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com

ARTÍCULO
https://doi.org/10.1038/s41467-022-29065-2 ABIERTO

Bacterias controladas por ultrasonido para

inmunoterapia contra el cáncer
Mohamad H. Abedi1,5,6, Michael S. Yao1,6, David R. Mittelstein2, Avinoam Bar-Sión3, Margaret B. Swift3,
Audrey Lee Gosselin3, Pierina Barturen-Larrea3, Marjorie T. Buss3y Mikhail G. Shapiro3,4✉
1234567890():,;

Los rápidos avances en biología sintética están impulsando el desarrollo de microbios modificados genéticamente como agentes terapéuticos para una multitud de enfermedades humanas,

incluido el cáncer. El microambiente inmunosupresor de los tumores sólidos, en particular, crea un nicho favorable para que las bacterias administradas sistémicamente injerten y liberen cargas

terapéuticas. Sin embargo, tales cargas útiles pueden ser dañinas si se liberan fuera del tumor en tejidos sanos donde las bacterias también se injertan en cantidades más pequeñas. Para

abordar esta limitación, diseñamos bacterias terapéuticas para que sean controladas por ultrasonido enfocado, una forma de energía que se puede aplicar de manera no invasiva a sitios

anatómicos específicos, como tumores sólidos. Este control lo proporciona un interruptor de estado genético activado por la temperatura que produce resultados terapéuticos duraderos en

respuesta a la hipertermia ultrasónica focalizada aplicada brevemente. Usando una combinación de diseño racional y detección de alto rendimiento, optimizamos los circuitos de conmutación de

las células modificadas y conectamos su actividad con la liberación de inhibidores de puntos de control inmunitarios. En un modelo de cáncer clínicamente relevante, los microbios terapéuticos

activados por ultrasonido se activan con éxito in situ e inducen una marcada supresión del crecimiento tumoral. Esta tecnología proporciona una herramienta fundamental para la orientación

espaciotemporal de potentes agentes terapéuticos bacterianos en una variedad de escenarios biológicos y clínicos. Usando una combinación de diseño racional y detección de alto rendimiento,

optimizamos los circuitos de conmutación de las células modificadas y conectamos su actividad con la liberación de inhibidores de puntos de control inmunitarios. En un modelo de cáncer

clínicamente relevante, los microbios terapéuticos activados por ultrasonido se activan con éxito in situ e inducen una marcada supresión del crecimiento tumoral. Esta tecnología proporciona

una herramienta fundamental para la orientación espaciotemporal de potentes agentes terapéuticos bacterianos en una variedad de escenarios biológicos y clínicos. Usando una combinación de

diseño racional y detección de alto rendimiento, optimizamos los circuitos de conmutación de las células modificadas y conectamos su actividad con la liberación de inhibidores de puntos de

control inmunitarios. En un modelo de cáncer clínicamente relevante, los microbios terapéuticos activados por ultrasonido se activan con éxito in situ e inducen una marcada supresión del

crecimiento tumoral. Esta tecnología proporciona una herramienta fundamental para la orientación espaciotemporal de potentes agentes terapéuticos bacterianos en una variedad de escenarios

biológicos y clínicos.

1División de Biología e Ingeniería Biológica, Instituto de Tecnología de California, Pasadena, CA 91125, EE. UU.2División de Ingeniería y Ciencias Aplicadas, Instituto de
Tecnología de California, Pasadena, CA 91125, EE. UU.3División de Química e Ingeniería Química, Instituto de Tecnología de California, Pasadena, CA 91125, EE. UU.4
Instituto Médico Howard Hughes, Instituto de Tecnología de California, Pasadena, CA 91125, EE. UU.5Dirección actual: Departamento de Bioquímica, Instituto para el
Diseño de Proteínas e Instituto Médico Howard Hughes, Universidad de Washington, Seattle, WA 98195, EE. UU.6Estos autores contribuyeron igualmente: Mohamad H.
Abedi, Michael S. Yao.✉Email:mikhail@caltech.edu

COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA| (2022)13:1585 | https://doi.org/10.1038/s41467-022-29065-2 | www.nature.com/naturecommunications 1

