microespectroscòpicos
fuertemente sobre la mancha. Se hacen luego los ensàyos preliminares
~
sobre el papel. ~- I Métodos microsc6picos
Esta variante se hara en una pequena zona de la mancha y siempre que la '•\ ,
muestra sea extensa. 1
d) Si todos los ensayos anteriores dieron resultado negativo, se corta una
-~ Observaci6n de los elementos figurados de la sangre
'. La observaciòn de glòbulos rojos (eritrocitos) y glòbulos blancos (leucocitos)
pequena hebra de hilo de la mancha y se coloca en el centro de un papel en sangre fresca no ofrece problemas, pero pueden presentarse en manchas de
de filtro. Se aplica el reactivo de Kastle Meyer sobre la hebra: se espera
sangre seca.
unos segundos y se agrega una gota de agua oxigenada. Observar el cambio ?Oc,
204
'-..
.
Este ~étod o no es de aplica ci6n corrien te en
I
os labor~tonos forenses, pese Técnica
a que ex1sten pubiic acione s sobre el tema aun de Mayer. A
Esta obser vaci6n puede verse afecta da ' or ~ue
no re~1entes. S~ dep?sita sobre un portaobjetos una capa de albumina
polvo obtenido se deJa
ra!eza del sustra to sobre el cual se encu~ nt d1reren
tes c1rcunstancias: la natu- contmua?16n se raspa una parte de la mancha y el
m1_sma, el dario origina do por el manip uleo ra
t
mancha, 1.~ antigiiedad de la caer en torma de lluvia fina sobre la capa de albumi
na. Se fija el preparado
3 minutos. Se lava con
destru cci6n de los eleme ntos figurad os. Y a putrefacc1on que causara la con soluci6n de metanol-formol 9:1 por espacio de
diluido adecuadamente.
. agua destilada y se colorea con el colorante Giemsa ,
. ~ uafillo la sanare se d~p.Q_s ita sobre un ob·eto Se lava el preparado, se seca y se observa al micros
copio.
?11una tipa_caQ._a y se deseca
rapida mente , es cuand o mejor seco nservanT
los roi~. - -- °
• an _os globulos _blancos corno
--- -
En ocasiones pueden verse muy bien los elementos figurad
caracteristicas .
os en sus formas
que consiste en exten-
Puede también intentarsela técnica de De Dominicis,
n de colodiòn en alcohol-
Obser vacl6n de leuco cltos (gl6bu los blanco s) der sobre la mancha y mediante un pincel, una soluci6
La técnic a a emple ar depen dera de si la h éter.
a que, al desprenderla,
e enchu~ntra s~~re un materiai Una vez evaporado el solvente se forma una pelicul
absorb ente: una tela, o un soport e no ab::o:bnecntae~ ,, tos figurados. Se tii'le
. una OJa metahca. puede arrastrar consigo una cantida d variable de elemen
xilina-eosina y luego se
a) Manch a sobre un sopor te absorb ente (tela). la pelicula con el colorante de Giemsa o con hemato
Parte experi menta l observa al mircroscopio .
Reactivos y materia/es Observacion de los eritrocitos (gl6bulos rojos)
- Alcoho l absolu to ' Manchas sobre soportes opacos no absorbentes:
- Colora nte Giems a, diluido 1 en 1o Las manchas de sangre sobre hojas metalicas (armas
blancas u otros objetos
al microscopio por el
- Aguja s de disecc i6n no absorbentes) , pueden ser examinadas directamente
método denominado epimicroscopfa.
-
-
Portao bjetos y cubreo bjetos
Micros copio I
~
-~
La epimicroscopia realiza las observaciones iluminando
tras que la microscopia convencional utiliza luz por
con luz incidente, mien-
transparencia.
permit ido localizar los glò-
Técnica Examenes realizados sobre hojas de cuchillos, han
l
cimiento de la especie por
sobre un portaobjetos ; se bulos rojos y, en algunos casos, efectuar el recono
Se coloca un peque no trozo de la tela manch ada
y se deja en reposo durante sus caracteristicas morfol6gicas.
agrega n unas gotas de alcoho l etilico absolu to Los mejores resultados con el presente métod o se
han lograd o cuando la capa
20 minuto s. muy delgada.
a la trama del género ; de sangre que se asienta sobre la hoja metalica es
Este proce dimien to asegu ra la adhesi6n de la sangre
de lo contra rio, se disolv eria en las operac iones
sucesivas.
diluida 1 en 1O, por espacio
:! Al secarse rapidamente la mancha, es probable que
ciones y entonces los gl6bulos rojos se distinguiran
la sangre no sufra altera-
bien. .
A contin uaci6n se colore a con soluci6 n Giemsa,
se deja secar al aire.
i
; <); La presencia de los mismos es suficiente para caract
erizar la mancha.
de 30 minuto s; se enjuag a con agua destila da y 1l Cuando la capa de sangre es gruesa, la observaciòn
es màs dificil y, en oca-
copio y se observa la
Se caloca el portao bjetos en la platina del micros siones , imposible, pues los eritroc idos decantan por
su mavor peso espec ifico:
larmen te de los polimo rfonu- -~
presen cia o no, de los gl6bul os blanco s, particu formandose por encima de los mismo s una castra
de albumina. Por otra parte,
cleado s.
Si la tela es suficie nteme nte trasluc ida, puede n verse
los mismo s sin desin-
l si la mancha es gruesa , el secado es mas lento
y se increm enta el riesgo de
putrefacciòn de la sangre .
tegrar el tejido.
requerir luego del tenido , el
Si se trata de una tela oscura o gruesa, puede Parte experimental
, mediante el empleo de
deshil achad o de dicho materi ai sobre el portao bjetos Dispositivo Ultropak (Fig. N° 12):
agujas adecu adas. revolver portaobjetivos.
Se adapta al micros copio de investigaci6n en lugar del
, iluminando con luz inci-
b) Manch a sobre un sopor te no absorb ente Permite observar los objeto s coloca dos en la platina
variable y se ilumina mediante
dente, por reflexiòn. Posee objetivos de aumen to
Part~ Exper imenta l
una fuente luminosa independiente.
Reactivos y materia/es
ina de huevo y glicerina. Técnica
- Album ina de Mayer: Partes iguale s de album a ser _examinado. Se elige
- Colod i6n disuel to en alcoho l-éter en partes iguales
. . Se coloca sobre la platina del micros copio el objeto
del ocular del micros copio.
- Metanol-formol 9:1. el aumen to adecu ado del objetiv o del Ultrop ak y
e observar la march a de los
- Colorante Giems a diluido 1 en 1O. El esque ma mostra do en la figura N° 12 permit
- Portao bjetos y cubreo bjetos . rayos en el dispos itivo Ultrop ak.
207
- Micros copio.
206
 '"'lii!
f? ~ --
j
li Métodos microcristalograticos
De no estar destruidos por lavado, putrefacci6n o contaminaci6n, se podran
ver los gl6bulos rojos corno pequefios circulos aislados o agrupados. Consisten en la preparaci6n y observaciòn microscòpica de cr\s\ales ob\ .
por acci6n de ciertos reactivos sobre la hemoglobina de la sangre. Se con!i~~~"'
FIGURA N° 12 métodos especificos para el reconocimiento de la misma. an
Los dos métodos màs utilizados son el de Teichmann y el de Takayama.
Método de Telchmann
I
Propuesto porTeichmann en el ano 1853, ha sido empleado desde entonces.
Consiste en la cristalizaci6n caracteristica del clorhidrato de hematina (hemina).
bajo la forma de cristales_Lomboedric.o_s_de_..c._~1§._ut1hz_af1@ acido acetico
•
glacial con vestigios de cloruro de sodio (Fig. N° 13).
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o-·• FIGURA N° 13
uo 6.5
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ULTROPAK Troyec torio de los royos en el ULTROPAK
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J La prueba de Teichmann da..b..uj;m_
Qs_c.e.s.ultanas aim con mao.chas...an1igs Y
i c9n .muy_pequefia cantidad de sang~ .
l .1
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Parte Experimental
Reactivos y materia/es
- Reactivo de Teichmann: Acido acético glacial con 0,1 % de cloruro de sodio.
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Micropìpetas
, - Bano de Maria
- Microscopio
Técnica
Se prepara un extracto de la mancha. Sì se encuentra impregnando un tejido,
se macera un trocito del materiai manchado, en la menar cantidad de ag ua posìble.
Si el soporte no es absorbente, el extracto se prepara por disoluciòn en agua
de unas escamitas de la mancha.
Para evitar interferencias, es recomendable siempre preparar un bianco, apli-
cando el mismo procedimiento sobre una zona no manchada del objeto.
Se calienta luego un portaobjetos durante un minuto sobre la tapa de un bano
Detalles del dispositivo Ultropak de agua a 60° C.
208 209
,: r L
I
 I&;
,.,
Con una micropipet a se coloca una gota del extracto en el centro del portaob-
' - \
jetos, y se evapora hasta sequedad . Si es necesario, se evaporan mas gotas
hasta obtener una mancha visible de color pardo. Técnica
Se colòca ~bre la mancha ~n cubreobj~tos, interponiendo entre el portaobjetos
Se coloca en el centro de un portaobjetos una gota de extracto de mancha
y el cubr!,!ObJetos, un pequeno rectangul1to de papel de filtro, con el objeto de
preparado corno se indicò en la técnica de obtencién de los cristales de Teich-
dejar una hendija suficiente para el paso de una gota del reactivo de Teichmann,. mann. Se evapora con calentamiento suave, sobre la tapa de un bano de Maria;
Una vez agregado el reactivo, se apoya el portaobjetos sobre la placa del bano se agrega sobre el depésito obtenido una gota del reactivo de Takayama. Se
de agua y se deja hasta la evaporaci6n total del acido acético. Se vuelve a agregar coloca un cubreobjetos y se vuelve a evaporar hasta sequedad.
una gota de reactivo y se evapora de nuevo. Se deja enfriar y se observa al microscopio. ·
Se repite el procedimi ento una tercera y cuarta vez; se deja enfriar el portaob- El resultado positivo consiste en la obtencién de los cristales de piridina-hemo-
jetos y se observa al microscop io. cromégeno, de color rosado intenso y de aspecto de red o similar a helechos.
La aparici6n de los cristales caracteris ticos de Teichmann , indicaran un resul - . •
tado positivo. . ;,.. ,yY• e<'
· lii. Metodo cromatografico f "- ~-+- o.r ..-O((I.
