Secuenciación

DNA
• ¿QUÉ ES LA SECUENCIACIÓN DEL ADN?
• ¿CUÁNDO SE UTILIZA?
• ¿QUÉ MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN EXISTEN?
• NUEVOS MÉTODOS
• APLICACIONES
¿Qué es la secuenciación del DNA?

• Es el proceso mediante el cual podemos conocer el

orden de los nucleótidos que componen el DNA

• ¿Cuándo se utiliza la secuenciación del DNA?

• Cuando se quiere conocer el orden de los nucleótidos de
un gen de interés
• Cuando se quiere determinar la secuencia de uno o más
genes de una especie
• Cuando se quiere identificar la presencia de una mutación
puntual
• Cuando queremos verificar que el producto amplificado de
un PCR corresponde al gen de interés
 Métodos de secuenciación
• Existen dos métodos de secuenciación:
1. Secuenciación de Maxam-Gilbert → modificación química de
alta complejidad del ADN que genera fragmentos con ruptura en
bases específicas
2. Método Enzimático de SANGER → reacción mediada por
enzima DNA polimerasa, un partidor sintético y un
dideoxinucleótido
 Método de Sanger
• Desarrollado en 1977
• Reacción mediada por DNA polimerasa I que extiende la cadena
desde OH libre del extremo 3´ del oligo, incorporando dNTPs
(amplificacion sintetica como PCR).
• Utiliza UN PARTIDOR SINTÉTICO de 17 a 20 bases complementario
al ADN
• El partidor se une río arriba del inicio de la secuencia de interés.
• ADN debe estar clonado
• La secuencia que se obtiene es la hebra COMPLEMENTARIA de la
original y debe leerse de abajo hacia arriba
 Método de Sanger
• Se hacen cuatro reacciones de síntesis separadas
• Mezclas tienen dNTPs y pequeñas cantidades de dideoxinucleótidos
(ddGTP; ddATP, ddCTP, ddTTP) → Fragmentos de distintos tamaños
Método de Sanger
• Se utiliza un solo partidor (secuenciación de una sola hebra)
MÉTODO SANGER

https://www.khanacademy.org/test-prep/mcat/biomolecules/dna-technology/v/dna-sequencing
 SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA

• Primer secuenciador automático creado en 1987 por ABI

PRISM, basado en el método de Sanger
• La secuenciación automática puede ser de dos tipos:
1. Empleando partidores fluorescentes.
2. Empleando ddNTPs marcados con fluorescencia
• La separación de los fragmentos se hace por gel de
poliacrilamida, sistema puede ser para 24 o 96 canales
máximo y permite leer hasta 450 pb
• Los equipos de 2ª generación utilizan capilares y las muestras
se inyectan automáticamente en el equipo y pueden resolver
hasta 800bp
 SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA
• Las sondas empleadas son:
A → JOE, verde.
C → FAM, azul.
G → TAMRA, amarillo.
T → ROX, rojo.

• Detección de los fragmentos por separación en gel de poliacrilamida

• Identificación de la fluorescencia por excitación del fluoróforo con
láser de argón → emisión de fluorescencia → Correspondencia de
base
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA
SECUENCIACIÓN UTILIZANDO PARTIDORES FLUORESCENTES
 SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA
SECUENCIACIÓN UTILIZANDO ddNTPs FLUORESCENTES
• ddNTPs se encuentran marcados con distintas sondas
fluorescentes.
• La reacción se puede hacer en el mismo tubo, a diferencia del
método anterior.
 SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA
SECUENCIACIÓN UTILIZANDO ddNTPs FLUORESCENTES

https://www.dnalc.org/view/15923-Cycle-sequencing.html
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA
ASI SE VE LA SECUENCIA OBTENIDA DEL ADN AL FINAL DEL
PROCESO!!!!!!!!

ELECTROFEROGRAMA
Secuenciación automática
 SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA

VENTAJAS
• Al utilizar fluoroforos, tiene menor contaminación
• Lectura en el computador, sin autoradiografías, hay menor error
de lectura.
• Se pueden leer unos 700-800 nucleótidos por corrida, mientras
que en el sistema manual hasta 300 pb
• Resultados en menos tiempo (horas v/s días).
• Más barato a la larga (inversión inicial alta)
 ¿QUÉ PASOS SE DEBEN SEGUIR PARA
SECUENCIAR UN FRAGMENTO DE INTERÉS?
NUEVOS MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN (NGS)
NUEVOS MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN (NGS)
NUEVOS MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN (NGS)

Trends Genetics, Sept 2014, 30(9): 418

 NUEVAS TÉCNICAS
454/Roche
 NUEVAS TÉCNICAS
454/Roche
 NUEVAS TÉCNICAS
454/Roche
 NUEVAS TÉCNICAS
454/Roche
 NUEVAS TÉCNICAS
Illumina/Solexa
 NUEVAS TÉCNICAS
Illumina/Solexa

GENERACIÓN IN-SITU DE COPIAS DE ADN

SOBRE UNA BASE SÓLIDA
 NUEVAS TÉCNICAS
Illumina/Solexa
• Illumina
 Nuevos métodos de secuenciación (NGS)
• Equipos Secuenciación Illumina
Nuevos métodos de secuenciación (NGS)
 Aplicaciones de la secuenciación
• SECUENCIACIÓN GENOMAS
• Proyecto Genoma Humano (2001)
Otros genomas secuenciados

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/
 Aplicaciones
• IDENTIFICACIÓN BACTERIAS, HONGOS Y VIRUS
• Tipificación de especies bacterianas, gen 16S DNA, gen rpoB, regiones
ITS2 de levaduras y hongos, identificación viral y de resistencia
antibiótica.

• DETECCIÓN DE MUTACIONES
• Identificación de SNPs (cáncer y respuesta farmacogenética),
Identificación y cuantificación de niveles de metilación

• DIAGNÓSTICO PRENATAL
• Diagnóstico de enfermedades hereditarias
 Aplicaciones

Sex Transm Infect. 2017 Feb;93(1):65-67

Euro Surveill. 2017 Jan 19; 22(3): 30445.

J Clin Microbiol. 2016 Jan; 54(1): 127–133.

Viruses 2016, 8, 96; doi:10.3390/v8040096

Aplicaciones
Servicio de Secuenciación
Servicio de secuenciación
¿Y QUÉ HACEMOS CON TODA ESA INFORMACIÓN?
Información en bases de datos
Información en bases de datos