ARTÍCULO
C
Las nuevas terapias están emergiendo rápidamente como una clase de
tecnologías emocionantes y efectivas para el tratamiento del cáncer.1–3.
Entre los tipos de células que se investigan para la terapia, las células
inmunitarias se han destacado en el tratamiento de las neoplasias malignas
hematológicas. Sin embargo, su uso en tumores sólidos se ha visto obstaculizado
por su capacidad reducida para penetrar y funcionar en el entorno
inmunosupresor del tumor, especialmente dentro de los núcleos hipóxicos
inmunoprivilegiados.4–6. Por el contrario, la actividad inmunitaria reducida de
algunos núcleos tumorales crea un microambiente favorable para el crecimiento
de ciertas bacterias, que pueden llegar a los tumores después de la
administración sistémica.7–9. Aprovechando sus propiedades de infiltración de
tumores, estas bacterias pueden diseñarse para que funcionen como terapias
celulares efectivas al secretar cargas útiles terapéuticas para matar directamente
las células tumorales o remodelar el microambiente para estimular la inmunidad
antitumoral.10–15. Sin embargo, los beneficios de la terapia microbiana a menudo
se ven contrarrestados por las preocupaciones de seguridad que acompañan a la
inyección sistémica de microbios en pacientes con control limitado sobre su
biodistribución o actividad.1,dieciséis,17. Esto es especialmente importante dado el
injerto bien documentado de bacterias circulantes en tejidos sanos como el
hígado, el bazo y ciertos nichos de células madre hipóxicas.18–21. Para evitar
dañar órganos sanos, es fundamental que la actividad terapéutica de los
microbios se dirija a los tumores.
Entre los mecanismos disponibles para regular la función microbiana, los
inductores químicos administrados sistémicamente20,22–26son convenientes de
aplicar pero incapaces de apuntar a un sitio anatómico particular. Mientras tanto,
los elementos de control inducidos por la luz proporcionan una alta precisión
espaciotemporal27–29, pero están limitadas por la escasa penetración de la luz en
los tejidos intactos30. Los promotores inducidos por radiación pueden ser objeto
de energía de penetración profunda. Sin embargo, la radiación ionizante conlleva
el riesgo de dañar las células inmunitarias del huésped y las células microbianas
modificadas.31. Alternativamente, los reguladores transcripcionales basados en
la temperatura permiten el control espaciotemporal en profundidad, ya que la
temperatura puede elevarse con precisión dentro de un rango bien tolerado32,33
en tejidos profundos utilizando métodos no invasivos como el ultrasonido
focalizado (FUS)34–36.
De hecho, recientemente se demostró que FUS se puede usar junto con
represores dependientes de la temperatura para controlar la expresión de
genes bacterianos.37. Sin embargo, estos represores operaron en cepas
clonadas de bacterias clínicamente irrelevantes, tuvieron resultados no
terapéuticos y produjeron solo una activación transitoria inadecuada para
el tratamiento del tumor, que generalmente requiere semanas de actividad
terapéutica.10,11,22.
Aquí describimos el desarrollo de bacterias terapéuticas activadas por FUS en
las que un breve estímulo térmico activa la liberación sostenida de
inmunoterapia contra el cáncer. Diseñamos estos agentes celulares adaptando
represores sensibles a la temperatura a las especies probióticas que se alojan en
tumores.E. colinissle 191710,38y diseñar circuitos genéticos en los que controlan
un cambio de estado basado en integrasa37,39resultando en la producción de
terapia a largo plazo. Para mejorar la seguridad y la eficacia de estas células,
examinamos bibliotecas aleatorias y racionalmente diseñadas de variantes de
circuitos genéticos para construcciones con una actividad inicial mínima y una
inducción máxima tras la estimulación térmica. Utilizamos los circuitos de genes
optimizados para expresar inhibidores de puntos de control inmunitarios
dirigidos a CTLA-4 y PD-L1. En un modelo de cáncer de ratón, mostramos que los
microbios modificados resultantes se activan de manera confiable y crónica
mediante un tratamiento FUS breve y no invasivo después de la administración
sistémica para liberar la terapia y suprimir con éxito el crecimiento tumoral.
Resultados
Caracterización de biointerruptores térmicos en un microbio terapéuticamente
relevante.Para desarrollar un circuito terapéutico activado por la temperatura,
comenzamos con represores transcripcionales dependientes de la temperatura
de alto rendimiento, que activan la expresión génica transitoria.
2 COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA| (2022)13:1585 | https://doi.org/10.1038/s41467-022-29065-2 | www.nature.com/naturecommunications
COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | https://doi.org/10.1038/s41467-022-29065-2
en respuesta a pequeños cambios de temperatura alrededor de 37 °C37.
Dado que los elementos genéticos tienden a comportarse de manera
diferente entre los tipos de células debido a las variaciones en la expresión
de proteínas y otros aspectos del entorno intracelular40, primero
caracterizamos el desempeño de estos represores en nuestro chasis
terapéutico elegido:E. coliNissle 1917 (EcN). Esta cepa bacteriana está
aprobada para el uso de probióticos humanos y se emplea comúnmente en
la terapia de tumores microbianos.10,38. Seleccionamos tres candidatos a
represores, TlpA39, TcI y TcI42, como nuestros puntos de partida debido a
sus umbrales de temperatura de activación deseables de 39 °C, 38 °C y 42
°C, respectivamente. En su huésped natural,Salmonella typhimurium, Se
especula que TlpA es responsable de la regulación de los genes de
virulencia al ingresar a un organismo huésped cálido.41. Mientras tanto, TcI
es un mutante sensible a la temperatura de la proteína "cI" del bacteriófago
lambda.42. En su contexto nativo, cI sirve como un represor transcripcional
que permite que el virus del bacteriófago lambda establezca y mantenga la
latencia.43.
Para evaluar el desempeño de estos candidatos, diseñamos
construcciones de reporteros donde regulan la expresión de una proteína
verde fluorescente (GFP) (Fig.1a), las transformó en células EcN y midió la
intensidad de fluorescencia normalizada por densidad celular
correspondiente en función de la temperatura entre 33 °C y 42 °C (Fig.1b).
Esta construcción nos proporcionó una plataforma manejable para evaluar
directamente la inducibilidad de los represores térmicamente sensibles en
las células EcN midiendo la fluorescencia de GFP. Como estábamos
interesados en usar estos biointerruptores in vivo, nos enfocamos en el
cambio de pliegue entre la temperatura fisiológica de los mamíferos (37 °C)
y una temperatura elevada que puede usarse para desencadenar la
activación in vivo mientras se minimiza el daño térmico a los tejidos locales
(42 °C) (fig.1C). Los resultados de estos experimentos indicaron que TcI42
es el mejor candidato para la integración en nuestro interruptor térmico, ya
que exhibe una fuerte inducción a 42 °C mientras mantiene bajos niveles de
actividad de referencia.
Con TcI42 sirviendo como transductor térmico en nuestras células, luego
buscamos determinar la duración mínima de calentamiento y los parámetros de
calentamiento ideales necesarios para lograr una fuerte activación y minimizar el
daño a las células. Estimulamos células que portaban el circuito descrito en la Fig.
1a elevando la temperatura a 42 °C durante diferentes duraciones y midiendo la
intensidad de fluorescencia correspondiente (Fig.1d). Los resultados indicaron
que se necesita un tiempo de calentamiento mínimo de una hora para una
activación robusta. Cuantificamos el efecto de esta dosis térmica en la viabilidad
de las células microbianas y, simultáneamente, probamos un esquema de
calentamiento pulsátil que previamente se demostró que mejora la viabilidad en
las células de mamíferos.44. Para el esquema de calentamiento pulsátil, el ciclo de
trabajo se mantuvo constante al 50 % mientras se alternaba la temperatura entre
37 °C y 42 °C, lo que resultó en un total de una hora a 42 °C durante un período
de dos horas, con una duración variable del pulso. entre 1 y 60 min (Fig.1mi).
Como se planteó como hipótesis, la viabilidad celular disminuyó a medida que
aumentaba la duración del pulso, mientras que los niveles de inducción no
variaron significativamente (Fig.1F). Sobre la base de estos resultados,
seleccionamos una duración de pulso de cinco minutos para aplicaciones
posteriores, ya que este paradigma de calentamiento mejoró la viabilidad celular
al mismo tiempo que se logra fácilmente con una configuración de ultrasonido
enfocado. En conjunto, nuestros experimentos identificaron y caracterizaron a
TcI42 como un transductor térmico eficaz para controlar la expresión génica en la
cepa EcN terapéuticamente relevante.
Construcción de un interruptor de estado accionado térmicamente.Por sí solo, el
interruptor TcI42 no es suficiente para la terapia del cáncer microbiano. Este
interruptor se activa de forma transitoria mientras dura el calentamiento,
mientras que la terapia tumoral requiere semanas para suprimir eficazmente el
crecimiento tumoral. Dado que la aplicación diaria de FUS durante este período
puede no ser deseable en un entorno clínico, nos propusimos diseñar un circuito
genético que mantenga una respuesta terapéutica prolongada después de una
única activación térmica breve.
COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | https://doi.org/10.1038/s41467-022-29065-2 ARTÍCULO

a b
3000 TCIpeso
E. colinissle 1917

Fluorescencia / OD [arb.units]
TlpA39
∆T
TCI42
TlpA39 2000
TSR TCIpeso
TCI42

1000
GFP TSR
pTSR lugar Plazo T7

0
34 36 38 40 42

C 42ºC d Temperatura (°C)

10000
37ºC
1.6
155 3000
Fluorescencia / OD [arb. unidades]

1000 11

Fluorescencia / OD [arb. unidades]

TCI42

100 2000

10
1000
1

0
0.1 0 30 60 90 120
TlpA39 TCIpeso TCI42
Tiempo de inducción (min)

represores TS

mi F
1800 30
42°C
Fluorescencia / OD [arb. unidades]

1500 25

x106células viables
37°C 1200
20
Escaneo de ancho de pulso
900
15
600

300 10
Fluorescencia / OD [unidades
arbitrarias] x106células viables
0 5
2 horas
0

10

30

60

Ancho de pulso de inducción (min)

Fig. 1 Evaluación de represores transcripcionales sensibles a la temperatura enE. coliNissle 1917. unIlustración del circuito genético utilizado para caracterizar el comportamiento de los represores
sensibles a la temperatura enE. coliNissle 1917.bDensidad óptica (OD600)-fluorescencia normalizada en función de la temperatura de inducción durante una duración fija de 1 h, medida 24 h
después de la inducción. Las barras de error representan ±SEM. Para confirmar que los datos resultantes no están impulsados por cambios en la OD impulsados por la temperatura, se analizó de
manera similar EcN de tipo salvaje y no se mostró ningún cambio de pliegue dependiente de la temperatura. Además, el recuento total de células por citometría de flujo también se utilizó como
indicador del número de células y generó resultados similares a los obtenidos mediante la normalización a través de OD como indicador del recuento de células (Fig. 1 complementaria).C
Fluorescencia normalizada por DO 24 h después de una inducción de 1 hora a 37 °C o 42 °C para las construcciones que se muestran en (b). Las mediciones con valores por debajo de la parte
inferior del eje y aparecen debajo del eje. Las barras indican la media. Las líneas verticales indican la diferencia entre las condiciones de 42 °C y 37 °C. Los números indican el cambio de pliegue.d
Fluorescencia normalizada por DO en función de la duración de la inducción. Las células se estimularon a 42 °C y se midió la fluorescencia 24 h después.miIlustración del esquema de calentamiento
pulsátil utilizado para optimizar la inducción térmica y la viabilidad celular.FFluorescencia ODnormalizada en función de la duración del pulso para el TcI42circuito. Todas las muestras se estimularon
durante un total de 1 hora a 42 °C y 1 hora a 37 °C y se evaluaron 24 horas después. Recuentos de células viables en varias duraciones de pulso trazadas para reflejar la viabilidad celular. Donde no
se ven, las barras de error (±SEM) son más pequeñas que el símbolo.norte = [5, 5, 6, 4] réplicas biológicamente independientes para paneles [b, c, d, f].Todos los datos de origen se proporcionan
como un archivo de datos de origen.