Se basa en la obtencién del mism~ carac:terist \copara un extracto de la
Método de Takayama muestra y un testigo de sangre, ambos sembrados sobre papel para uso croma-
Es mas reciente que el anterior, mas simple en su realizacién y lo ha reemplazado tografico o sobre placa delgada.
en muchos laboratorio s, aunque es aconsejable el empleo de ambos métodos. Esta ultima técnica ha desplazado a la primera por sus ventajas.
Es especifico y esta basado en la obtenci6n de los cristales de piridina-hemocro-
Parte experimental
m6geno corno consecuen cia de la acci6n del reactivo sobre la hemoglob1na de
la sangre, presente en la muestra. Reactivos y materia/es
El reactivo consiste en una mezcla de piridina, soluci6n saturada de glucosa - Placa delgada de silica-gel G (uso cromatografico)
y soluci6n de hidr6xido de sodio. Los cristales ·obtenidos son de color rosado - Solvente: metanol-acido acético-agua 90:3:7
)1
intenso (Fig. N° 14). - Sangre testigo diluida 1: 1000 en solucién fisiologica
Reactivo revelador: solucién de verde de malaquita; disolver inmediatamente
FIGURA N° 14 antes de su uso, 0, 1 g de leucobase del verde de malaquita en 1 O ml de etanol,
adicionado de 2-3 gotas de acido acético.
,, - Soluci6n de agua oxigenada al 6% (20 volumenes)
.~ ~-~55'
- :-t'q.::·~.15;.,,. ~
- Cuba cromatografica
- Pulverizadores.
ti.
·~t.~ 4·
''~1
Técnica
Se disuelven las manchas con soluci6n fisiologica. Se hace una prueba prelimi-
nar, sembrando sobre placa delgada diferentes cantidades del ex.tracto de mues-
., ... ./ ': ;:
tra, o sea 1 , 2 6 5 microgota s; luego se pulveriza con el reactivo leucobase del
verde de malaquita y agua oxigenada .
•
. ,
t -•·..
. ;, • , -•
~
" ,..~'-. "'.,
~:r·;.·t",.,,;~:
'
) > ~ I
Para el desarrollo cromatogr afico se elige la cantidad que dé una reacci6n
neta, pero no demasiado intensa, y se siembra en la linea de partida.
- • r · • ·. . .. .~.?!',f<' A continuaci 6n se siembran 5 microgota s de sangre testigo diluida 1: 1 .000.
- · Il'!' .a . : ·-:~;., ~ Luego de unos minutos se coloca la placa en la cuba cromatogr afica, previamen
te
..,_IIIJI!" . ' 1' . ~-·~•\· . . ~ ' saturada con el solvente menciona do. Se desarrolla el cromatogr ama hasta que
,-lt ~ • ·- •... t.-. -:.i: _•,.:
.. .-....
., I ~ -&.~.., .. • 'f ' ''" .
la altura del solvente en la placa supere los 10 cm.
Se retira la placa de la cuba y se seca en una estufa a 100° ç d urante 5 minutos,
Parte experimen tal
eraèvita ricrinterfe rencia- de las 1?._
e roxidasas de o ri gen_veg~ f
Reactivos y materia/es A cont muaciòn se rocia con el reactivo verde de malaquita y luego de uno
- Reactivo de Takayama: Se mezclan 3 ml de soluci6n de hidr6xido de sodio o
al dos minutos, si no aparece coloraciòn , con el agua oxigenada.
10% (p/v). 3 ml de soluci6n saturada de glucosa. 3 ml de piridina y 7 ml de En caso de resultado positivo (e~~cia de sangre) aparecerà una manchita
agua Esta soluci6n debe guardarse en la heladera y renovarse periodicam ente. · verde mas o menos intensa con u1~ e 0 ,7 a 0,8 (Fig . N° 15). •
Portaobjetos y cubreobje tos
- Micropipetas IV. Método mlcroespectroscoplco
- Bano de Maria Constituy ò durante anos uno de los métodos utilizados para la inves\igac iòn
- Miaoscop io de manchas de sangre, en lo que respecta al reconocim iento de la misma. Actual-
2,0 mente su uso ha sido desplazad o, principalm ente por lo métodos cristalogra ficos.
2 11
 l
l
Cuando la muestra de sangre es fresca, e\ método no otrece prnbl .
FIGURA N° 15 que se disponga de la cantidad suficiente; pero, si la manchae;t!·~'""'~""
hernoglobina •se habrà transformado parcialmente. en rnetahemoglobina~•egmu"a:.'°G
, .\.\na
y hernocrornogeno. Cada una de estas sustanc1as da su espectro òe absorc\òn
caracteristico, dificultando la observaciòn.
La carboxihemoglobina da un espectro similar al de la oxihemoglobina, pero
con un ligero desplazamiento de las bandas hacia el violeta.
Si se agrega un agente reductor, la oxihemoglobina se transforma en hemoglo-
bina reducida, cuyo espectro presenta una unica banda ubicada entre las dos
' • •• •
t correspondientes a la oxihemoglobina y que se denomina banda de Stok.es.
La carboxihemoglobina, en cambio, mantiene la doble banda aun luego del
agregado de un reductor ..
Los reductores ernpleados son el ditionito de sodio o el reactivo de Stok.es.
Descripci6n del ocular microespectrosc6pico de Leitz (Fig. N° 17). Consta
d~ dos partes superpuestas que se pueden piegar o desplegar m~diante una
b1sagra.
FIGURA N° 17
ST: sangre testigo
M1 M2 ST M3 M4 M: muestras de 'Ì
sangre seca
i -r --H- -
Consiste en observar el espectro de absorciòn de la oxihemoglobina, con un
microscopio previsto de un ocular microespectroscòpico, en lugar del ocular
corriente.
El espectro de absorciòn de la oxihemoglobina està caracterizado por dos o
bandas de absorciòn cuyas longitudes de onda correspondientes son 576-578
nm y 540-542 nm, situadas entre las lineas D y E del espectro visible (Fig. N° 16).
FIGURA N° 16
G
Il
f
I. Oxihemoglobina lii
Il. Hemoglobina reducida
lii. Metahemoglobina IV I
IV. Metahemoglobina en I
medio alcalino V I
v. Hematina A acida I
VI. Hematina alcalina VI I
VII. Hemoglobina en
soluci6n de FNa
VIII. Carboxihemoglobina
VII
VIII
~
Ocular microespeètroscòpico
213
212
 -.! ,
,~·; -.
c r d regula adecuadamente
La inferior es el ocular propia mente dicho que !leva dos
. Por medio de los dos tornillos de los colimadores se
o retirar ~ ':~u~; e~ Yun pns~a n que esta en la platina .
. de reflexiòn ·total. Este ultimo se puede coloca r el ancho y el largo de la ventanita que perrnite ver la soluci6
ral de Amici, sobre el
su totalidad ha .' p~r ~ed10 Se caloca el tubo superior que contiene el prisma espect
de una pal~nc a externa, Y sirve para reflejar en
espec tral coloca do en el tubo superi or • el haz de
luz que t '. ac,a e pnsma inferior, y se examina el espectro.
a ravIesa un tubo que la zona entre las lineas
se ,.. I I I . a contener la I ·· • Si la mancha es de sangre reciente, se observara en
-O oca atera mente . Este esta destin ado la oxihemoglobina, a las
que se c~~uc1on. test1go de D y E, la doble banda de absorci6n caracteri stica de
sangre , la que sumin istra el espec tro de absorciòn
parara con el de longitudes de onda correspondientes.
la muest ra col~d a en la plati~a del micros copio. La especificidad se incrementa si se agrega al tubito que
contiene la muestra,
. La_~~e ~upenor del o_c~lar m1croespectrosc6pico contien e el prisma espectral
una gotita de soluciòn reductora (Soluciòn de ditionit
o de sodio o reactivo de
una lente en cuyo plano tocai
de v1s1on d1~ecta de Am1c1 y, por encima de éste, Stokes).
se forma la Imagen del espect ro. ara que la soluciòn
Se agita a continuaciòn con una varillita de vidrio. Se observ
ro, previsto el espectro. La apariciòn
A un cost~d o del tubo superior hày otro, horizontal, de menar diamet torna un color violado . Se vuelve a observar nuevamente
a proyectar por medio de un anteriormente , confirma el
de un espe10 y un~ lente. Ambos estan destinados • ..1
"f
de una unica banda situada entre las dos observadas
que se refleja en la cara
haz d~ luz con~eniente, la 1magen real de una escala resultado.
superpuesta a la imagen del
supen or del pnsma Y !lega al ojo del observador,
espec tro.
i6n del sodio 589, sirve lnvestigaciòn de la especie
Dich~ escala, pr~vio calibra do con la linea de absorc
iòn, la longitud de onda que
para as1gnar a las hneas de los espect ros de absorc
les corres ponde . lntroducciòn
, y previo a su tipifica-
Una vez realizados los ensayos confirmatorios de sangre
Parte experimental no o de otra espec ie-,
ciòn, debe efectuarse la investigaciòn del origen -huma
Reacti vos y materia/es aL.@.&Qertenece la muestra.
torio de qui mica forense .
- Soluci òn testigo de sangre al 0,5%. Esta investigaciòn es una tarea de rutina en todo labora
casos de homicidio, roba
- Soluci òn de ditioni to de sodio: se disuelven aproxim
adaniente 30 mg de ditio- Reviste particular importancia en el esclarecimiento de
animales, etc.
nito de sodio en 5 ml de agua destilada alcalin izada
con unas gotas de NaOH de ganado , accidentes automovilisticos causados por
afectar la posibilidad
al 40%. El quimico especializado sabe que varios factores pueden
y 200 mg de acido tartarico de asegurar el origen de la sangre .
- Reactivo de Stokes: se disuelven 300 mg de FeS0 4 eJ aJJ?anc.ha.-a,cci6o
en 1O ml de agua. En el mome nto de uso se agrega
n gotas de amoniaco hasta Los mas importantes de estos factores son: antig_Qedacul
1as 1eIDJl.er.alYI?~ Javado
la disoluciòn del precip itado formado. del sol , hume.dad,_putreiacci 6n desarro no deltongos...al
tra la saQ_gre .
