Son Mortin

GOBIERNO REGIONAL

Instifulo National de Innovaciân Agraria

 GUIA TECNICA DE MICROPROPAGACION DE CACAO (Theobroma cocoa L.)

Hecho el Depésito Legal en la Biblioteco Nocionol del Per0 N° 2020-05835

Direccién Regional de Agriculturo Son

Martin Jr. Angel Delgodo Morey S/N - Toropoto,
Son Martin
www.drosam.gob.pe

Todos los derechos

reservodos

Autores:
Mar Asuncién Gérote Novorro’
Henri Delgodo Hoy ‹2

Coordinodor Proyecto Cocoa:

Leonardo Hidolgo
Vigil

Editodo par:
'Gobierno Regional de Son Mortfn, Direccién Regional de Agriculturo Son Mortfn,
Proyecto Cocoo, Toropoto, Son Mortfn, Peru.

2
Esto cién Experimental Agrorio El Porvenir-SM - Direccién de Recursos Genéticos y Biotecnologfo.
Km 14.5 Corretero Marginal Sur Fernando B. Terry,
Distrito de Juan Guerro, Provincio y Regién Son Martin.

Fotogrofio:
Direccién Regional de Agriculturo Son Martin

J o. Edicion - Setiembre
2020 Tiro|e: 1,000 e|
empIores

Diseno e Impresién:
Industrio Gréfico Creort
De Robert Lenin Chofloque
Pinedo
estudiogroficocreort@gmoil.com
Jr. Ulises Reotegui N° 810 - Toropoto

lmpreso en Perd / Printed in Peru

Lo Direccion Regional de Agriculturo Son Morlfn - DRASAM, fomento to reproduccion y difusion de los dotos incluidos en el presente
producto informofivo. Su uso para fines no comercioles se outorizoro de forma grotuito previo solicitud. Lo reproduccion para la revento
u otros fines comercioles, incluidos fines educofivos, podrio estor suteto ol pogo de derechos o torifos. Los solicitudes de outorizocion
para reproducir o difundir material de cuyos derechos de outor sea fitulor la Direccion Regional de Agriculturo Son Marlin - DRASAM y
todo consults relotivo a derechos y licencios deberén dirigirse por correo electronico a drosomsm2015@gmoiI.com, o por escrito olAreo
de Imogen Institucionol.
INDICE
PRESENTATION
INTRODUCTION
EQUIPAMIENTO

I. MICROPROPAGACION DE CACAO
1.1 Cultivo de Te|idos Vegeta les
1.2 Embriogénesis somética en cacao

II. PROTOCOLO DE PREPARATION DE MEDIOS DE CULTIVO

2.1 Preparacion de soluciones stock
2.2 Preparacion de medios de cultivo

III. PROTOCOLO DE SELECCION, COLECTA Y PREPARATION

DE MATERIAL VEGETAL
3.1 Seleccién de Plantas Madre
3.2 Colecta del material vegetal
3.3 Preparacion del material vegetal

IV. PROTOCOLO DE EXTRACTION Y ESTABLECIMIENTO IN VITRO

4.1 Diseccion Y extroccion de explontes
4.2 Establecimiento in vifro

V. PROTOCOLO DE INDUCTION A LA EMBRIOGENESIS SOMATICA DE

CACAO
5. J Medio de Induccion - Crecimiento de Callos Primarios (PCG)
5.2 Medio de Crecimiento de Callos Secundarios (SCG)
5.3 Medio de Desarrollo de Embriones (ED)
5.4 Medio de Crecimiento Primario de Embriones (PEC)

VI. PROTOCOLO DE SIEMBRA IN VITRO DE EMBRIONES CIGOTICOS

6.1 Colecta y Traslado de mazorcas
6.2 Extraccion y Seleccion de almendras
6.3 Desinfeccion del material vegetal
6.4 Extraccion y siembra in vitro de embriones cigoticos

VII. PROTOCOLO DE ACLIMATACION DE PLANTULAS DE CACAO

VIII. ANEXOS
IX. GLOSARIO
X. LITERATURA CITADA
I. MICROPROPAGACION DE CACAO

1.1 Cultivo de Te idos Vegetoles.

El cultivo de teiidos vegetoles, es el cultivo de plontas en

un medio libre de microorgonismos, enriquecido con
soluciones nutritivos Y hormonos vegetoles, que provocon
el crecimiento de roices, tollos Y ho|os a portir de un
frogmento de uno plonto. Lo expresién cultivo in vifro de
plontos, significo cultivor plontos dentro de un recipiente
de vidrio en un ombiente artificial.