Para permitir un cambio térmico estable, colocamos la expresión de estos sitios se pueden reutilizar para flanquear una secuencia de ADN
Bxb1, una serina integrasa, bajo el control de los promotores inducibles arbitraria y mediar en su inversión, lo que da como resultado una
térmicamente del fago lambda pL/pR, cuya actividad está regulada por el funcionalidad de conmutación estable46. Nuestro diseño combina la
represor TcI42 (Fig.2a). Las serina integrasas como Bxb1 se descubrieron sensibilidad a la temperatura de TcI42 con esta función efectora
inicialmente en bacteriófagos como una clase de enzimas dirigidas a permanente de la integrasa Bxb1. A temperaturas fisiológicas de
secuencias de ADN conocidas como sitios attP y attB. En su contexto nativo, aproximadamente 37 °C, la expresión constitutiva del represor TcI42 del
estos sitios sirven como centro para la integración del ADN del bacteriófago promotor pLacI reprime la expresión de Bxb1. Tras la estimulación térmica,
en el genoma de las células diana.45. Sin embargo, la liberación de la represión de TcI42 da como resultado un estallido de

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ARTÍCULO COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | https://doi.org/10.1038/s41467-022-29065-2

GFP tetR caja

b1 ssrA TCI42
P7 2x PR PR RBS lugar Término
Término

∆T

GFP tetR caja

b1 ssrA TCI42
P7 2x PR pl RBS lugar Término
Término

b
caja
b1 ssrA
PR PR RBS

4096 2 9261
NNNNNNxATG/GTGx ssrA[NYAXXX]
= 37°C 42°C
~107variantes

C d
100 9 42 ºC
17
10 12 37°C
Fluorescencia42ºC/ OD [arb. unidades]

36
10
% de celdas en estado activado

104

1
103

0.1

102
102 103 104 1 2 3 4 5
Fluorescencia 37ºC / OD [arb. unidades] 0.01
Candidatos de pantalla de biblioteca

mi F
Diseñado racionalmente copia baja Copia mediana
100 7
candidatos origen origen
19 42 ºC
91
139 37°C
Sin terminador A C
10
% de celdas en estado activado

sensible a la temperatura
B D
terminador

caja
b1 ssrA
pl
relaciones públicas TR RBS
término
0.1

∆T
0.01
A B C D
caja
b1 ssrA
pl
relaciones públicas RBS Candidatos de diseño racional

Expresión Bxb1. La expresión de Bxb1 desreprimida térmicamente luego cataliza proteína terapéutica (fig.2a). Debido a que los sitios de reconocimiento attP
la inversión de los sitios de reconocimiento mínimos attP y attB que flanquean el y attB son modificados después de la inversión por la enzima Bxb1, la
promotor P7, lo que da como resultado la expresión posterior de un indicador secuencia de ADN invertida no es reconocida por la interacción Bxb1
fluorescente para monitorear el estado del circuito y un casete de resistencia a la posterior y, por lo tanto, es un evento de inversión permanente.
tetraciclina que sirve como marcador de posición para un Posteriormente, el promotor P7 continúa impulsando la expresión

4 COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA| (2022)13:1585 | https://doi.org/10.1038/s41467-022-29065-2 | www.nature.com/naturecommunications

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Fig. 2 Construcción y optimización de un interruptor de estado sensible a la temperatura. aIlustración del circuito genético construido para establecer un cambio de estado sensible
a la temperatura. TetR es el casete de resistencia a la tetraciclina.bIlustración de los sitios seleccionados en una pantalla de alto rendimiento para optimizar la conmutación de
circuitos. Una imagen de fluorescencia representativa de placas de réplica utilizadas para detectar variantes de circuito. Las placas se incubaron a la temperatura indicada durante
una hora y luego se incubaron a 37 °C hasta que las colonias crecieron lo suficiente para el análisis. El círculo naranja indica una colonia de ejemplo seleccionada para un ensayo
adicional.CVariantes del circuito de la pantalla en (b)caracterizados por su fluorescencia a 37 °C y 42 °C.dPorcentaje de conversión al estado activado 24 h después de una
estimulación térmica de 1 hora a 42 °C o 37 °C para cinco de las variantes de circuito de (C).Las barras indican la media. Las líneas verticales indican la diferencia entre las
condiciones de 42 °C y 37 °C. Los números indican el cambio de pliegue.miResumen de las modificaciones racionales realizadas para reducir las fugas en el circuito a 37 °C. F
Porcentaje de inducción 24 h después de 1 hora de inducción térmica a 42 °C en comparación con la incubación inicial a 37 °C para cuatro variantes de circuito descritas enmi. Las
mediciones con valores por debajo de la parte inferior del eje y aparecen debajo del eje. Las barras indican la media. Las líneas verticales indican la diferencia entre las condiciones
de 42 °C y 37 °C. Los números indican el cambio de pliegue.norte = [4, 5] réplicas biológicamente independientes para el panel [d, f].Todos los datos de origen se proporcionan
como un archivo de datos de origen.