- Microt ubo: consiste en un tubo de 3 mm de diamet
ro y 5 cm de altura, adherido y la naturaleza de la superficie sobre la cual se encuen
de balsamo de Canada.
por uno de sus extremos a un portaobjetos, por medio
Generalidades
El tubito esta pintado. exteriormente con pintura negra. dad casi, exclusivamente,
- Microespectroscopio La determinaciòn de la especie se realiza en la actuali
por el método de la~ eci~ I cual desplaz6 la observaciòn de los elementos
- Micros copio.
figurados de la sangre ..
en una muestra ha sido
Técnica · En algunos casos, la presencia de los glòbulos rojos
s difieren entre ciertas
a, se utiliza el microtubo de valor, dado que el tamafio y la morfologia de los mismo
Si se dispone de muy pequefia cantidad de muestr
. especies.
que hemos descripto. todos los mamiferos. son
mancha. La concentraciòn Los gL6bu!os rojos del hombre, corno los de casi
Este se Ilena con dos o tres gotas del extracto de cjrcuiares y sjn nucleo, a excepci6n de los del cametlo y otros relacio
nados, corno
mas adecuada es al 0,5 por ciento de sangre. .
utilizarse un pequefio los de la tlama, que son ovales, pero también sin nucleo
Si se disponè de mayòr cantidad de muestra puede Las aves, reptiles y peces, poseen glòbulos rojos nuclea
dos y de mayor tamano
bjetos.
vasito, que .se caloca directamente sobre un portao
el microtubo. que el de los humanos.
La concentraciòn de muestra es la misma que para en cuestiòn no puede
microscopio. Mediante estos datos es posible constatar que la sangre
Se caloca el portaobjetos con la muestra, sobre la platina del se coloca el pertenecer a determinadas especies. quedando las
mismas excluidas.
su lugar
A continuaciòn se retira el ocular del microscopio y en ~é todo es poc.o_u.suau m los an~lisis de rutina, debido a que la
muestra
on=diente, al tubo del micros-
microespectroscopio, fijandolo con el tomillo corresp se recibe en el laboratorio, generalmente cOnios eleme
ntos f1gurad o!f@O oulos),
copio. ·--- ,_ · -·-
a por el ocular destruidos o irreconocibles .
Se pliega la parte superior que contiene el prisma y se observ Si se desea realizar este tipo de investigaciòn , puede
recurrirse a las técnicas
del tubo inferior. de elementos fìgurados (glò-
netamente a la mencionadas anteriormente, referìdas a observacìòn
Se enfoca el tubito de modo tal que el haz de luz atraviese 21 s
muestra.
2 14
 :1
"'' .
"'
La aparici6n, antes de 20 minutos, de un anillo e_n la interf~se en el \u'Q.Q..m)J
bulos rojos), corno método de certificaciòn de la existencia de sangre \\le
en una la diluciòn es 1 en 10.000 o pr6xima a la m1sma, ~ dica gue e\
mancha. antisuern
adquirido tiene el titulo correcto . . . . .
~ ~1ì1 ~ fd \jf',(.lj.:: f'f-0 Q~ 'Ì.._ -n>;..7fìi:. I.'\\ I."\ ··, e I i) T._ Jl l
se -entiende por titulo del antisuer o a la inversa de la ultima d1\uc1òn que da
:\ N I r- t A..
·
tk
. ,,- ~• 1,,_, ' 1
I 1:. ~ Ensayo de las preclpltinas
' r ,W lN 1\N,'\r.o,- \'- Q resultado positivo.
4. Especificidad. El antisuero a emplear debe ser espec1f1 ..
co respecto de la espe-
Genera/idades. Una vez preparado el extracto de la mancha y del bianco, cie contra la cual fue preparad o. .
se Se sabe que un antisuero contra las proteina ..
realizaràn los analisis que conducen a la determinaciòn de la especie s del s_uero de un arn~al, ta~b,en
a la cual contiene anticueq::,os contra proteina s de espec1es muy ~elac,on
pertenece la mancha de sangre. , - - - - - ad~, por
ejemplo: antioveja, contra proteina s de la cabra. Esto se ~xphca por
Estos analisis consiste n en una..r:eac ciòn antigeno -anticuer Qo. y la ex,st~n-
corno la misma cia de antigenos comune s que han sido estudiad
se visualiza con la obtenciòn de un precipitado, se conoce con el nombre os por la mmuno- ~ematol o~1a.
ensayo de las precipitinas. de '\I Se controla la especific idad con muestra s de sangre pertenec ,entes
a dife-
Desde el principio de esta centuria, se sabe que es posible distinguir la i
sangre I rentes especies.
de diferentes animales por medio de antisueros precipitantes especific \ Pueden conservarse en forma de gotas secas sobre papel y se diluyen
os. en
Un animai contiene y puede tolerar sòlo su tipo de proteina. Si se le inyectan soluciòn fisiologica, cuando se necesita n.
proteinas de otras especies , se pone en acci6n un Con el antigene especific o, el antisuer o dara una reacci6n positiva
mecanis mo de respuesta a mayor
inmunol6gica, el animai genera anticuerpos especificos (precipitinas) diluci6n y en menor tiempo que con el antigene relacion ado (pertene
que preci- ciente
pitaran las proteina s extrai'las . ,,,.-- - - - - - a una especie pròxima) .
En la practica, con el objeto de 'o btener los antisueros gue permitiran investiga
r
el origen de la sangre, se inyecta en un animai. usualme nte un conejo, suero Torna de muestra.
humano o de cua!.gJ.!.LeL.Qilll.-e.sp eci.e ~etmllilfi lldo.1éCIBkau QJ:Qp.iadas_d.eJ Para solubiliza r la sangre es recomen dable utilizar soluci6n
nmuoi= fisiologica. El tiempo requerido para la
zaci6n. extracciò n depende ra de la antigi.ied ad
Cuando el conejo haya formado suficiente cantidad de anticuerpos contra de la mancha. Este no debe ser demasia do corto, con el fin de disolver
las no solo
proteina s inyectad as, se procede_
ra ~ su sangrado la hemoglobina, sino también las proteina s del suero. En generai, si
. Se separara el suero, conver- la mancha
tido en antisuerQ çontraJ .~gecie garticular cuyo suero· sanguineo se no es redente, se efectua la extracciò n durante 24 horas en heladera
utilizò ~ @ · se evita
laJny.ecci6n.... asi el desarrollo de bacterias y se obtienen .resultad os satisfact orios. '
En al~unos casos se ha recomen dado utilizar solucion es alcalinas para
facilitar
Condiciones que deben cumplir /os ;Jntisuero s. Los diferente s antisuero s son, la d1luc1on. Este recurso debe ser la excepciò n, siendo preferibl e, de ser
necesar io,
generalmente, adquirid os en el comercio . Se denominan antisuero aumentar el tiempo de extracciò n.
humano o
suero precipita nte anti-hum ano, anti-perr o, etc. Cual_quiera sea el materiai suieto a este analisis, debe someter se al mismo
Deben cumplir una serie de exigencias para asegurar la eficacia de su tratam1ento una zona no manchad a cercana a la mancha.
empleo.
Estas son: Los ensayos en bianco no deben omitirse.
1. Estèrilidad. Se logra por los medios serològicos usuales.
2. Libre de turbieda d. Cualquie r opalesce ncia vuelve imiti! al antisuero . Es con- Condiciones que deben
veniente sangrar al animai producto r de antiTueri::ios luego de un ayuno cumplir /os extractos de sangre. Oeben ser limpidos ,
de 24 neutros y de la diluciòn conveniente. En e\ caso que los extracto s obtenido
horas. i V oc..t'::>O \w ~- ,'. \_, · ~ ... 't r:1, . x:\ ',Cil s sean
Se recomie nda adquirir los·antisueros ti9filizados) pues se conservan mejor. turbios, se recurrira a la filtraciòn o, mejor aun, a la centrifug aci6n.
Una vez solubiliza
l• . . 1'(1
1 El extracto debe tener un pH pròximo a 7 para evitar
dos, deben guardar~ e en frascos bien cerrados , y en la J... precipita ciones an6mala s
' ' de las proteina s del
heladera (entra 0° y 4° C). antisuero . La diluciòn 1 : 1.000, lleva practica
Si se conservan antisueros liquidos en ampollas abiertas, luego de un
v, ' neutro. Por otra parte, ésta es la diluciòn convenie nte para evitar falsos
mente al punto
positivos .
uso, pueden enturbiarse rapidam ente y volverse inutiles.
primer I e 1, • \\r
I
, La sangre testigo se diluye también 1 : 1.000, con soluci6n fisiologic
a.
3. Titulo adecuad o. Es recomen dable un titulo de 10.000. -Para titular La muestra bajo examen debe ser diluida hasta una coloraci6 n débilmen
el antisuero te
se diluye en soluci6n fisiol6gic a, suero rosada o amarillo paja laproxim adamen te 1 : 1000), con la cantidad necesari
de la especie que se utiliz6 corno a de
agente inmunizante. Por ejemplo , suero humano, en el caso que se soluciòn fisiologic a. El color depende de la antigiied ad de la mancha.
titule un Otra manera de estimar si se esta pròximo a la di\uci6n buscada , es
antisuero humano . colocar
Luego, en una serie de microtub os rotulado s, de 40 mm por 3 mm de unos mililitros de la soluciòr {en un tubo de ensayo y agregar _1 6
diametro, 2 gotas de
se colocan 0.05 ml del antisuer o humano a titular. Cuidado samente se agrega \-1\\Cì 2i acido nitrico al 25% . Se calienta a ebullici6 n. Una palida
la diluci6n es pròxima a 1 : 1000. Si se forma un intenso precipita do,
turbieda d indicara què
a cada tubo, por las paredes del mismo y por medio de una micropip el extracto
eta
(utilizando una nueva pipata cada requiere una mayor diluciòn. --;
vez), 0.1 ml de las distintas dilucione s de
suero humano preparad as, evitando que ambas soluciones se mezclen Por otra parte, si se agita un tubo de ensayo que conteng a la soluci6n
. en la
diluci6n 1 : 1000, debe formarse una espuma que persiste poco tiempo.
216 e:, , , •._
-At-JTI ....,ucr~ · -'.:.\JC. r?. o ~ -P (;JY) "'let b O,)n(.l_:q r•_.. ~ 217
d ~'rl-_·c~ \.1Cr;: \ l ·~ ;, .. ,.
,, ) . ., . , ... , .• - ,J . t; f '.
►
'
Métodos e~pleados para el ensayo de las precipitinas.
Para_la reahzaci6n de este ensayo pueden utilizarse varios · t d .
en cap1lar y electroforesis. me o os. en tubo,

r La reacciòn debe ser negativa, comprobàndose que el suero del animai no

inmunizado no contiene precipitinas humanas.