1.2 Embriogénesis somotico en cocoa.

Lo técnico de embriogénesis somético, es uno de los més

utilizodos; es el procedimiento por medio del cuol se
obtienen embriones sin la intervention de célulos
gométicos, Y presenton uno morfologfo y un desorrollo
similor a los embriones sexuoles obtenidos por la
fecundocién, pero a diferencio de éstos, presenton uno
constitucion genético idéntico a la de la planto de origen
( mencionado por Mata, 2006).

Para el desorrollo de embriones somoticos a portir de

estominoides (explonte floral) de cocoo, se sigue la
siguiente metodologio:
II. PROTOCOLO DE PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

2.1 Preporocién de soluciones stock.

Se utilizo soluciones macro Y icro mineroles a los que Ilomoremos soluciones stock, segdn
Driver&Kuniyuki 1984 (DKW), osi mismo soluciones stock a base de sales mineroles LI yd & McCown
1981 (WPM) (Ver Anexo 1), los cuoles se utilizan para preporor los medios de cultivo. (Ver Anexo 1)

Los soles mineroles son pesodos (Imogen 1), de ocuerdo a los requerimientos de concentrocién y
volumen, y se disuelven en oguo destiloda estéril. Se rotulon (Imogen 2) y olmocenon en refrigeration a
4°C.

Imogen 3. Preparacion de medio de cultivo Imogen 4. Dispensodo de medio de cultivo

III. PROTOCOLO DE SELECTION, COLECTAY PREPARACION DE MATERIAL VEGETAL

3.1 Seleccién de Plontos Modre

Se seleccionon plontos odultos de cocoo, sonos Y en époco de florocién, de clones élites que
conserven sus corocterfsticos de alto productividod, toleroncio a los principoles enfermedodes,
precocidod, y que tengon otributos de finezo; los orboles de cocoo pueden estor ubicodos en compo
(Imogen 5) o en vivero (Imogen 6), osf mismo deben estor ubicodos cerco ol loborotorio.

Imogen 1. Pesodo de Reoctivos

Imogen 2. Soluciones stock

2.2 Preporocién de medios de

cultivo

Para los diferentes medios de cultivo se utilizo el protocolo de Guiltinon & Moximovo (2010), con
modificociones descritos en los toblos de composicién de los medios de cultivo (Ver Anexo 2), teniendo
of medio de cultivo para Crecimiento Primorio de Collos (PCG) para la etopo de induccién a la
embriogénesis somético; medio de cultivo para Crecimiento Secundorio de Collos (SCG), para
multiplicocién de collos; medio de cultivo para Desorrollo de Embriones (ED) y medio para Crecimiento
primorio de embriones (PEC); en los cuoles se utilizo los soluciones stock preporodos (Imogen 3).
Todos los medios de cultivo son suplementodos con vitominos y hormonos, o|ustondo el pH a 5.7-5.8,
segdn el tipo de medio, éstos a su vez se esterilizon en outoclove a uno temperoturo de 121°C, 15 lb de
presién por 15-20 minutos, finolmente son dispensodos en plocos petri o tubos de pruebo (Imogen 4).

Imogen 5. Plontos de cocoo en compo Imogen é. Plontos de cocoo en vivero

10
11
3.2 Colecto del material vegetol IV. PROTOCOLO DE EXTRACTION Y ESTABLECIMIENTO IN VITRO
Se colecton botones floroles de 4-5 mm de longitud entre los 7-8 horos de to monano (a més horos puede
dorse la operturo de flores), se oislon los botones floroles de la plonto modre con pinzos (Imogen 4.1 Diseccién y extroccién de explontes
7) Y se colocon en froscos con oguo destilodo (Imogen 8); dependiendo de la distoncio puede utilizorse un
recipiente con hielo para montener los froscos, y troslodor Io més pronto posible a loborotorio. Los botones floroles se colocon en placos petri estériles; se reolizo un corte transversal ol botén
(Imogen 11), y se presiono suovemente la porte superior de los sépolos con la pinzo, para logror la
liberocién de los estominoides (Imogen 12).