de sus cargas útiles de proteínas, incluso cuando se termina el
estímulo de temperatura. El promotor P7 se eligió de un depósito de
promotores bacterianos constitutivos sintéticos.47debido a su
equilibrio de impulsar fuertemente la expresión de una carga genética
sin crear un estrés excesivo para la célula. Para evitar la expresión no
regulada de Bxb1, aislamos la actividad del promotor activado por
temperatura insertando dos terminadores fuertes aguas arriba para
bloquear la actividad de otras regiones del plásmido.48.
El rendimiento ideal del circuito descrito anteriormente mantendría una
actividad de referencia baja a temperatura fisiológica al mismo tiempo que
proporcionaría una inducción fuerte y duradera una vez estimulado
térmicamente. Para lograr este rendimiento, ajustamos tres elementos
clave de la secuencia que afectan la traducción y la estabilidad de Bxb1: la
secuencia de unión ribosomal (RBS) de Bxb1, el codón de inicio y la etiqueta
de degradación de ssrA (Fig.2b). La etiqueta ssrA es un péptido corto que se
agrega naturalmente al extremo C de las proteínas cuya traducción se ha
estancado. Las proteínas que llevan esta secuencia como una fusión son
objeto de degradación por proteasas bacterianas endógenas.49. Para
identificar de manera eficiente las versiones óptimas de estos elementos,
realizamos una selección de biblioteca que constaba de secuencias
aleatorias de 6 pb dentro de Bxb1 RBS, dos opciones de codón de inicio
Bxb1 y tripéptidos terminales aleatorios en la etiqueta de degradación Bxb1
ssrA50. Se probaron dos codones de inicio porque el codón de inicio no
canónico GUG puede regular a la baja la eficiencia ribosomal, y los últimos
tres aminoácidos de la etiqueta de degradación de ssrA se aleatorizaron
porque modulan fuertemente
la tasa de degradación de las proteínas marcadas con ssrA49. Un paisaje total de silenciamiento de células T dentro de tumores sólidos inmunosupresores. de
aproximadamente 107posibles variantes únicas se muestrearon utilizando
un ensayo de replicación en placa de alto rendimiento (Fig.2b). Primero se
replicaron placas de agar que contenían colonias de miembros de la
biblioteca, y luego una placa se incubó a 37 °C para evaluar la expresión de
referencia, mientras que la otra placa se estimuló a 42 °C durante una hora
y luego se volvió a 37 °C durante el resto del tiempo. el periodo de
crecimiento. La fluorescencia dependiente de la temperatura de una
muestra representativa de variantes se muestra en la Fig.2C. Seleccionamos
un subconjunto de variantes con baja fuga y alta activación para cuantificar
su rendimiento de conmutación con un mayor número de repeticiones (Fig.
2d). De estos candidatos, seleccionamos el candidato n.º 5 para una mayor
optimización, ya que activó el mayor porcentaje de células tras la
estimulación, una métrica que es importante para garantizar una fuerte
actividad terapéutica in vivo, al mismo tiempo que conserva un cambio de
pliegue dependiente de la temperatura razonable (Fig. .2d).
Para reducir la actividad de línea de base del candidato #5, modificamos
dos componentes de circuito adicionales (Fig.2mi). La primera modificación
cambió el origen de replicación del pSC101 de origen de copia baja al p15A
de origen de copia media. La segunda modificación exploró el efecto de
insertar un terminador sensible a la temperatura aguas arriba de la
secuencia de codificación Bxb1. Esta familia de terminadores ha sido
diseñada para imitar estructuras moduladas por temperatura conocidas
como termómetros de ARN que se encuentran en la región 5' no traducida
de los ARNm microbianos y juegan un papel importante en la regulación de
la expresión génica microbiana en
respuesta a los cambios de temperatura51. En nuestro circuito, usamos este
terminador para introducir una estructura secundaria sensible a la
temperatura en la transcripción de ARNm que ayuda a terminar la
expresión de la proteína a bajas temperaturas, lo que se suma al control
proporcionado por TcI42 para evitar la producción de proteína Bxb1 con
fugas a temperatura fisiológica.52. A 42 °C, este terminador pierde su
estructura secundaria y la expresión de Bxb1 no se ve obstaculizada.
Evaluamos el rendimiento de cuatro construcciones con una o ambas de
estas modificaciones (Fig.2F).
Aumentar el número de copias del plásmido e insertar el terminador
redujo la activación de la línea de base de forma independiente. Cuando se
combinaron juntas, estas modificaciones dieron como resultado una fuga
significativamente reducida mientras se mantenía un gran cambio de
pliegue en las células activadas tras la inducción. La construcción
resultante, obtenida a través de una combinación de ingeniería aleatoria y
racional, mostró un cambio de actividad de más de 100 veces entre 37 °C y
42 °C.
Células de ingeniería para la secreción de inmunoterapia accionada
térmicamente.Para demostrar la funcionalidad de nuestras células activadas
térmicamente optimizadas en un escenario clínicamente relevante, modificamos
la salida de su circuito genético para expresar una carga útil terapéutica
antitumoral (Fig.3a). Seleccionamos los nanocuerpos αCTLA-4 y αPD-L1, que
bloquean la señalización a través de las vías del receptor del punto de control
CTLA-4 y PD-L1, que están fuertemente implicados en
Los inhibidores de puntos de control como αCTLA-4 y αPD-L1 han surgido
como una clase importante de terapia contra el cáncer, pero su eficacia
terapéutica suele ir acompañada del riesgo de activar involuntariamente la
autoinmunidad en los tejidos testigos cuando se administran
sistémicamente.53,54. Al combinar la capacidad de FUS para atacar áreas
específicas profundas dentro de los tejidos con la infiltración tumoral, la
respuesta térmica y la especificidad molecular de nuestras células
modificadas, razonamos que podríamos dirigir la actividad de estos
potentes inmunomoduladores a los tumores y, por lo tanto, mitigar los
riesgos de exposición sistémica. .
Se ha demostrado que αCTLA-4 y αPD-L1 producen efectos
antitumorales cuando son liberados por probióticos inyectados en el tumor
10. Presumimos que la liberación local activada por FUS de estas proteínas
en tumores de bacterias modificadas administradas sistémicamente
suprimiría el crecimiento tumoral. Para probar esta hipótesis, fusionamos
αCTLA-4 y αPD-L1 con una etiqueta de secreción de PelB para mejorar su
liberación extracelular tras la activación y clonamos cada construcción en
lugar del casete de tetraciclina en nuestro circuito de conmutación
optimizado. El péptido líder pelB, derivado delErwinia carotovoragen pelB,
se ha utilizado previamente para secretar proteínas de microbios22,55,56.
Además, para estabilizar nuestros plásmidos para la retención a largo plazo
in vivo sin selección de antibióticos, agregamos un dominio de estabilidad
de toxina-antitoxina Axe-Txe, que asegura la retención del plásmido en una
población celular al eliminar las células que lo pierden.57,58. El sistema anti-
toxina Axe-Txe tipo II toxina