1 . Método del tubo
~n un tubo s_e ?oloca pr!meramente el antisuero; luego se agrega el extracto de
a man~ha, _d1lu1do ap~ox1madame~te 1 : 1000, con una micropipeta, manteniendo
el tubo inchnad_o y deJando escurnr la ~oluci6n por las paredes del tubo, de modo
que esta solu~16n quede sobre el ant1suero, sin mezclarse.
Se debe ev1~ar la forrnaci6n de burbujas de aire que dificultarian el contacto
entre !as soluc1ones. En caso de resultado positivo, se debe formar un anillo neto
en la 1nterfase.
El ta_mano de los_tubos no es de gran irnportancia y dependera de la cantidad
de ant1suero que d1s~ong~_el investigador. Pueden utilizarse los microtubos que
se ernplearon en la t1tulac1on del antisuero (40 mm x 3 mm).
2. Método con capilares
Resulta adecuado para economizar antisuero o cuando se dispone de muy
poca cantidad de rnuestra.
Se utilizan tubos capilares de pocos cm de longitud. Se ,sumerge el extremo
l
'
--n
l
II
3. Método electroforético.
La técnica electroforética brinda la posibilidad de efectuar el ensayo en un
lapso corto.
El método consiste en una electroforesis en medio soporte, constituido por gel
de agar.
El agar es una sustancia con caràcter acido debido a los radicales sulfatos
que posee y que le confieren una carga total negativa.
El liquido contenido en el gel de agar se carga positivamente con respecto a
éste.
Al aplicar la corriente eléctrica, se tendria que producir el desplazamiento del
agar hacia el polo positivo (anodo) y def liquido hacia el negativo (catodo). Como
el agar esta adherido a la placa de vidrio, no se desplaza.
En cambio, el liquido se mueve hacia el catodo y genera la corriente electroen-
dosm6tica, en sentido contrario al de la migraciòn de la corriente.

Esta corriente electroendosm6tica es de suma importancia en el presente mé-

todo.
Consiste en practicar sobre el gel de agar, dos concavidades pròximas entre
si, ubicadas a lo largo de la linea de movimiento electroforético.
En la concavidad cercana al catodo, se caloca el extracto de sangre y, en la
l
del tubo en el antisuero y luego en el extracto de la mancha.
El _c apilar se caloca verticalmente sobre una base de plastilina. El precipitado pròxima al anodo, el antisuero.
se desarrolla en la interfase, de la misma manera que con la técnica del tubo. En el extracto de sangre, las proteinas séricas: albumina, alfa y beta globulina,
constituyen los antigenos, mientras que los anticuerpos del antisuero son gamma-
Controles para los dos métodos mencionados. globulinas.
Hay que considerar la posibilidad de reacciones falsas positivas. La electroforesis se lleva a cabo a pH = 8,6. Si bien a este pH todas las
Deben realizarse una serie de ensayos de contrai que establezcan claramente proteinas séricas se encuentran cargadas negativamente, su densidad de carga
que el antisuero empleado es correcto, tanto en titulo corno en especificidad y eléctrica decrece en el siguiente orden: albumina, alfa-globulina, be.ta-globulina
que ninguna contarninaci6n accidental o reacci6n positiva no especifica, causada y gamma-globulina.
por otras sustancias, son responsables del precipitado formado en el tubo con- Al aplicar las diferencias de potencial, las tres primeras fracciones migran hacia
teniendo el extracto de la mancha cuestioriada y el antisuero. el anodo, mientras que las gamma-globulinas, de muy baja densidad de carga
Por ejernplo, si se sospecha de la existencia de sangre humana en la mancha, negativa, son arrastradas por la corriente electroendosm6tica hacia el catodo.
se incluyen los siguientes controles: De esta manera, la reacci6n antigeno-anticuerpo se produce en el area com-
a) Bianco: El extracto del materiai sin rnancha, preparado corno se detall6 prendida entre las concavidades y se observa la formaci6n de bandas de preci-
oportunarnente, puesto en contacto con el antisuero, no debe dar reacci6n. pitaciòn, cuando la reacciòn es positiva.
De esta rnanera se descarta la existencia de sustancias propias del sustrato,
capaces de formar precipitado en presencia del antisuero. Parte Experimental
Se evidencia la importancia de este ensayo de contrai en el caso de manchas Reactivos y materia/es
sobre rnadera o cuero. En estos soportes, la presencia de ·taninos que
- Agar grado electroforético con baja electroendosmosis (Agar purificado para
actuan corno precipitantes de proteinas, pueden dar lugar a reacciones
lnmuno-electroforesis OXOID).
positivas no especificas.
- Soluciòn de agar al 0,2% en agua.
b) Soluci6n fisiologica ernpleada para so!ubilizar la muestra: No debe producir
- Soluci6n de agar al 2% en agua.
precipitado al reaccionar con el antisuero.
- Buffer gel (pH = 8,6) constituido por:
c) Sangre da animales de especies diferentes a la humana, diluidas 1 : 1000:
Barbiturato de sodio 7,00g
no deben producir reacci6n con el antisuero humano.
Acido dietil barbiturico (Veronal) 1,109
d) Suero humano conocido diluido 1 : 1000: Este contrai sirve para demostrar
Lactato de calcio 1,00g
que el antisuero reacciona con sangre humana y que posee un titulo ade-
Agua destilada 1 litro
cuado.Ademas puede usarse para comparar otras reacciones positivas.
Conservar en la heladera
e) Suero normai de conejo: Se pone en contacto con el extracto de la mancha.
2 18 219
 (
clando volumenes iguales de
agar
,,·; 0,5c m 1
o{ )'" -'
cm
Gel de yaga a pre par aci6 n se realiza mez
Estgel.
bufr:fer c5ò 00 00
al 2%
8,6) con stitu ido por: 0 0 00 00 00
ButtE:r par a la cub a {pH =
Bar b,tu rato de sod io 8,7 6g 00 00
Aci do die til bar bitu rico {Ve
ronal) 1,3 8g o.6 {o Q_ _9 o
1cm
Lac tato de calc io 0,3 8g cm
Agu a des tila da 1 litro
Con ser .,ar en heladera
io 1 M. Soluciones de siembra
Sol uci 6n de clor uro de sod en mii de sangre fresca
o por : Se prepara una diluciòn uno
Col ora nte : est a con stit uid a) Sangre humana testigo : a.
al medio con agua destilad
Neg ro am ido 1 O B 0,1 0g humana en buffer gel diluido ecies: Se pro ced e de igual forma que en la prepa-
Me tan ol 40 ml b) Sangre testigo de otras esp ana por un volumen
igo, supliendo la sangre hum
Aci do acé tico gia cial 10 ml raci6n de sangre humana test
especie a ensayar.
Agu a des tilad a 50 ml igual de sangre fresca de la coloca un trozo de materiai manchado (aprox i-
- Sol uci 6n de lava do: Esta con stit uid a por : c) Extracto de mancha 2sec
a: Se posteriormente
de un tub o de ensayo; se agrega
4 par tes de me tan ol madamente 0,25 cm ) dentro y agua destilada hasta
da partes iguales de buffer gel
5 par tes de agu a des tila gota a gota una mezcla de o rosa palido.
una colorac i6n amarillo paja
1 par te de aci do acé tico
gla cial obtener, luego de macerar, uno en mii de sangre
a el electrodo negativo la obtenida· con la diluci6n
tro com par timi ent os: dos par Esta coloraciòn es similar a
Cub a ele ctro foré tica de cua de pla tino . Tam bién pueden utilizarse electrodos de igual diametro .
bos
y dos par a el pos itivo , am mm de diam etro .
fresca en un tubo de ensayo cha, per o empleando un
igual forma que con la man
de ace ro ino xida ble de 0,5 d) Bianco: Se procede de
ran go de trab ajo entre O
y 300 V y O y BO mA. trozo de materiai no mancha
do.
Fue nte de pod er con un de larg o por 2,5 cm de ancho.
Por tao bje tos de 7,5 cm ado . Corrida electroforética
de dia me tro o mic ros aca boc orificios de la 1a , 3 , 5•
8
Pip eta Pas teu r de 1,8 mm e par a los pue nte s. brara el antisuero en los
Pap el o ma teriai abs orb ent Sobre la placa de gel se sem 8 , 28 , 4•, 6• y aa colu mna
s
, muestras y blancos , en 1
- Cam ara hum eda . y 7• columnas y los test igos
echa.
numeradas de izquierda a der
6• 8• Columnas: sangre test igo,
Téc nic a 2• 4•
de gel. muestra o blancos
Pre par aci 6n de las pla cas e desengrasados, limpios
y I I
tos des crip tos , pre viam ent o
Se util izan los por tao bje
sec os. Se col oca n sob re
una sup erfi cie pla na y nive
lada .
<I
I o cb o c.6 0 0
de aga r de con cen trac i6n
de 2 a 2,5 ml de una solu ci6n 00 00 00
Se vie rten prim era me nte de Ma ria. +I 00
ent ada y tun did a a ban o.
de 0,2 %, pre via me nte cal uto s a tem per atu ra am bien
te
Est a prim era cap a se dej
a rep osa r de 30 a 40 min
h.
o 1 0 Io Io
y lue go se sec a en est
uta e 65° C dur ant e 1 ½ r
4 a 4,5 ml de gel de aga
era cap a, se vier ten de 5• 7• : antisueros
Lue go, sob re est a prim 1• 3•
pre via me nte cal ent ado
y tun did o a ban o de Ma ria.
i6n , sien do esta cap a final
min uto s has ta su soli diti cac
Dej ar rep osa r de 20 a 25
de 2 mm de esp eso r. al ras los correspon-
n los necesarios para llenar
liza rse en cam ara hum eda
. 11 Los volumenes a sembrar sera
Su con ser vac i6n deb e rea
i dientes orificios .