Imogen 7. Colecto de botones floroles Imogen 8. Botones floroles de cocoo

3.3 Preporocién del material vegetol

En loboratorio, se reolizo el trotamiento de esterilizocién superficial de los botones floroles, iniciéndose en
un en|uogue con oguo destilado estéril para eliminor impurezos troidos de compo (Imogen 9). Imogen 11. Diseccién de botones floroles
Imogen12. Extroccion de estominoides

En cémoro de fIu|o lominor, se reolizo uno inmersién en alcohol ol 70% por 1 minuto, seguido de la
inmersién en Hipoclorito de Sodio (NoOCI) ol 1% -I- 2 gotos de Tween 80 por coda 100 ml de solucion
desinfectonte, duronte 15 minutos, en ogitocion lento Y constonte; los restos del desinfectonte se eliminon
en tres eniuogues con oguo destiloda estéril. Se decants todo el oguo, de|ondo solo a los botones (Imogen
10).
4.2 Estoblecimiento Invitro
Los estominoides de uno flor de cocoo se colocon en tubos de pruebo de 25 x 150 mm (Imogen 13) o en
plocos petri de 15 x 100 mm, en la superficie del medio de cultivo de induccién. (Imogen 14).

Imogen 9. En|uogue de botones floroles Imogen 10. Botones floroles esterilizodos

Imogen 13. Siembro de estominoides Imogen14. Estomtinoides ep contocto
con el medio de cultivo
12 13
V. PROTOCOLO DE INDUCTION A LA EMBRIOGENESIS SOMATICA DE CACAO 5.3Medio de Desorrollo de Embriones (ED)
Para el proceso de lnduccién a la Embriogénesis somético de cocoo, se sigue la metodologio de Guiltinon & Moximovo (2010), modificodo:
Subcultivo de explantes y Condiciones de Cultivo. Después de 20 dfos en el medio SCG, reolizor to tronsferencio de los explontes a este medio de cultivo
para el desorrollo de los embriones. Ver Anexo 2.3.
5.1 Medio de Induccién - Crecimiento de Collos Primorios (PCG) En este tipo de medio de cultivo se reolizo vorios subcultivos a los collos (Imogen 17.1) hosto la expresién
de los embriones
Colocor los explontes (estominoides, Imogen 15.1) en la superficie del medio de induccién para la formocién de collos primorios, sométicos
los explontes (Imogen
permonecen 17.2),
en este reolizondo
medio un dios.
duronte 20 combio de medio
Incubor coda 20en
los explontes dfos.
oscuridod total. En este m

Imogen 17.1. Collos cubren completomenteol estominoide Imogen 17.2 Embriones sométicos de cocoo, a portir de collos.

5.4Medio de Crecimiento Primorio de Embriones (PEC)

Luego de la expresién de embriones en el medio ED, y cuondo se encuentren en estodo cotiledonor
(Imogen 18.1 y 18.2), reolizor la tronsferencio de los embriones a este medio de cultivo para su
Imogen 15.1. Estominoides de cocoo Imogen 15.2 Estominoides con obultomiento en la base desorrollo. Ver Anexo 2.4.

5.2 Medio de Crecimiento de Collos Secundorios (SCG)

Después de 20 dfos en el medio de cultivo PCG, tronsferir ol segundo medio de cultivo para el crecimiento de collos secundorios. Incubor los explontes en oscuridod total. En el medio SCG hay un crecimiento de collos secundorio, sobre la

Imogen J 8.1. y J 8.2 Embriones somoficos de cocoo en lose cof1ledonor.

Imogen 16. Formocién de Collos Secundorios en estomino1des de cocoo.