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ARTÍCULO
a
Terapia
P7
b 40
% de celdas en estado activado
30
20
10
0
C°
37
Fig. 3 Liberación sostenida térmicamente activada de una carga útil terapéutica. aCambio de estado sensible a la temperatura modificado para liberar nanocuerpos αCTLA-4 o αPD-
L1. El circuito incluye un casete de estabilidad Axe-Txe.bPorcentaje de activación 24 h después de 1 hora de inducción térmica a 37 °C, 42 °C o 43 °C para el circuito descrito en (a).
Las barras de error representan (±SEM).CWestern blot contra nanocuerpos αCTLA-4 marcados con hexahistidina. Las células se indujeron durante 1 h a 37 °C, 42 °C o 43 °C, luego se
expandieron en 5 ml de medio durante 24 h a 37 °C antes de recolectar el medio y analizar la liberación de nanocuerpos αCTLA-4. La imagen original de Western blot se muestra en
la Fig. 2 complementaria. Se realizó una tinción similar para confirmar la liberación de αPD-L1.norte =8 réplicas biológicamente independientes para (b).Todos los datos de origen se
proporcionan como un archivo de datos de origen.
se origina en el locus Axe-Txe de los grampositivos
Enterococcus faeciumplásmido PRUM57.
La funcionalidad de conmutación térmica de nuestros circuitos
terapéuticos se parecía mucho a su contraparte no terapéutica. El circuito
que contenía αCTLA-4 mantuvo un estado de desactivación estricto a 37 °C
mientras mostraba cambios de plegado robustos tras la inducción a 42 °C y
43 °C (Fig.3b). Además, al rastrear las células inducidas después de la
inducción, no vimos evidencia de escape mutacional, lo que sugiere un nivel
tolerable de carga.59(Fig. 3 complementaria).
Para evaluar la secreción de nanocuerpos terapéuticos tras la
activación, estimulamos las células durante una hora a 37 °C, 42 °C y
43 °C, luego las cultivamos durante un día a 37 °C y realizamos un
Western Blot para evaluar los niveles de Nanocuerpos αCTLA-4
liberados en sus medios. Este experimento demostró que los
nanocuerpos αCTLA-4 se secretan de forma fiable exclusivamente tras
la estimulación a 42 °C y 43 °C (Fig.3C). No pudimos detectar ninguna
secreción cuando las células se incubaron a 37 °C. Se realizó una
caracterización similar para las células que expresan αPD-L1.
La activación por ultrasonido focalizado provoca la supresión tumoral in
vivo.Para permitir el control térmico de microbios terapéuticos diseñados in
vivo, construimos una configuración de estimulación FUS que proporciona
calentamiento tumoral pulsátil controlado por retroalimentación (Fig.4a),
capturando las características clave de los instrumentos clínicamente
disponibles60,61. Demostramos que nuestro sistema es capaz de alternar la
temperatura en el tumor de un animal vivo entre 37 °C y 43 °C cada cinco
minutos (Fig.4a, Fig. 4 complementaria). Establecimos la temperatura
máxima focal dentro del tumor a 43 °C para permitir que una mayor parte
de la masa se caliente por encima de los 42 °C y garantizar una activación
confiable en el contexto de un ratón. Si bien esto podría provocar algún
daño térmico, razonamos que dicho daño dentro del tumor es aceptable y
podría tener sinergia con la inmunoterapia microbiana.62,63.
Usando esta configuración in vivo, probamos nuestra capacidad para activar
localmente microbios terapéuticos administrados sistémicamente dentro de los
tumores. Sembramos 5×106Células tumorales murinas A20 en los flancos derechos de
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COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | https://doi.org/10.1038/s41467-022-29065-2
∆T
GFP caja
b1 ssrA TCI 42
hacha-txe
2x PR PR
TR RBS lugar Término
Término Término
C
37°C 42°C 43°C
mancha occidental
medios celulares
~15 kilos
αCTLA-4 liberado en medios celulares
°C
ºC
42
43
ratones BALB/c (Fig.4b). Una vez que los tumores crecieron hasta
aproximadamente 100 mm3, inyectamos por vía intravenosa 108Células EcN que
comprenden una mezcla 1:1 de células diseñadas para la secreción de αCTLA-4 o
αPD-L1 activada térmicamente. Se eligió esta terapia combinada porque
proporciona un efecto antitumoral más fuerte en comparación con cualquier
resultado terapéutico por sí solo.10(Fig. 5 complementaria). Los microbios
inyectados recibieron dos días para injertarse en los tumores antes de
estimularlos con FUS. Después de la activación de FUS, se controló el crecimiento
del tumor para evaluar la eficacia terapéutica.
Observamos un retraso importante en el crecimiento tumoral en los
tumores tratados con FUS colonizados por células terapéuticas, mientras
que las tasas de crecimiento en los controles, incluidos los ratones no
tratados con FUS, los animales tratados solo con FUS y los sujetos
inyectados con EcN de tipo salvaje, fueron sustancialmente más altos (Fig.4
c, Fig. 6 complementaria). El efecto observado sobre el crecimiento tumoral
fue comparable al obtenido mediante la administración sistémica de
inhibidores de puntos de control inmunitarios basados en anticuerpos
contra αCTLA-4 y αPD-L1, o mediante la inyección sistémica de EcN
terapéutica preactivada. Sin embargo, a diferencia de cada uno de estos
tratamientos establecidos, cuya actividad depende únicamente de la
biodistribución sistémica de los agentes inyectados y, por lo tanto, conlleva
un potencial de efectos secundarios, la terapia bacteriana activada por FUS
puede actuar de manera espacialmente localizada. Para ilustrar esta
localización, después de completar este experimento, recolectamos
tumores, hígados y bazos, los homogeneizamos químicamente y colocamos
la suspensión en placas en medios selectivos. Al contar el porcentaje de
bacterias activadas,4d). A continuación, examinamos el porcentaje de
agentes bacterianos activados en los tumores, hígados y bazos de los
animales tratados con FUS, lo que confirmó que nuestra activación se
localiza principalmente en los tumores objetivo y evita los tejidos
transeúntes (Fig.4mi).
Uno de los seis tumores activados por FUS desapareció como resultado
del tratamiento y no se pudo cuantificar la activación bacteriana en su
interior. Este tumor no representa el resultado típico de esta terapia. En
tres de los nueve tumores tratados con FUS, la ecografía
COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | https://doi.org/10.1038/s41467-022-29065-2 ARTÍCULO

a 44
Experimental
Ideal
43
42

Temperatura (°C)
41
40
39
38
37
36
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (minutos)

C d mi
1500
*
EcN de tipo salvaje
50 **
*
% de microbios activados dentro de los tumores

FUS 30
Nc Terapéutica 40
Volumen tumoral (mm3)

% de celdas en estado activado

1000 NCE Terapéutica + FUS

EcN terapéutica (preactivada) 30 20

PD-L1 mAb + CTLA-4 mAb

20
500 10
* ****
10

0 0
- 2 0 2 4 6 8 10 12 14
o
le

ad
S

S)
ib

o
íg
FU

FU
us

z
H

Día relativo a la activación térmica

Ba
-F

(+
+

or
m
Tu

no logró activar el circuito bacteriano terapéutico. Esto podría deberse a que las células EcN diseñadas para la inhibición del punto de control controlado
limitaciones en nuestra configuración de calefacción, que actualmente solo es térmicamente pueden alojarse e injertarse en tumores de la circulación sistémica,
capaz de calentar parcialmente la masa tumoral. Dado que se ha demostrado activarse específicamente en respuesta a FUS, mantener esta actividad durante al
que EcN coloniza regiones discretas dentro de los tumores A2064, estos menos dos semanas después de un tratamiento con FUS de 1 hora y reducir
microbios podrían haberse calentado mal si sus ubicaciones no coincidieran con significativamente el crecimiento tumoral .
el foco de ultrasonido (Fig. 7 complementaria). Los sistemas FUS clínicos que
utilizan retroalimentación de resonancia magnética y enfoque mecánico o
eléctrico dinámico para garantizar el calentamiento preciso de volúmenes Discusión
definidos pueden superar estas limitaciones al calentar todo el tumor.sesenta y Nuestros resultados establecen un sistema para la inmunoterapia probiótica
cinco. Los tres ratones no activados se eliminaron de nuestro análisis de dirigida que combina la capacidad especial de las bacterias terapéuticas para
crecimiento tumoral. Sin embargo, incluso sin excluir a estos animales, los alojarse en el núcleo necrótico de los tumores sólidos con la capacidad de FUS
ratones tratados con EcN terapéutica y FUS muestran una reducción significativa para activar localmente su función terapéutica. La activación sostenida de estas
en el volumen tumoral de punto final en comparación con los ratones tratados bacterias terapéuticas está habilitada por un interruptor de estado térmico
solo con EcN terapéutica o solo con FUS, conpags- valores de 0.0002 y 0.0001, desarrollado a través de ingeniería genética de alto rendimiento para tener una
respectivamente en una prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. En actividad de referencia baja, una inducción rápida tras la estimulación y una
general, nuestros experimentos in vivo demostraron actividad sostenida in situ. Cuando este cambio de estado