Deberan usarse para tal fin
las pipetas capilares deseng
buffer correspond iente en
rasadas y secas.
la cuba electroforética
de gel A continuacién se vierte el volumen y que cubr:
Per fora ci6 n de las pla cas Pas teu r que pos ea en su partimientos posean igual
abo cad o o una pip eta de tal forma que ambos com
Se utiliza par a elio un sac totalmente los electrodos. ente cuyo ancho coir
a con boq uill a. dos tiras de materiai absorb
ext rem o sup erio r una gom gel y se asp ira por la boq
uilla , Se realizan los puentes con dimens iones de la cub ,
pip eta Pas teu r sob re el cuyo largo dependera de las
Se apo ya la pun ta de la cida con el portaobjetos y columnas conten ienc
log ran dos e asi orif icio s
;a
de 1 mm de dia me tro. orif icio s es el ind ica do En su centro se coloca el por
taobjetos, de tal forma que las
2:
da y la dis tan cia ent re los
B asp ect o de /a pla ca per fora
e n la sig uie nte figura:
220
-
 .l:1
~
~C::.-. 7
~
"- antisuero queden del lad~ de1 anodo y, las que contiene
' y t;,lanco~. del lado del catodo, coma se indica en la fi sangre test1go, rnuestras
~n~
. Cada tira de materiai absorbent e se dispondra ca gura antenor.
gidos en el buffer de la cuba del com"artim ient n de sus extrernos surner-
1
apoyado sobre el borde de I~ placa d; gel corro an dico e. o catòdico Y, el otro, Tipificar una mancha de sanare es encontrar su tipo o grupo dentro de la·
La electrofor esis se llevara a cabo a un v . espond1ent ~ rnayo~ caf!!!_d~ os1ble de sistemas y es fundamental para lleaar a la individua-
lizac1on.
1 O a 20 minutos. oltaie de 1 SO V Y durante un lapso de
Una vez finalizada la corrida, se verificar · 1 ·• •• -~ ha mencionado que es muy probable que queden en la escena del deli\u I
de un precipirad o bianco entre dos orificios~ a reacc1on Pos1t1va por forrnaciòn rnanchas de sanare. Si se comprueba que las mismas no pertenecen a la victima, \
su estudio es muy importante ·para localizar al criminal.
Revelado
Por otra parte, si en ropas ù o_bjetos pertenecientes a un sospechoso, se
encuentran manchas de sanare diferente a la suya y coincidente con la de la
victima, ,seria una prueba mas de culpabilidad.
luego de ,eg;st,a, los rasultados , el Portaobjet os se some,g;,a durante un, No podran sacarse conclusiones valederas si hay semejanza entre los arupos
noche en una ~oluc16n de CINa 1 M; posteriorm ente se lava con agua y se deja sanguineos de sospechoso y victima, pudiendo aleaar el primero que las manchas
secar_. Para meJorar la visualizaci 6n, se expone la placa de gel a la acciòn de la encontradas en sus pertenencias, se deben a su propia sanare.
soluc16n colorante durante 4 a 5 minutos.
Esta posibilidad de coincidencia entre los grupos sanauineos de dos individuos
Finalment e se retira el exceso de colorante con sucesivas alicuotas de soluciòn se hace cada vez mas remota, al ser mayor el numero de sistemas utilizados en
la tipificaciòn de la sanare.
de lavado hasta obtener sobre la placa de gel, nitidas bandas azules sobre fondo
claro.
Los avances producidos en este campo de la ciencia han incrementado la
Un ejemplo de aplicaci6n del método electroforé tico se cita a continuaciò n:
. probabilidad de asignar a un individuo en particular, una mancha de sanare .
Para la tipificaciòn de las mismas se utilizan las técnicas ~nmunolo~
Se comete un homicidio con un arma bianca y el principal sospechos o resulta . bioquimicas . Estas ultimasse basan en la investiaaciòn de protemas polimort,cas
ser un camicero quien niega toda participaci 6n en el hecho. e isoenzimas.
Se secuestra n en su comercio varios cuchillos ensangren tados. Una vez rem1-
tidas las muestras al laboratorio , se realiza la electrofore sis para determin_ar la
especie a la cual pertenece n las manchas encontrada s, utilizando sueros anti-hu-
.d •
Técnicas inmunol6gi cas
mano anti-vaca y anti-cerdo .
lntroducciòn
Se ~omprueb a que en uno de los cuchi_ l l?s la sangre es humana. Esta evi encia
Las técnicas inmunològic as seran aplicadas al estudio de los SÌS_temas...AB.0.
sirvi6 para lograr la confesi6n de culpab1hda d del sospechos o ·
MN_y~
' Se basan en la existencia sobre la superficie de Ics qlòbulos rojos de la sanare,
1 ✓.:;--,c. de ciertas estructuras gui nJ.Lc.g_s llamadas antlgenos. Son estos antiqenos lns rn•e
antisueros .,. cgnJieren a la sang ~o dentro de cada sistema sanguineo,
extracto de la mancha
desangre E!]_§angre !!:esca, la presencil!_o ausencia de un antigeno , se determina por la
suero anti-vaca o no precipitado o ti aglutinacion o no de los glòbulos rojos puestos en contacto con un antisuero
especifjco en determinad as condiciones .
En manchas de saogre seca los gl6b11l0s rojos estan generalmente destruidos
+ suero anti-cerdo. o no precipitado o y, por lo ·tanto, las técnicas dfiì aglutinacio ndirecta, no son aplicables.
Sin embargo, los antigenos no se desnaturalizan inmediatamente y retien~n la
suero anti-human o o ) precipitado o 7
capacidad de combinarse con anticuerpos especificos.
I
!;I P.ri[Der_gl}!Qo sc!!l_guineo conocido, y aplicado a la investigaciòn de manchas
gamma-glo bulinas albumina, alfa y beta ~ecas de sangre . fue el sistem a ABO.
globulinas
( +) ) (-) Sistema ABO
(anticuerpo s) (antigenos)
Generalida des
A partir de los estudios de Harvey sobre la circulaciòn de la sangre, publicados
en 1628, se hicieron tentativas de curar a enfermos inyectandol es sangre de
Tipificaci on de manchas de sangre humana.
animales.
Denys, en 1667 , detalla las graves consecuenc ias de estas transfusiones.
Generalid ades
Landois, en 1875, publica dos estadisticas , una de ellas, referente a \Tansfusio-
Si en la investigac i6n de una mancha se comprueb a que es de sangre y que nes de sangre de animales a seres humanos y . la otra, reterida al empleo de
pertenece a la especie humana, la et~i:>a final de S.,!;!ilnalisis consiste en la ti p ifi-
sangre humana.
ca_çié>n_g~ .@.!lliSmL 223
222
........ ~qp,;•J?.._.c.p'
 ' ~-.,-..-. ,.,~ - ~ -
sus glòbulos roios 'I e\ ""\'"'"" ' ""'
eran lamentables, utilizando sangre Un individuo del grupo A tiene el antigeno A en antlgeno B en los ~""' ""'
Si bien· con sangre de animai los resultados . . , y un individuo del gru po B posee eluos del grupo AB \\enen los
algunos casos resultaban exitosos; individ
a~t• Ben Su ~uero, - nti A en su suero. Los suero carece de los an\icuetpos
humana, los mismo s fueron muy diversos. En ias. lòb los y su
en otros, se produ cian graves consecuenc ro1os y el ant,cuerpo a I'\ 'I B en
ado Denys y Landois, eraen debidas ~ _dos antigenos A Y B ~n ~~s 9 u rupo O no tìenen los antigenosy anti
Las reacciones adversas que habian observ 9 mbos anticuerpos , _anti A B en
corres pondientes Y lo~ !l9 v,duos del
1 1
:es. Pero aun debian transcurrir
a la presencia de poderosos anticuerpos natura ra los dramaticos fracasos.
ro~po
la..s.u.p erljçie de sus globulos Q!.!le!.! 2 ~
:s e
e.!i
e anua:!!.!.!=:::..=:..::.:;=.:;....,_-
25 aiios mas, para el gran descubrimiento que explica n los cimientos de la inmu- .. . mbinar un aglutinògeno (antig ~no)
echaro
durante ese tiemp o que los investigadores el suero. -
Fue
nolog ia. Para ohtener aglµtinac,on, es necesano ca
humano normai no s61o aglutina . A seràn aglutinados por suero de
En el aii 1900. Landsteiner naia que el suero CQ[l_~u corres pondiente anticuerpo.
casos , los provenientes de Asi , glòbulos roios gue poseen el ant,geno
f1enen el anticuerpo antr A.
los gl6bu los roios e animales, sino que, en algunos s co~ ran aglutinaclos por sueros
otros individuos. sanare del qrupo Bo del grupo O, porgue am~o I se bo&_ 1&sos se enCuentn; e1
· Posteriormente, Landsteiner extrajo sangre
a los integrantes del persona! de Similarmente. g!Qbul os gue poseen el ant,geno
e_en:rn den ser aglutinados por
su laboratorio y separo el suero de los gl6bu
los rojos. provenientes del gi:.ui:io A o del grup.QJl..Q.o_[.ql,L dos
con cada una de las muestras s ro1o~ d.!ll OOJPO A_ Pl,!fil!!lli_-enen uno o los
N poner en conta cto cada uno de los sueros ~
el suero de cualqu1era de los otros tres grupo
s gue conti
s de los casos, se habian aglutinado
de gl6bu los rojos, comp rob6 que en alguno la oblaciòn
observaba aglutinaci6n . Q..O..!ldientes (arnLA..Y.&ao1i-:6)- a se presentan en P
los gl6bu los, mient ras que en otros no se amicuerpos ~
es en los gl6b11los rajns, que Las frecuencias con que los grupos de este sistem
"-- Ueg6 a la conclu si6n que existen dos factor idos corno antigenos, y que
én conoc
desig nò coma agluti n6gen os A y B, tambi aglutininas. de la ciudad de Buenos Aires, son:
el suero conte nia anticu erpos normales o grupo A = 39 ,6%
rr
r en klS gl6b"los •~o," "" grupo 0 = 47,2%
/ Landste;ne, post,16 g,e cada De'80 M IXJ<lla oosee grupo B = 9,6% grupo AB = 3,6%
. /J de los dos antiqe nos . amho s o oing11 na
I[ Cuan do uno de estos _agluti n6ge_n ?s..~
n los gl6bulos rojos de una (estadistica efectuada sobre 1000 muestras)
~ en el suero.
perso na, su correspond1ente aglutn;nna~ o, en los subgrupos A. YA2 Y, el
Por otra parte , cualq uiera sea el antige nb
~ una persona tenga en la superficie Los grupos A y AB son subdiviclidos : el primer
:
entes anticue rpos faltan en su suero. Es segundo, en los subgrupos A1B y A2B. en forma mas débil con el suero
\:,__ de sus ql6bu los rojos, los corres pondi La sangre que posee e\ antigeno A-i, reacciona
pudiera tener por ejemplo, antigeno A
obvio que asi sea, porqu e si una perso na anti A, que la que posee el antigeno A,.
en su suero, aglutinaria sus propios s mas frecuente que el A-i-
en sus gl6bu los y agluti nina a o enti A En los individuos A el antigeno A1 es inucho
gl6bu los. una aglutinina anti A,, de origen _
en la sangre de un mismo individuo Para distinguir ente A1 y A-i, puede utilizarse
El lema de Lands teiner era: "Nunc a existepondi ente" . vegetai (lectina), que se extrae de las semill
as del Dolichos bifloru s.
un dado agluti n6gen o y la agluti nina corres Esta lectina aglutina fuertemente los glòbu
los A1 y A1B, aun en diluciones
os A-i y no reacciona con los A-iB.
elevadas, reacciona débilmente con los glòbul
antigeno H. Estos glòbu los no son
Antig enos y anticu erpos en el sistem a
ABO Los glòbulos roios de grupo O, contienen el
si por el anti-H, que es una aglutinina
aglutinados por el suero anti Ani anti B, pero
Ulex europeus. ~
CUAD RO N° 1 vegetai (lectina) extraida de las semillas del
ineo AB0 en anchas sec de
Su empleo en la investigaciòn del grupo sangu . a sor-
las técnicas recarne
Grupo O Grupo A Grupo B Grupo AB sangre, se vera con posterioridad en una de
[ ciòn-eluciòn.