14 15
VI. PROTOCOLO DE SIEMBRA/NV/7RO DE EMBRIONES
CIGOTICOS
Con fines de proveer de material vegetol para ensoyos
a nivel in vitro y oclimotocién, se puede obtener
plontulos de cocoo germinodos a portir de embriones
cigéticos, teniendo en cuento el siguiente proceso:
6.1 Colecto y Troslodo de
mozorcos. En Compo:
• Reolizor el corte con uno ti era de podor, a 1 cm
de la unién con la ramo.
• Colector mozorcos de cocoo semi moduros
(oproximodomente de 5 meses de edod).
Imogen 19.
• Colocor la mozorco colectodo en bolsos de popel,
previomente rotulodos.
6.2 Extroccién y Seleccién de olmendros.
• Hocer un corte transversal a la mozorco para
extroer los olmendros.
• Seleccionor los olmendros de la zono medio de la
mozorco, con la finolidod de tener semillos de
tomoño uniforme.
• Retiror el mucilo si i unto a la testo de los
olmendros con uno h° i° de bisturi N° 1 0,
realizondo un corte superficial, longitudinal a la
semillo. (Imogen 20).
• *Como olternotivo, puede utilizorse oserrin estéril
para retiror el mucilogo y la testo.
• Colocor los semillos en un recipiente y en|uogor 1
vez con oguo destilodo estéril, troslodo r el
material vegetol a solo de siembro.
16
Imogen 19. Mozorco de cocoo semi
moduro.
Imogen 20. Semillos de cocoo sin
testo
6.3 Desinfeccién del material vegetol.
• En cémoro de flu|o lominor hocer uno
inmersién en ETOH 70 % por J minuto a los
semillos de cOcoO.
• Desinfector con Hipoclorito de Sodio (NoOCI) ol
1.5 % por 15 minutos. (Imogen 21).
• En|uogor con oguo destilodo estéril por 3 veces.
• Decontor el oguo de enjuogue, quedondo solo los
semillos en el frosco de lovodo.
Imogen 21. Desinfeccién de los semillos
6.4 Extroccién y siembro in vitro de embriones
cigéticos.
• Con oyudo de uno pinz• Y bisturf N° 10, reolizor
tres cortes loteroles a la semillo, levonto r
suovemente los cotiledones seccionodos para
extroer el embrién.( Imogen 22).
• Sembror 1 é 2 embriones por frosco conteniendo
medio de cultivo para germinocién.
• Los embriones deben ser incubodos a 25°C y
HR: 46 % Y un fotoperiodo de 16 horos luz y 8
horos de oscuridod.
Imogen 22. Extroccion de embrion cigotico
VII. PROTOCOLO DE ACLIMATACION DE P NTULAS DE CACAO
• Reolizor esto etopo en ombiente de invernodero, cercono ol loborotorio de propogocién in vifro, con
sistemo de ospersion instolodo.
• Colocor froscos con pléntulos in vifro a vivero 4 dios antes de su oclimotocién.
• Extroer los pléntulos contenidos en los froscos de cultivo in vifro.
17
• Lovor los roices para eliminor restos del agar.
• Hocer uno inmersion a los plontos en solucién fungicido Beno°*y l (1 g L-’) duronte 10 minutos, de| 1.2 Solucién de Stock de Micronutrientes DKW(100 X)
or secor en popel toollo.
• Preporor un sustrato 1:1 (premix -I- perlito), esterilizor en outoclave a 121°C, 15 libros de presién Contidod g I”'
por 30 minutos.
Reoctiv
500 1,000
• Troslodor el sustroto frfo en bondejos olmocigueros y colocor uno plonto por tubete.
• Cubrir con plostico tronsporente duronte 15 dfos para evitor deshidrotocién, brindor 70% de
sombro, después de ello socor el plostico para que recibo un poco més de luz.
• Aplicor fertilizonte 11 -8-6 (NPK) en el oguo de riego coda 2 dios.
• A los 30 dios hocer el trosplonte de bonde|os olmocigueros o comunitorios a bolsos olmocigueros
de 1 Kg, hosto que estén listos para su siembro en compo definitivo.

Nato: El sustroto para oclimotor tombién puede ser esterilizodo por método de solorizocién o
trotomiento quimico.

VIII. ANEXOS
1.3 Solucién de stock de vitominos DKW (1000 X)
PREPARACION DE SOLUCIONES STOCKY MEDIOS DE CULTIVO
Reoctivos
Lo composicién de los medios de cultivo fueron reozlizodos segdn Guiltinon & Moximovo, 2010. 50 ml 100 ml
American Cocoo Research Institute - College of Agricultural Sciences, 2010. Cocoo Tissue Culture
Protocol Book. Penns ylvania State University. Version 2.1 4-32pp. Con modificociones en los Myo-lnositol 5g 10 g
Thiomino-HCL 0.1 9 0.2 g
concentrociones hormonoles. Acido Nicotinico 0.05 9 0.lg
1. FORMULACIONES DE SOLUCIONES STOCK Glycino 0.1 9 0.2 g