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Fig. 4 La inmunoterapia bacteriana activada por ultrasonido reduce el crecimiento tumoral in vivo. aIlustración de la configuración automatizada utilizada para administrar
hipertermia FUS a los tumores (izquierda) y el curso temporal representativo de la temperatura del tumor de un ratón tratado con pasos alternos de 5 minutos entre 37 °C y 43 °C.b
Diagrama que ilustra el experimento realizado para evaluar la activación de la inmunoterapia antitumoral microbiana in vivo. A los ratones se les inyectó una mezcla 1:1 de células
EcN que portaban los circuitos αCTLA-4 o αPD-L1, o EcN de tipo salvaje. Las células EcN se lavaron y ajustaron a 0.625 OD600antes de inyectar 100 l por ratón por vía intravenosa. Se
aplicó ultrasonido durante un total de 1 h a 43 °C con un ciclo de trabajo del 50 % y una duración del pulso de 5 min.CTamaños tumorales medidos durante dos semanas en ratones
tratados con EcN de tipo salvaje, microbios terapéuticos en ausencia de FUS, microbios terapéuticos y tratamiento con FUS, o tratamiento con FUS solo. El asterisco representa la
significación estadística calculada con un análisis ANOVA de dos vías en el que la terapia se comparó con cada uno de los controles con una prueba de comparaciones múltiples de
Dunnett (unilateral). * trazado,p = [0,004(**), 0,0384(*), 0,0083(**)] en comparación con [Wildtype, Therapeutic, FUS]; **** trazado,pag = [<0.0001 para todos].dPorcentaje de
activación de EcN terapéutica aislada de tumores tratados con FUS (nueve ratones) y no tratados con FUS (cinco ratones) dos semanas después del tratamiento con FUS. **
graficado representa unpagsvalor de 0,0085 cuando se mide con una prueba de Mann Whitney de una cola. Uno de los tumores activados por FUS desapareció después del
tratamiento y no se pudo cuantificar la activación bacteriana en su interior. Resultados en (discos compactos)se recogieron de cuatro experimentos independientes realizados en
días separados con nuevas células transformadas para cada uno. Donde no se ven, las barras de error (±SEM) son más pequeñas que el símbolo. Se analizaron ocho ratones para los
grupos [EcN terapéutico, FUS], diez ratones para el grupo de tipo salvaje, cuatro para el grupo EcN terapéutico (preactivado) y seis ratones para el grupo PD-L1 mAb + CTLA-4 mAb.
Se analizaron diez ratones para la condición terapéutica, donde tres fallaron en activarse. Los datos de nueve ratones terapéuticos se muestran en el panel (d)ya que en el décimo el
tumor desapareció y no se pudo analizar.miActivación de fondo en tejidos espectadores después de la activación de tumores por FUS. Porcentaje de activación de EcN terapéutica
aislada de tumores tratados con FUS y órganos testigos (hígado, bazo). *p =0,0143 (tumor vs hígado) y 0,0143 (tumor vs bazo). El análisis estadístico se realizó con una prueba de
Mann Whitney (unilateral). Se analizaron cuatro ratones en panel (mi).Todos los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

se utiliza para activar la liberación de inhibidores de puntos de control inmunitarios, los
microbios modificados resultantes pueden activarse dentro de los tumores mediante
una breve exposición a FUS para secretar su carga útil terapéutica durante un período
de tiempo prolongado y reducir sustancialmente el crecimiento del tumor.
El creciente cuerpo de trabajo sobre terapias basadas en bacterias66–69y la
creciente aceptación clínica de FUS60,61,70,71proporcionar a las terapias
bacterianas activadas por FUS un camino hacia la implementación clínica
definitiva. Los objetivos potenciales de la enfermedad incluyen cánceres con
masas primarias fácilmente identificables que son difíciles de extirpar
quirúrgicamente, como tumores de cabeza y cuello, de ovario, de páncreas o
cerebrales. Las terapias bacterianas activadas por FUS también podrían ser
relevantes para los tumores metastásicos, ya que la terapia microbiana en una
sola masa tumoral puede generar una fuerte respuesta inmune adaptativa que
conduce a la eliminación de lesiones tumorales distantes a través del efecto
abscopal.72. Si bien se ha demostrado que las células EcN que colonizan los
tumores A20 no se diseminan fuera de los tumores hacia los órganos sanos72, se
han descrito otros modelos terapéuticos que podrían fomentar la diseminación
de microbios terapéuticos a sitios de tumores secundarios evitando órganos
sanos73. Dichos modelos aumentarían aún más la eficacia terapéutica de los
microbios terapéuticos activados localmente más allá del tumor primario. Sin
embargo, se necesitará más trabajo para optimizar el momento, la dosis y la
identidad molecular de la liberación de la terapia activada por FUS para cada
aplicación. Para mejorar la eficacia terapéutica, puede ser beneficioso combinar
terapias bacterianas activadas por FUS con otras terapias moleculares o celulares.
Por ejemplo, las bacterias modificadas y las células inmunitarias tienen perfiles
de injerto y de entrada al tumor distintos ya menudo complementarios. La
ingeniería de microbios que ingresan con éxito en regiones tumorales
inmunodeprimidas para secretar inhibidores de puntos de control o citocinas
podría ayudar a que este entorno sea más accesible para las células T
modificadas. De este modo, las bacterias y las células T pueden ejercer
sinérgicamente su función terapéutica de adentro hacia afuera y de afuera hacia
adentro, respectivamente. Más allá de la terapia tumoral, los agentes bacterianos
activados localmente tienen una utilidad potencial en una amplia gama de otras
aplicaciones biomédicas. Por ejemplo, los cambios de estado controlados por FUS
podrían ser útiles para controlar la actividad de los microbios intestinales in vivo
74, la función de los materiales vivos basados en células in vitro75–78, y en
ingeniería metabólica industrial27,79.
Métodos
Todos los procedimientos con animales se realizaron bajo un protocolo aprobado por el Comité
Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Tecnológico de California (IACUC).
Construcción de plásmidos y biología molecular.Todos los plásmidos se diseñaron con
SnapGene (GSL Biotech) y se ensamblaron mediante reactivos de New England Biolabs
para mutagénesis KLD (E0554S) o Gibson Assembly (E2621L). Después del montaje,
las construcciones se transformaron en NEB Turbo (C2984I) y NEB Stable (C3040I)
E. colipara el crecimiento y la preparación de plásmidos. El gen que codifica la recombinasa
Bxb1 fue un amable regalo de Richard Murray (Caltech). Integrated DNA Technologies sintetizó
otros genes y todos los cebadores de PCR. Los plásmidos que contienen los genes αCTLA-4,
αPD-L1 y Axe-Txe fueron amables obsequios de Tal Danino (Universidad de Columbia).
Preparación de líneas celulares para experimentos in vitro e in vivo.Los plásmidos que contenían
circuitos genéticos modificados se transformaron en Nissle 1917E. coli (Mutaflor®).Las células
de Nissle se cultivaron en caldo LB (Sigma) y se cultivaron en placas de agar LB (Sigma) que
contenían los antibióticos apropiados. Se recogieron colonias individuales en caldo LB y se
cultivaron durante la noche en una incubadora con agitación (30 °C, 250 rpm). Al día siguiente,
las mediciones de densidad óptica (OD600) y los cultivos saturados se diluyeron a 0,1 OD600.
Luego se permitió que los cultivos diluidos crecieran hasta la fase exponencial hasta que
alcanzaron 0.6 OD600antes de comenzar los ensayos. Las medidas de densidad óptica se
tomaron usando un Nanodrop 2000c (Thermo Scientific) en modo cubeta.
mancha occidental.Se recogieron cinco mililitros de medio celular para cada muestra y se
concentraron con un Amicon®Unidad de filtrado centrífugo Ultra-15. Luego se mezcló el medio
celular concentrado con tampón de carga de Laemmli y BME antes de cargarlo en un gel SDS-
PAGE de poliacrilamida prefabricado (Bio Rad) y se corrió a 75 V durante 140 min. La
transferencia de Western se realizó utilizando el aparato Transblot Turbo y el kit de membrana
de nitrocelulosa (Bio Rad). La transferencia se realizó a 25 V durante 7 min. Las membranas se
bloquearon con leche Blotto al 5% (Santa Cruz Biotechnology) en TBS-Tween al 0,05% durante 1
h a temperatura ambiente. La tinción primaria se realizó usando una dilución 1:200 del
anticuerpo de ratón anti-His sc-8036 (Santa Cruz Biotech) durante la noche a 4 °C. A
continuación, las transferencias se lavaron tres veces durante 15 min a 4 °C con TBS-Tween al
0,05 % y se tiñeron durante 4 h con una dilución 1:1000 de la proteína de unión a IgG kappa de
ratón (m-IgGκ BP) conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP). (Santa Cruz Biotech,
sc-516102) a temperatura ambiente. Después de tres lavados de 15 minutos, la visualización de
HRP se realizó con el reactivo Super Signal West Pico PLUS (Thermo Fisher Scientific). La
formación de imágenes se realizó en un generador de imágenes de gel Bio-Rad ChemiDoc MP.
Se adquirió una imagen de luz blanca epi posterior de la transferencia con el mismo aumento
para visualizar los estándares de peso molecular teñidos.
Ensayo de regulación térmica.Una vez que los cultivos de células bacterianas alcanzaron
aproximadamente 0,6 OD600, se transfirieron alícuotas de 50 μL de cada muestra a tiras de PCR
Bio-Rad individuales con tapas ópticamente transparentes y posteriormente se calentaron en
condiciones específicas para el experimento utilizando un termociclador Bio-Rad C100 Touch
con la tapa ajustada a 50 °C. Después del calentamiento, las células continuaron incubando
durante la noche sin ser molestadas a 30 °C (Fig.1) o 37 °C (Figs.2–4). A continuación, se
retiraron las tiras de PCR, se agitaron en vórtice y se centrifugaron, y se midió la fluorescencia
verde de cada una de las muestras utilizando el Strategene MX3005p qPCR (Agilent) y un filtro
FAM sin amplificar. Para medir la densidad celular, las muestras se diluyeron 1:4 con medio LB
fresco (sin antibiótico) y luego se transfirieron a pocillos individuales de una placa de 96 pocillos
(Costar negro/fondo transparente). Las medidas de densidad óptica se tomaron utilizando el
lector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices). Con el fin de cuantificar la expresión génica
dependiente de la temperatura (MI)usando fluorescencia con sustracción de fondo,
ODnormalizada (Figs.1b-d, f,2c), ecuación. (1) se utilizó:
Fmuestra F vacío
mi¼ - d1Þ
sobredosismuestra sobredosisvacío
En esta ecuación, definimosFcomo la medición de fluorescencia sin procesar y
sobredosises el OD600medida de la muestra. El valor de la fluorescencia en blanco y