Antig enos prese ntes H A B AyB de manchas de sangre
Aplicaciòn del sistema AB0 en la tipificaciòn
la investigaciòn del grupo sangui-
Gener almente no se presentan problemas en
AntiA - n presentase inconvenientes en el
Anticu erpos en el suero AntiB AntiA neo AB0 en sangre fresca. En cambio, puede
as secas .
AntiB agrupamiento de sangre en casos de manch
y no siempre es posible llegar al
Para tal fin se requieren técnicas especiales,
- de la manc ha en estudio; es decir,
Su suero agluti na los A B A resultado deseado: reconstruir el grupo AB0
ntes en la misma.
gl6bu los rojos de los B AB AB encontrar los aglutinògenos y aglutininas prese
grupo s AB
Facto res que pueden afectar los resultados
de obtener un resultado incorrecto,
Sus gl6bu los rojos son
A Los factores que van a influir en la posibilidad
leza del sustrato sobre el cual se
- B A B son: la antiguedad de la manc ha, la natura
agluti nados por el suero
o o o ~ encuentra, las condi ciones a las que estuvo
expuesta, cantidad de muestra, etc.
de los grupo s ' 225
224
I ·-~ """ ......... _
I
 .i.)
ì
,,,,,
)-4' • La antiguedad de la mancha es de fundamental importancia en lo que respecta
a la investigaci~n de aglutininas. Estas son muy poco estables, por lo que debe
encararse s~ ?usqueda en el laboratorio, lo mas rapido posible. Tales costras estan usualmente disponibles cuando la sangre està concentrada
Los aglutinogenos
cambio,
en manchas de sangrc secas y bien conservadas son ' en
muy persistentes. en un area reducida y sobre un materiai no absorbente. De lo contrario se emplea
el método extractivo a tubo.
Son varias las técnicas que se han publicado para la investigaci6n, tanto de \\ oD-.~\... f\CS ·
aglutininas coma de aglutin6genos. Debe enfatizarse que es fundamental para
Técnlca de Lattes - 1 f\ (i\ \) --.J
el buen resultado de estos analisis, seguir las instrucciones recomendadas para Consiste en colocar una castra muy pequena de sangre sobre un portaobietos
la recolecci6n y traslado de las muestras al laboratorio. y ponerla en contacto con una suspeosi6n...®-9\6bulosrcltos cono_claos{A-; Bo
Con el objeto de desechar interterencias del sustrato sobre el cual se encuentra O). en soluci6n fisiologica.
la mancha, deben realizarse los blancos y ensayos de contro! pertinentes. Se cubre la preparaci6n con un cobreobietos, y luego de un tiempo, se examina
al microscopio la presencia o ausencia de aqlutinacìòn.
No se deben manipular las muestras con las manos sin guantes, ya que los
La castra a utilizar debe tener un grosor tal 9Y!LlliLlevante demasiado el
antigenos del sistema ABO se encuentran, ademas, en las secreciones: sudar,
~ ubreobietos, produciendo ~lguna~ onas una acumulaqi6n de glòbulos ~ue
semen, saliva, lagrimas, etc., en la mayoria de los individuos. Estos son los
pueda causar una falsa apariencia de aglutinaciòn.
llamados secretores. S61o un 20% aproximadamente no manifiesta esta prop1e- - - - sna castra es demas1ado delgada, la aglutinaci6n puede ser infima (dos o tres
dad· son los individuos no secretores. ;.!
glòbulos aglutinados), dificultando una lectura fidedigna.
Otro factor importante que puede afectar los resultados, es la contaminaci6n
.. J
bacteriana de la muestra.
Como se vera, las estructuras quimicas de los antigenos A, B y H, no d1f1eren
mayormente. Los tres son glicolipidos: .
Parte experimental
Reactivos y materia/es
HCPf\~\l\.) f\ )
E.\) TI\
I
e
- Soluciòn fisiològica: 9,85% de cl(ID.lro de ssidio en agua des.!!!ada.
La diferencia se presenta en el hidrato de carbono terminal de la cadena, que I \;"-"'"
.. . - Suspensi6n de glòbulos rojo§_}._, B y O al 025%, en soluciòn fisiològigl:
es el que cantiere la especificidad A, B o H. gl61:1_ulos rojos_ QrOViJ!'ientes_dEtsangre fresca heparinizadii;'se lavan 3 veces con
La acetilgalactosamina otorga la especificidad A, la galactosa, la espec1f1c1dad soluciòn fisiologica. Luego de cada lavado se centrifuga a 1500-1 BOOrpmèiurante
li""' o
B y la fucosa, la especificidad H (Fig. N° 18). ~ \lon-1 r
2' minufos; se deseéhae1soorenacfante. Finalm ente se suspenden lo glòb'=!)o§ ~oi 1\ '' •
1
rojOS-lavado s en soluciòn fisiol9.~. ~l)na cons;entraciòn del 0,25% .
FIGURA N° 18 ~ amara hùmeda: caja de plastico transparente que contiene un papel de filtro
__b_u~ edecido~ on agua,- que puede colocarse en_el fondo o en la contratapa de
~oob ~orob
òor~or~b ù -o°"q I~ m isl]1_a.
- Portaot;ij~tos
o
so s1 o
- Cubreobjetos
'""'°"
'""'°" 7 - °" - - Microscoglo.
~~
°" °" °"
Técnica
Se colocan unas escamitas delgadas de sangre en los limites opuestos de un
portaobjetos y se marca con un trazo de làpiz de color, el lado izquierdo del mismo.
Especificidad "A" Sobre las escamas ubicadas en esa posiciòn, se investigarà la presencia de
Especificidad "B " Especificldad "H"
aglutininas alfa (anti A), agregando para ello una gota de suspensiòn de glòbulos
rojos A al 0,25%.
Sobre el lado derecho, con el objeto de investigar aglutininas beta lanti B), se
Una contaminaci6n bacteriana que por acci6n enzimatica altere el hidrato de agregara una gota de suspensiòn de glòbulos roios B al 0,25%.
carbono terminal de estas sustancias, puede traer corno consecuencia, resultados Se caloca luego un cubreobjetos sobre cada una de dichas preparaciones,
err6neos, dado que entre los tres antigenos existe una diferencia estructural tratando de evitar la formacìòn de burbuias de aire que puedan dificultar el con-
pequeiia. tacto entre la escama y la suspensiòn de glòbulos.
En el centro de un segundo portaobietos, se ubican otras costritas de sangre
lnvestigaclon de aglutlnlnas (anticuerpos anti A y anti B), en manchas secas y sobre ellas se adiciona una gota de suspensiòn de glòbulos O. Se caloca un
de sangre cobreobietos.
Se deian las preparaciones en càmara hùmeda. Despuès de unos minutos, se
Existen dos técnicas que pueden ser empleadas para examinar en una mancha
examinan baio un microscopio (100 x).
de sangre la presenci~ e i.!Q,!ytinin~ alf13 y beta, o sea anticuE_,lr pos anti Ay antiB.
Si hay aglutininas presentes, éstas difundiràn al medio y aglutinaràn los glòbulos
Si se cuenta con una castra delgada de sangre. es recomendable utilizar la
técnica de Lattes. rojos ~gr~ gados que contengan el ant,genC?_ correspond,ente (~t, ~ ~g_lqtin~ry'.l.
gl~~ulos rojos A y anti B, glòbulos roios B),_
226
227
 \ . \I. T1 v ·•
\ ...,.l._ .J•· > <.
'· .,., ' u__,() '\~ t~ l ;t, \ eoct'\ .JJ 0. (-)\71" ~ '. (ì (.,.:.,0 CT\ ,O , \c..,e; f • ~,,. . .......
V<..t \ \ )',o 0.1t.,~~ (.I\
1
\ r) \.,~ ~ 'So
~
~ :,_,.,, ,r, \
r _()I
e,:., l os con esta técn,ca C5 similar
a la eleC \uaa
--;\:<:>
O. ~ \ 'f.lP o\ \'~"'\l C\-c.GQ ~ \.., I '
La interpretaci6n de resultad """ '"
stigaci6n de aglutininas, se
'it 0 -
obtenerse en la in el método de la costra.
Los resultados que pueden man cha s secas de san -
observan en el cuadro N° 2. gen os del sistema ABO en
/nvesllgacl6n de ag/u tln6
B (aglutininas
CUADRO N° 2 gre aci6 n de anticuerpos anti A Y anti
Una vez finalizada la investig rminaciòn de aglu-
sangre, debe encararse la dete
Glòb ulos rojo s agre gad os alfa y beta) en una mancha de .
tin6genos A y B enalamuc misma. gre fresca, donde d1spo-
o A B lnterpretaci6n Esta es una tare ho mas compleja que en san facilmente el grupo
A y anti B, puede encontrarse
niendo de los antisueros anti
ABO de la muestra . as, los gl6bulos se
Negativo Neg ativo Neg ativo Gru poA B las veces, en manchas sec
(proviso rio) Dado que en la mayoria de de aglutinaci6n ,_debe
habran deteriorado _ ruid o, erdiei::i<!Q...l<!_Cé!pacidad
genos.
ara la busqueda de tos anti
Negativo Aglu tina ci6n Neg ativo Grupo B (6 Ocon recurrirse pruebas indirectas os g 6bulos, los aglutinogenos
A y B retienen
13 deteriorada) mo sta a-a terac1oi n:fe acid ad de absorber o fijar los corr
espond ientes
durante mucho tiempo, su cap
Neg ativ o Negativo Aglu tina ci6n Gru poA (60c on anticuerpos anti A y anti B. lean para la investigaci6n de los nombrados aglu tin6-
a deteriorada) Los métodos que se emp mas antiguo y, el mas
orci6n-inhibici6n ~ue es el
ge~os, son: el método de abs ~
Gru po O(absoluto) i6n . - · tidad de muestra.