1.1 Solucién de Stock Mocronutrientes DKWAy B (10 X)

Reoctivos 1,000 ml 1.4 Solucién de stock de vitominos B5 a Gomborg (1000 X)

Solucion A
NH,NO, 14,160 Reoctivos 50 ml Contidod
100 ml
C A(N O$ t2• 4HzO 19,690
Solucién B
CoC- 2H,O 1,490
K2SO, 15,590
MgSO,.7H,O 7,400
KH2 0# 2,650
18 19
 2. FORMULACIONES DE MEDIOS DE CULTIVO
2.3 Medio para Desorrollo de embriones (ED)
Nato:
Los soluciones Macro DKW A,Macro DKW B, Micro DKW, Vitominos deben ser olmocenodos Contidod (limos)
Reoctivos 500 ml 1,000 ml
a 4” C y combiorlos coda 30 dfos.
2.1Medio de Crecimiento Primorio de Collos (PCG)

Contidod (limos)
Reoctivos 500 ml 1,000 ml

Autoclovor 15 min. 15 min.

*Medio de Cultivo Modificodo

Esterilizor en Autoclove 15 min. | 15 min. 2.4 Medio Primorio de Conversién de Embriones - Pléntulos (PEC)

Contidod (litros)
2.2 Medio de Crecimiento Secundorio de Collos (SCG) Reoctivos
500 ml 1,000 ml

Contidod (litros)
Reoctivos
500 ml t 1,000 ml

Esterilizor en Autoclove | 15 min. | J5 min.

20 21
 GLOSARIO LITERATURA CITADA
BIOTECNOLOGIAVEGETAL
Aguilor, M. 1990. Obtencién de plontos de cocoo (Tfieobroma cacoo L.) a portir del microin|erto de
embriones sométicos. Tesis M.Sc. Turriolbo, CR. Centro Agronomico Tropical de Investigocion y
Aplicocién de la cienci° Y !° tecnologio a los plontos, sus portes, Enseñonzo. 131 p.
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fisiolégicos. Arvelo SM, Gonzélez LD, Moroto AS, Delgodo LT y Montoyo LP Manual técnico del cultivo de
cocoo: Précticos Lotinoomericonos. 2017. Instituto Interomericono de Cooperocién para la Agriculturo,
EXPLANTE Son José, C.R.: IICA, 2017.

Es cuolquier porte de un orgonismo vivo, como los célulos, los te| Chonotésig, C. 2004. Induccién de la embriogénesis somético en clones superiores de cocoo
idos, o los orgonos, que son tronsferidos a un medio artificial (Tfieobromo cacoo L.), con resistencio a enfermedodes fungosos. Tesis M.Sc. Turriolbo, CR. Centro
para cultivo. Agronémico Tropical de Investigocién y Enseñonzo. 86 p.

CALLO
Célufos vegetoles en un proceso de indiferenciocién, en
constonte divisién celulor.
Ji\I YIFHO
Se refiere a uno técnico para reolizor un determinodo
experimento en un tubo de ensoy u otro frosco, en un
ombiente controlodo fuero de microorgonismos.
PROPAGATION
Es la mu ltiplicocién de plo ntos por medios vegetotivos
(osexuoles).
PROTOCOLO
Es conocido como un procedimiento esténdor de
operociones, uno lista de instrucciones para reolizor un
experimento.
Driver J.A. & Kuniyuki A.H. (1984) In vitro propagation of paradox walnut rootstock. HortScience
19: 507-509.
Gomboo, J. 2015. “Comportomiento en vivero de cuotro clones de cocoo (7heobromo cocoo L.) sobre
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Gérote MA., Arévolo E., Correo do BomfimCosto, L., & do Costa-Silva, D. 2017. Pro-embrionory
Somatic Structure of Three Cocoo Gen !y es (7heobromo Cocoo I.) Using Stominodes. International
Annals Of Science, 2(1), 28-32. doi: https://doi.org/10.21467/ios.2.1.28-32.
Guiltinon, M.J., Moximovo, S.N. 2010. College of Agricultural Sciences. Integrated System for
Yegetotive Propagation of Cocoo. Protocol Book. Pennsylvania State University. Version 2.1 4-24pp.
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22 23
Son Mortin
GOBIERNO REGIONAL
Inslituto Nasional de Innovaciân Agraria