8 COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA| (2022)13:1585 | https://doi.org/10.1038/s41467-022-29065-2 | www.nature.com/naturecommunications

COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | https://doi.org/10.1038/s41467-022-29065-2 ARTÍCULO

la densidad óptica en blanco se determinó como el promedio denorte =4 muestras de células de Nissle ajustado en tiempo real para mantener la tasa de respiración en 20-30 respiraciones por
no transformadas, a diferencia de las células de Nissle modificadas, en LB. Muestras con normalizadoF minuto. La temperatura corporal se controló continuamente con un termómetro rectal de fibra
muestra<Fvacíofueron registrados comoE = 0. óptica (Neoptix). Cuando fue apropiado, el flanco objetivo se activó térmicamente usando la
configuración FUS automatizada que se describe a continuación, ciclando entre las
temperaturas de 43 °C y 37 °C cada 5 min durante 1 h de calentamiento total. Después del
Pantallas para optimizar el comportamiento del circuito.Para mejorar la regulación
tratamiento con ultrasonido, el ratón se devolvió a su jaula y se midió el tamaño de su tumor
térmica de Bxb1, se solicitó a Integrated DNA Technologies una biblioteca aleatoria de
con un calibrador para rastrear la eficacia terapéutica. Cuando los tumores alcanzaron ~1000
secuencias de RBS, codón de inicio y etiqueta de degradación ssrA. Los productos de
mm3(por debajo de los 1500 mm3tamaño máximo del tumor/carga permitida por nuestro
PCR que incluían la región codificante de Bxb1 y las secuencias circundantes inmediatas
protocolo animal) los ratones se sacrificaron y los tumores se recolectaron para su análisis. Los
se amplificaron usando cebadores personalizados y se insertaron en la columna
ratones que no tenían células microbianas en sus tumores fueron excluidos del estudio.
vertebral del resto del plásmido original usando Gibson Assembly (Fig.2b–d). Esta
biblioteca se transformó en EcN y se sembró en placas de agar LB con resistencia a los
antibióticos a una densidad de colonias baja de aproximadamente 30 colonias por placa Análisis de órganos y tumores.Los tumores y órganos (hígado y bazo) se recogieron y
de Petri. Después de una incubación durante la noche a 30 °C para permitir que las homogeneizaron en diez mililitros de PBS que contenía 2 mg/ml de colagenasa y 0,1 mg/ml de
colonias se hicieran visibles, estas placas se replicaron en dos placas de Petri hijas DNasa durante una hora a 37 °C. Los tejidos homogeneizados se diluyeron en serie y se
utilizando una herramienta de replicación de placas (VWR 25395-380). La placa petri sembraron en placas LB con selección de antibióticos para cuantificar el número de células que
original se incubó a 4 °C hasta la conclusión del experimento. Una placa hija se cultivó colonizaban los tejidos. El porcentaje de células activadas dentro de los tejidos se determinó
durante la noche a la temperatura de referencia de 37 °C, y la otra se incubó a 42 °C contando el número de células positivas para GFP.
durante 1 h y luego se movió a 37 °C durante la noche. Después de que las colonias se
hicieran visibles, se tomaron imágenes de las placas utilizando un filtro de emisión de
Ultrasonido enfocado controlado por retroalimentación.Desarrollamos una
530/28 nm para determinar las colonias que eran fluorescentes a la temperatura de
configuración de control térmico de circuito cerrado para mantener una temperatura
"encendido" pero no a la temperatura de "apagado" (generador de imágenes Bio-Rad
predeterminada específica dentro del tumor de un ratón mediante la modulación de la
ChemiDoc MP).
intensidad del FUS. Esta configuración incluye un baño de agua lleno de agua destilada
pura que se limpia y desgasifica activamente con un acondicionador de agua AQUAS-10
(ONDA) y se mantiene a 33 °C con una cocina de inmersión sous vide (InstantPot Accu
Ensayo de cambio de porcentaje.Se prepararon tiras de muestras de bacterias líquidas y se Slim). Un ratón con tumor que ha sido anestesiado como se describió anteriormente se
incubaron en el termociclador Bio-Rad Touch. Después del estímulo térmico prescrito y la sujeta la nariz verticalmente a un brazo acrílico que está conectado a un sistema de
incubación a 37 °C, las tiras de PCR se retiraron, se agitaron y se centrifugaron en una centrífuga posicionamiento 3D manual (Thorlabs) para permitir la traducción 3D del ratón dentro
de mesa. Luego se realizaron cinco diluciones seriadas 1:10 en LB líquido, transfiriendo 10 μL de del baño de agua. Se utiliza un sistema de posicionamiento motorizado Velmex BiSlide
muestra a 90 μL de medio LB secuencialmente. Después de mezclar a fondo, se sembraron 50 para sumergir y colocar el transductor FUS de 0,67 MHz (Precision Acoustics PA717) de
μL de las muestras más diluidas en una placa LB y se dejaron incubar a 30 °C durante la noche. modo que el punto focal del transductor se encuentre dentro del tumor del ratón. Un
Tras la aparición de colonias visibles, se tomaron imágenes de las placas utilizando el mismo generador de señal (B&K #4054B) genera la señal de ultrasonido térmico que luego se
generador de imágenes Bio-Rad ChemiDoc MP con iluminación de epifluorescencia azul y filtros amplifica (AR #100A250B) y se envía al transductor de ultrasonido. El agua en esta
de emisión de 530/28 nm. El porcentaje de colonias en el 'estado activado' (PAGS)se determinó cámara actúa como medio de acoplamiento para transferir la onda de ultrasonido del
de acuerdo con la Ec. (2): transductor al tumor. Para medir la temperatura interna del tumor durante una sesión
de calentamiento, implantamos temporalmente una sonda de temperatura de fibra
número de colonias GFP positivas contadas en una placa óptica delgada (Neoptix, T1) en el tumor. La sonda de pedido personalizado tiene una
PAGS¼ d2Þ
número total de colonias contadas en una placa punta de detección con un diámetro de 400 µm y una longitud de <2 mm. Para insertar
la sonda en los tumores, seguimos el siguiente procedimiento, como se ilustra en la Fig.
8 complementaria: (1) rasurar el tumor antes de colocar el ratón en un soporte, (2)
Citometría de flujo.Las células EcN se incubaron durante 24 h antes de analizarlas con un insertar una aguja de calibre 25 en el tumor para guiar el punta de prueba termal frágil,
citómetro de flujo (MACSQuant VYB) que se limpió a fondo para garantizar que no se detecten (3) inserte la sonda de fibra óptica en el camino creado por la aguja y asegure la sonda
recuentos de desechos. Las células EcN se resuspendieron en PBS frío + BSA al 0,5 % (filtradas con cinta adhesiva. Esta lectura de temperatura también se utiliza para alinear el foco
con un filtro de 0,2 micras) para evitar la formación de grumos y se analizaron en 3 diluciones del transductor con el tumor mediante la emisión de una señal de ultrasonido térmico
diferentes (dirigidas a 1e6, 1e7 y 1e8 células/ml). de prueba constante. Una vez que el sistema está alineado, ejecutamos un script de
control térmico de circuito cerrado de MATLAB que regula la salida del generador de
señal. La retroalimentación para el controlador es proporcionada por las mediciones de
Procedimientos animales.Se adquirieron ratones BALB/cJ hembra de 8 a 12 semanas de edad de Jackson Laboratory para su uso en estos experimentos in vivo. Todas las
temperatura adquiridas con una frecuencia de muestreo de 4 Hz. El actuador para el
instalaciones principales se mantienen libres de patógenos específicos. Los roedores se alojan en sistemas de jaulas con microaisladores con filtros HEPA en hasta cinco ratones
controlador es la amplitud de voltaje de la señal sinusoidal continua a 0,67 MHz utilizada
por jaula. Las condiciones ambientales, como la temperatura, la humedad y la iluminación, se regulan y controlan para garantizar el nivel y la consistencia adecuados. Hay una
para impulsar el transductor FUS, donde el voltaje se ajusta también a 4 Hz. La presión
sonda de temperatura en al menos una salida de aire de escape por habitación y se monitorea las 24 horas del día. El agua purificada por ósmosis inversa (RO) se proporciona
acústica del transductor tuvo que ajustarse ligeramente para cada ratón, pero por lo
ad libitum a los roedores a través de botellas de agua. El alimento (PicoLab Rodent Diet 5053) se recibe irradiado para eliminar bacterias y virus dañinos y se proporciona ad
general se mantuvo entre 0,6 y 0,7 MPa (campo libre). El campo de presión acústica
libitum a través de tapas de jaulas de alambre de acero inoxidable con comederos integrales. Especificaciones ambientales para salas de alojamiento de ratones, incluidos los
generado por el transductor de 670 kHz cerca de su foco acústico se midió utilizando un
valores máximos y mínimos de temperatura y humedad son registrados diariamente por un miembro del personal de cuidado de los animales utilizando un dispositivo de
hidrófono de fibra óptica calibrado de baja frecuencia de Precision Acoustics conectado
control de temperatura digital portátil que funciona con baterías. La temperatura ambiente se mantiene entre 71 y 75 grados F de acuerdo con las necesidades fisiológicas de
a una etapa traducible deslizante Velmex X. El hidrófono de fibra óptica se desgasificó al
los animales, y la humedad se mantiene entre 30 y 70 %. El ciclo de iluminación para todas las instalaciones es de 13 h encendido y 11 h apagado (ciclo de luz de 6:00 a. m. a 7:00
baño maría mediante un sistema de acondicionamiento de agua Onda a temperatura
p. m.). Todo el aire proporcionado a las instalaciones principales para animales se filtra y no se recircula. Las instalaciones para animales en Caltech están en el lugar y están
ambiente. Se midió que la presión negativa máxima en el punto focal era de 0,6 MPa
totalmente acreditadas por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Laboratorio Internacional (AAALAC). Todos los experimentos que involucran animales
dado un voltaje de activación de 35 V pico a pico. El ancho total a la mitad de la presión
son revisados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Caltech y están sujetos a una revisión anual. Establecer modelos tumorales A20 en ratones, 5 ´ 10 dispositivo de
máxima se midió en 3,5 mm en la dirección transversal y 35 mm en la dirección
control de temperatura digital que funciona con pilas. La temperatura ambiente se mantiene entre 71 y 75 grados F de acuerdo con las necesidades fisiológicas de los animales,
longitudinal (Figura complementaria 7, a, b). El sistema utiliza un controlador PID con
y la humedad se mantiene entre 30 y 70 %. El ciclo de iluminación para todas las instalaciones es de 13 h encendido y 11 h apagado (ciclo de luz de 6:00 a. m. a 7:00 p. m.). Todo
control anti-windup que modifica la amplitud de la forma de onda del ultrasonido
el aire proporcionado a las instalaciones principales para animales se filtra y no se recircula. Las instalaciones para animales en Caltech están en el lugar y están totalmente
térmico para lograr la temperatura deseada en los tejidos objetivo. El Kp, Ki, Kd,
acreditadas por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Laboratorio Internacional (AAALAC). Todos los experimentos que involucran animales son