Negativo Aglu tina ciòn Aglu tina ci6n recIente: de absorci6n-éluè s1bi lidad, requiriendo menor can
Este ultimo es de mayor sen gre, para Investigar
de tongitud, manchacf6con san
Basta un trozo de hilo de 5 mm
ltad ç_posilivo_con los os.
le con gl6bulos O. Un resu cada uno de los aglutin6gen
_La agl ~tin_a ci6,n es imposib
lugfil'__ulla..Le_ac.ci.60.no espedf
ica.
m,s~ os, 1nd1c~ra gue tuv o , las observaciones ibicl6n
positivos a los poc os minutos Método de absorci6n-inh tin6gen o~n ~n ~h as
S1 n? se obt,~nen resultados a evitar pasar por alto para la investigaci6n de aglu
po, durante 30 minutos, par Este método , que se emplea detectar los anti genos
se rep,ten de t1empo en tiem carse en forma similar para
aglu tina cion es débiles. secas de sangre , puede apli nos resultados en
nta que mientras se examin
an las preparaciones al s biol6gicas. Se obtienen bue
_Es imp orta nte ten er en cue en estudio, en otras mancha , de individuos secre-
débil presi6n, con una illas de cigarrillos), sudar, etc.
tos deben someterse a una manchas de semen, saliva (col ')O~ .d ~
m1c~oscop1?, lo~ _cubreobje s formaciones de pseudo rf\l\C f'J rl1" <,c- , .6fl <:.()
hac er desaparecer posible tores. cha de sangre y luego
aguJa de d1secc1on, par a ocid cr;, se agrega a una man
agl utin aci6 n. Si un antisuero de ~ lo con observar si su titulo
titula nuevamente , podremos
de un tiempo determinaa o se
Método extractivo a tubo. dìs minuy6 o se mantuvo. encia en la mancha
mancha se encuen- iòn del titulo indicara la pres
de costras de sangre. Si la En el primer caso, I(! disminuc inuyò netamente,
Se apl ica cua·n do no se disp one sangre se extrae colocando unas gotas de - de sangre del aglutinògeno resp
ectivo. Si el titulo del anti A dism
dera, la . Analogamente, si
tra, por eje mp lo, sob re ma sangre se diso fvera en unos c1e1-·antigeno A en la muestra
la mIsma . Norma lmente la se com robara la ex1stenc1a ,geno B.
sol uci 6n fisio log ica sob re se encuen ra presen e e an
nte se recoge con una pipe
ta. disminuy ò el titulo de ant1 8, ten en la mancha
min uto s. La solu ci6n res ulta ozo y se caloca en antisueros se mantuvo, no ex1s
sob re un tejid o, se cor ta u~ Si por otra parte el titulod e los
Si la ma nch a se enc uen tra fisiol6gi ca y se ayu da a los antigenos respectivos (ni
An i B).
ega n una s got as de soluci6n s en la determinaciòn de aglu
tinògenos del sistema
un tub o de ens ayo . Se agr Holzer tue uno de los pionero s y, posteriormente.
varilla de vidr io. ha sido utilizada durante ano
la d1soluc1on, util izan do una una cen trifugaci6n ABO en manchas. Su técnica
cas os se som ete luego a
7:1 ext rac to o bte nid o en dic hos ara en tres peq uei ios tub os
de ensayo. Al primer perfeccionada por diversos
autores.
aproximadamente
breve. El sob ren ada nte se sep os A y B puede efectuarse
sus pen si6n de gl6 bul os A;
al segl!r:!_do, una de gl6bulos La investigaciòn de aglutinògen sobre tela o diversos
tub o se agr ega una got a de de una mancha de sangre
en dos horas, si se dispone sangre tresca.
got a e gl6 bul os rojo s O. ente a una pequena gota de
ro1osJl y; afterce ro,' una utos, aproximada- objetos, en cantidad equival
dera por esp acio de 1O min
Se col oca n los tub os en la hela ant e 2 min uto s.
gan a 100 0- 1500 rpm dur
me nte . Lue go se cen trifu s sedime ~ta.9os, se Parte experirnental
nte y sob re l~ gl6 bu~ s rojo
Se extrae el ligu ido sob ren ada Lalllii llN [Qs_Jub.os_y se Reactivos y materia/es
fisio l6gl ça~ e~ gita nJ i9.§
a~ r~ una 99t a de sol ucL6n . . . - Ant isueros anti A y anti B.
observa sì hay agl utin acig n.
_ p/v de cloruro de sodio). 229 \ Ù -.UJ
ativa. En cambio, sI los - Soluciòn fisiologica (0,85%
usp end en, la pru eba es neg Q.J>.' .•
Sflos gl6bul os rojo s se res
, la pru eba es pos itiva . <tt·,
glC:_bulos_~ han agl utin ado
228
 . .--~ -
r- ANTl C,--,
1
C' '- Pf,.,'Tl: :: • \i.,_JJAì-', ;\ A • \.\_lt\V T"fW,
t- JI\
vidades cada una). diseccién para asegurar un buen
_ Dos policubetas de Kline (con doce conca f) Se trizan los géneros con las agujas de
_ Agujas de disecci6n para trizar el materiai. contacto fibra-antisuero. (Se hace en ambas placas
, cambiando siempre las
ientes
_ Suspensi6n de gl.9bul~ jo_sA Y B al _1,5% en soluci6n fisiologica, proven agujas y empezando por la tela bianco).
fisiolo gica.fr~a_hep~m
d~ ! !gre mzada N previamente lavados (tres veces), con
soluci6n
.
.)
g) Se colocan las placas en la camara humed
temperatura ambiente.
a y se mantienen una hora a
M icropipetas. al antisuero resultante del contacto
). h) Una vez transcurrido ese tiempo, se retitula
- Camara humeda (ya descrita previamente tela-antisuero, procediendo asi:
aumento). cada una de las diez conca-
- Lupa binoc ular o micro scopi o (con bajo Se agrega una gota de solucién fisiolégica en
vidades restantes de cada policubeta. que estuvo en contacto con
Técnica Se torna una gota de la soluciòn de antisuero
ha. Se mezcla por succiòn
etro cuadrado de la tela manchada a investigar
y se divide la muestra y se agrega a la concavidad de la derec
a) Se corta un centim
en dos porcio nes iguales. y descarga cuatro o cinco veces .
a la concavidad de la derecha;
2 no manchada de la tela, para usar Se torna una gota de esta mezcla y se agrega
b) Se corta un trozo de 1 cm de la zona antes. se mezcla, se torna una gota de esta ultima
y se agrega a la concavidad
corno bianc o y se divide en dos trozos corno adelante hasta la sexta conca-
o en la placa de Kline, segun la siguiente, procediendo de la misma forma en
c) Se coloc a cada trozo de muestra y bianc (Fig. N° 19). vidad (diluci6n 1/32). Se descarta una gota de
la ultima concavidad .
dispo sici6n que se detalla en el esquema y se repite el proceso anterior
Se lava la micropipeta con soluciòn fisiològica
blanco-antisuero .
FIGURA N° 19 con el antisuero resultante del contacto de tela
"B".
Se procede de igual forma con la policubeta
nsiòn de glòbulos rojos A al 1,5% .
MUES TRA i) Se agrega a la placa "A" una gota de suspe
MUESTRA en este caso glòbulos B. La
Se hace lo mismo con la placa "B", utilizando
oo·
concavidades, con excepcién
suspensiòn de glòbulos se agrega a todas las
OOA de las que contienen tela.
j) Se colocan las policubetas en càmara hume
biente durante 30 minutos, previa agitaciòn
1O minutos, si se ha producido aglutinaciòn.

da y se dejan a témperatura am-

1 a 2 minutos, observando cada
k) La ausencia de aglutinaciòn en el caso
de la muestra o una disminuciòn en
000 000
lugares con respecto al bianco,
el titulo del antisuero de por lo menos tres
del aglutinògeno correspondiente.
indicarà la presencia en la mancha problema
nte lupa binocular o micro sco-
La observaciòn de la aglutinaciòn se harà media
it© o o 0 0
pio de bajo aumento.
de significado.
o Las diferencias de tan sòlo un lugar carecen
()
z
:5
CII Observaciones
limpio y seco; si es posible, este-
El materiai a usar debe estar pertectamente
000 000
rilizado.
os con la cantid ad exact a de
Las manchas y los blancos deben ser tratad
se observara dismi nuciò n del titulo
diluciòn de antisuero; pues si es mucho, no
puede recuperar de la tela hurne da
por exceso de antisuero y, si es poco, no se
la cantidad necesaria.
és de la absor ciòn, se debe tener
Al hacer la diluciòn del antisuero, despu
s al comie nzo se rnagnifican al final.
dermografico, para saber especial cui dado, dado que peque flos errore
Las policu betas se marcan "A" y "B", con lapiz El méto do debe tener conco rdanc ia con el
de aglutininas, que se supon e ya
y el bianco, en ambas placas.
con qué antisueros se debe tratar cada muestra realizado, corno para poder dar un resultado
con intach able valor real.
al agitar, es conveniente haber
Para evitar mezclas entre las excavaciones
!as mismas.
pasad o un pincel con parafina fundid a entre
los antisueros A y 8 de titulo 11~2_,_ ~
d) Se preparan soluciones de traba jo de Método de absorci6n-e/uci6n
diluyendo convenientemente el antisu ero origin
ai. di"s!l"' ancha s secas de sangr~. en el
Se utiliza ampli amen te para la tipific aciòn
prepa rado anteriormente sobre cada ------- -----~
e) Se colocan dos gotas de antisuero A, sistem a ABO, MN y Rh .
beta "A". Lo mism o se hace en la los agluti nògen os del sistem a ABO.
trozo de tela (muestra y bianco) en la policu Se aplica ra en prime r lugar, para inves tigar
policu beta marc ada "B", con el antisu ero
B. 23,
230
1·
de absorci6n-eluci6n es altam
_s~El _antiodo
as mét gua s.
