Arrieta Cruz Diana Laura

Coquis Hernández María Fernanda

Gutierrez de Jesus Cinthya Susana
Montoya Sosa Frida Cassandra
Tabal Cervantes Laura Angelica
Valdez Calderón Fernando

Métodos moleculares para el estudio de alimentos

Caso:
En el mes de enero se presentó un brote en la zona sur de la ciudad, el cual fue asociado al
consumo de carne de pollo o carne de res en un restaurante comercial. La tasa de personas
contagiadas fue de 53% (32/60) y ninguno de los casos requirió hospitalización. El 100 % de los
casos presentaron: náuseas, vómito, calambres abdominales, diarrea, fiebre, escalofríos y dolor
de cabeza. El grupo de edad más afectado fue el de 20 a 24 años (n=10). Dadas las
características de los síntomas se sospechó de la contaminación por Salmonella spp. en ambos
alimentos.

Con la finalidad de determinar el origen y el agente patógeno causante del brote, se procesaron
distintas muestras de carne (ver resumen del protocolo) y se realizó el aislamiento de colonias
en un medio selectivo. De una colonia presunta positiva de Salmonella de cada muestra, se
extrajo el DNA y se llevó a cabo la amplificación del gen 16S DNAr por PCR, utilizando un par de
oligos (primers) que amplifican una región de 1500 pb.

Las reacciones de PCR se analizaron en gel de agarosa en los cuales se incluyó un marcador de
peso molecular, así como los respectivos controles negativos y positivos.

Los resultados del análisis del DNA extraído y de la PCR se muestran a continuación:

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El producto de 1500 pb de la muestra CC y CP se cortó del gel, después de su purificación se
secuenció con el método de Sanger y las secuencias se analizaron en la base de datos NCBI.
Los resultados para ambas muestras arrojaron la identificación de Salmonella spp. con un 90%
de identidad para la muestra de carne de res y 99% de identidad para la muestra de carne de
pollo. Finalmente, con estos resultados se asoció el brote con el consumo de ambas carnes y se
concluyó que el agente causante fue el patógeno Salmonella spp.

Con base a lo anterior:

1- Contesta las siguientes preguntas (justifique adecuadamente su respuesta)

● ¿Se obtuvo el producto de PCR esperado?

Sí, porque de acuerdo con los resultados de la PCR ambas muestras son positivas al fragmento
de 1500 pb en el gel de agarosa. Ya que cuando los amplicones son corridos en el gel de
electroforesis junto con el marcador molecular, que contiene un número determinado de
segmentos de ADN conocidos, esto facilita la identificación de los amplicones y se puede
identificar si su tamaño corresponde con el esperado, que en este caso era 1500 pb.

● ¿Los primers utilizados son específicos?

Sí, debido a que los primers son secuencias de oligonucleótidos que flanquean y delimitan la
secuencia blanco que se desea amplificar y son complementarios a ésta. Además los primers
específicos se unen, de manera específica, al mRNA en aquella zona de su secuencia donde
esté el gen que queremos analizar, en este caso se utilizaron primers específicos para amplificar
una región de 1500 pb del gen 16S DNAr

● ¿Cómo se explica el bajo porcentaje de identidad en la carne de res?

Podría deberse a que la muestra de carne de res muestra dos bandas en el gel de electroforesis,
un amplicón positivo al fragmento de 1500 pb, que era el esperado, y otro positivo al fragmento
de 1000 pb, ambas bandas coinciden con las generadas por el control negativo (que es una
muestra libre de ADN)
Se puede hacer una hipótesis de que durante la separación de lípidos y proteínas parte del DNA
se haya perdido y por eso no se obtuvo un alto porcentaje de identificación.
Por otra parte puede que el patógeno no haya contaminado por completo la carne y apenas
comenzaba su expansión por toda la carne.
Por último puede que alguno de los primers no haya identificado bien algunas proteínas por lo
que la extracción de DNA no haya salido satisfactoriamente.

● Con los resultados obtenidos ¿Se puede asegurar que el brote se originó por el
consumo de ambos tipos de carne y que el microorganismos responsable fue
Salmonella?
Sí, ya que Salmonella se encontró en ambos tipos de carnes con cierto porcentaje y conociendo
el cuadro clínico que se presenta al consumir alimentos contaminados con Salmonella se puede
concluir que, en efecto, el brote se originó por el consumo de ambas carnes siendo Salmonella el
agente patógeno responsable.
Se identificó con un 90% Salmonella spp. en carne de res y con un 99% en pollo, ya que no se
sabía con certeza si este patógeno era el causante de los síntomas de la población joven y con
el PCR se pudo identificar con certeza que se trataba de dicho patógeno.

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2- Encontrarás una figura que esquematiza el proceso general que se realizó para la
extracción del DNA. Coloca en los cuadros rojos que disolución o buffer se debe usar
para cada paso, el listado de cada disolución o buffer se encuentra del lado derecho de la
figura, marcado con una letra. También es necesario colocar la temperatura y los días de
incubación para el aislamiento de Salmonella spp.

RESPUESTA:

● Para el aislamiento es la letra D, se incuba a 37°C de 18-24 hrs

● Para la lisis celular: A
● Para la separación de proteínas y lípidos es la letra B
● Para la precipitación es la letra C