Por esta técn ica, pequerìas
ueros especificos (anti A, anti
Pon~n en con tact o con antis
se forme el complejo antigeno-
un t1empo sufic ient e para que
En una seg und a etap a, el mat
inar todo s los anticuerpos no
solu ci6n fisio16gica, para elim
Lue go se realiza la diso ciac iòn
miny tos. En este proceso, cono
mie nto a 50° C dura nte 15
se rom e el com ie·o form ado
Por ultim o, se agregan glòb ulos
de anti A, se aglutinaran los glòb
s B o g lobu los rojos O si se eluy
te. ulos roJo
los gl6b
men
os anti cue rpos se_eluy ~mn
~
tian orig inalm ente en la man
cha
Tod os los anti cue rpos no fijad
etap a de lava do.
El.esq uem a que se obs erva en
ci6n
ETAPA I
anticuer-
Tratamiento con el anlisuero . Los
pos se unen al antigene espe
cifico.
ETA PA lii
uniòn anti-
Por calentamiento se rom pe la
anti-
geno--anticuerpo quedando libres los
cuer pos.
232
_n man i ~ ) Parte experimental
ente sensible y confiable aun _e
Reactivos y materia/es rminaciòn aei
almente empleados para la dete
- Sueros anti A y anti B: Norm s de su emp\eo.
muestras del materiai manchad
o con sangre, se re fresca, deben t1tularse ante
B Y1.,_é_ ÌnlÌH )-;cl urante grupo sanguineo ABO en sang
anticuerpo. Titulo requerido: 1/32 . .
..
amente con - Anti H - Preparaci6n del mismo:
illas de Ulex europeus (adqu1nd
as en determ1-
eriai manchado se lava cuidados la mancha. a) se muelen 10 gramos de sem
fijados a ·
nillo.
)o par .caleota- nados comercios), en un moli ciòn fisiologica Y se deja a 4° C durante 3
del complejo antigeno-antjcuA[J b) Se mezclan con 100 ml de
solu
cido corno e1uçj6n, .
inicialmente se liberan los antic
uer os. 6 4 dias. inar las part,culas
s de un filtro de tela para ~lim
produjo eluciòn c) Se pasa el extracto a travé
rojos de grup o cono cido . Si se (1500 rpm durante 5 m1nutos) .
era, se aglutinaran gruesas y luego se centrifuga de agua a 60°
ulos rojo s A De la misma man la por calentamiento en ban o
eron.Jfilt LB_Qa ntl H,J espect1v
a- d) Se torna el sobrante y se flocu dura nte 1O
ia y se centrifuga a 2.00 0 rpm
C durante 30 minutos se enfr
QS..aotJgeno· ~xis- ciòn limp ida.
._ es eviden~ que IOSJeSp_e.çtjy minutos. Debe quedar una solu obtenerse una
con glòbulos A, 8 y O. Deb e
e) Se ensaya el sobrenadante con glòb ulos
A y B y fuertemente posi tiva
os por la muestra se habran
eliminado en la reacciòn negativa con gl6bulos utilizarlo en la
prueba el titulo. Para pod er
rojos O. Con estos ultimos se men os 1/32 .
de absorci6n-elu- se requiere un titul o de por lo
la figura N° 20, aclara la técnica tipificaciòn de manchas secas,
Usualmente es posible obtener
titul os de 1/64 6 1/128.
y O.
- Manchas contrai A y B, AB
FIGURA N° 20 . - Soluci6n fisiologica. ci6n fisiologica.
una soluciòn al 0,3% , en solu
- Albumina bovina: preparar y O provenientes de
A, 8 y O: glòbulos rojos A, 8
ETAPA Il - Glòbulos rojos indicadores fisiologica. Se
lavan tres veces con solu ciòn
sangre fresca heparinizada; se do palid o (apro-
'.:,_~~~<'~ preparan, a partir de los mism
ximadamente 0,1%), en albumina
os, suspensiones de colo r rosa
bovina al 0,3% en solu ciòn fisio
logica.
losa en la can tida d
,'),< -~ losa : de disuelve acetato de celu
- Adhesivo de acetato de celu ad ade cua-
obtener una soluciòn de visc osid
necesaria de acetona, corno para obid a por el hilo
:- te viscosa corno para no ser abs
da. Debe ser lo suficientemen ulta des en la
~ ~ ·:1~· te tluida corno para evita r dific
., de muestra y lo/ suficientemen
.
manipulaciòn. 15 cm y de 1 mm
hojas plasticas de 10 cm x
- Hojas de policarbonato : son
El exceso de anticuerpos se remu
eve por aproximadamente de espesor.
lavado. - Papel de filtro.
a.
- Micropipetas con tetina de gom
ETA PAIV - Agitador.
19 cm (ya descripta).
- Camara humeda de 12 cmx
~
- Estufa a 50° C.
- Micr osco pio.
J
Técnicas plo, un
e superficies absorbentes (par ejem
Técnica a ap/icar para manchas sobr
tejido). rados de apro-
+ glòbulos en la hoja de polic arbo nato cuad
rojos conocidos a) Con lapiz de colo r se niar can a en la Fig . N° 21.
Se rotu la la hoja corno se indic
xirnadarnente 1,5 cm de lado. distancia entre
chada, 2 cortes paralelos a una
los anti- b) Se prac tican en la zona rnan tornar los hilos
Se produce aglutinaciòn cuando sversal entre los primeros para
ulos rojos si de 5 a 8 mm , y un cort e tran
genos presentes en los glòb
los existen- que se usaràn corn o rnuestra
lM).
agregados son los mismos que 233
tes en la mancha.
 FIGURA N° 21
un agitador a baja velocid ad, a
ANTI i) Se retira la camara de la estufa y se agita en
ANTI ANTI durant e el cual tendra lugar
A ANTI temperatura ambiente, durante 30 minutos tiempo
B H ANTI ANTI '
A la aglutinaci6n.
B copio .
i) Se observa si se produjo aglutinaciòn empleando el micros
M1 .,, .,, .,, CONTROL
A

H
Técnica para manchas sobre superficie no absorb
ente.
s, .,, CONTROL
✓ ✓
• a) Se corta un trozo de hilo de 1 a 1,5 cm de
bianca y limpia y se humedece con agua destila
largo, de una tela de algodòn
da.
✓
• B
✓ ✓ ✓
b) Se torna el hilo con una pinza y se pasa sobre
la manch a de sangre para su
• .,, •
absorciòn.
pròxim a a la mancha, utilizando
M2 CONTROL c) Se torna un contrai de la zona no manchada
AB
• • ✓
un trozo de hilo de longitu d similar.
d) Se colocan los hilos en tubos rotulados o
cajas de Petri abiertas y se dejan
en estufa a 50° C, por lo menos durante 30 minuto
s.
B2 .- • CONTROL
e) Se retiran de la estufa y se fijan sobre la hoja
de policarbona to. Se proced e
l ✓ o
• • • corno en el caso de una manch a sobre un tejido.
Controles a realizar en cada determ inaci6 n
a, para utilizar corno bianco (B).
~o m ismo se efectu a en la tela sin manchsimilar de los antisueros empleados.
. Es adecuado verificar el buen compo rtamie nto
?n
los contro les se proce de de maner a
Se recomienda ensayar los sueros anti A, anti
B y la lectina anti H, utilizando
ente desplazado hacia el angulo
c) ~asi_en_ el c_e ntro de cada cuadra do, ligeram sangre conoc ida A, B, AB y O.
l. ~ ,(lo,
ivo acetat o de celulosa. hoja de polica rbona to donde
infeno r_izquie rdo, se caloca una gota del adhes Estos contro les puede n realizarse en la misma
de hilo (bianco o muestra) y se la figura N° 21. Si la cantid ad de
. Media nte una pinza se toman los trozos se proces an las muestras, corno se indica en
adhesivo, en el cuadra do corres- contro les otra hoja de.po licarbo -
insert an por un extrem o, dentro de la gota de muestras es elevada, puede utilizarse para los
pond1 ente de la hoja de polica rbona to.
nato, proces ando las dos hojas simultaneamente.
·La longi~ud 6ptim a del hilo emerg ente debe ser entre
2 y 5 mm, tanto mayor i se muest ran en la ligura N° 22.
Los resulta do correctos de las rnuestras contra
ente manch ado.
cuant o mas delga do es el hilo o esté mas débilm
ivo se endurezca ('10-15 minutos).
d) Se deja la hoja al aire hasta que el adhes
iado, sobre el hilo, aseguran-
Luego se adicio na una gota del antisu ero aprop
dose que éste quede sumer gido. FIGURA N° 22
cada hilito una gota de suero
En la colum na rotula da anti A, se agreg a sobre
no A; en la colum na anti B, una
anti A para invest igar la presen cia del antige
no B y en la colum na anti H, ANTIH
gota de suero anti 8, para invest igar el antige MUESTRA ANTIA ANTIB
•.....,·
antige no H. (O)
una gota del anti H para la invest igaci6 n del (A) (B)
e) Se caloca la hoja plastic a en la camar a hùmed
a y se deja a 4° C, por lo menos
. .. ... .
duran te tres horas. Si es posibl e, es prefer
antisu eros duran te loda la noche .
ible dejar en contac to con los
A
::::. ~
~-:.•;·
.·....
.·....·...,........
piseta, con soluciòn fisiologica
f) Se lava la hoja cuidad osame nte media nte una
a 4° C, para elimin ar el exced ente del antisu
ero agreg ado.
.... . ...
.··:.
Se seca la hoja con papel de filtro y luego se sumerge en
t..na cuba plastic a
...·.....:....
-·:
... .. .....••
-···
.......
.-.
8
que contie ne soluci òn fisiolo gica a 4° C,
duran te 30 minuto s. Se agita la • Il I •
.•
soluci 6n duran te este lapso.
gica, se seca con papel de filtro ;, ·•- .......
....... .
g) Se retira la hoja de la cuba con soluci òn fisiolo
,· .
••••
~I
y se caloca nueva mente en la camar a hùme da. AB
..
••!
...,
nsi6n de g!6bul os .
Se agreg a sobre cada trozo de hilo una gota de la suspe A; glòbulos rojos
os con anti
..
.: ...
rojos aprop iados: glooul os A11 a los hilos tratad
...... •·
aquell os tratad os con anti H.
Ba los tratad os con anti By gl6bu los rojos Oa .... .·. . ..
•••
h) tapa la camar a hùme da y se caloca en una
Se estufa a 50° C duran te 15 o .·: ...•.· .
n del anticu erpo, si éste tue t; I I
minuto s. En este period o se produ ~e la eluciò
I
previamente fijado.
234
~ )