revisados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Caltech y están sujetos a una revisión anual. Establecer modelos tumorales A20 en ratones, 5 ´ 10 dispositivo de

control de temperatura digital que funciona con pilas. La temperatura ambiente se mantiene entre 71 y 75 grados F de acuerdo con las necesidades fisiológicas de los animales, Estadísticas y réplicas.Los datos se grafican y se informan en el texto como la media ± SEM El tamaño de
y la humedad se mantiene entre 30 y 70 %. El ciclo de iluminación para todas las instalaciones es de 13 h encendido y 11 h apagado (ciclo de luz de 6:00 a. m. a 7:00 p. m.). Todo la muestra esnorte =4 réplicas biológicas en todos los experimentos in vitro a menos que se indique lo
el aire proporcionado a las instalaciones principales para animales se filtra y no se recircula. Las instalaciones para animales en Caltech están en el lugar y están totalmente contrario. Este tamaño de muestra se eligió en base a experimentos preliminares que indicaban que sería
suficiente para detectar diferencias significativas en los valores medios.PAGSLos valores se calcularon
acreditadas por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Laboratorio Internacional (AAALAC). Todos los experimentos que involucran animales son revisados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Caltech y están sujetos a una revisión anual. Establecer modelos tumorales A20 en ratones, 5 ´ 10 La temperatura ambiente se mantiene entre 71 y 75 grados F de ac

Se recogieron células A20 [TIB-208, ATCC] y se suspendieron en 100 μL de solución salina utilizando un modelo no apareado de dos colas.t-prueba.
tamponada con fosfato (PBS) antes de la inyección subcutánea en el flanco de cada ratón.
Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 100 mm3, las células EcN
Resumen de informes.Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes
modificadas preparadas de acuerdo con el procedimiento descrito en la sección anterior
de investigación de Nature vinculado a este artículo.
"Preparación de líneas celulares para experimentos in vitro e in vivo" se recolectaron luego por
centrifugación (3000 g durante 5 min), se lavaron con PBS tres veces y se diluyeron en PBS. a
0,625 DE600. Se inyectaron 100 μL de la solución resultante en cada uno de los ratones que Disponibilidad de datos
portaban el tumor A20 a través de la vena de la cola. Para algunas condiciones, a los ratones se Todos los datos están disponibles en el artículo, en la información complementaria o en el archivo de datos fuente proporcionado
les inyectó una combinación de inhibidores de puntos de control de αCTLA-4 (200 µg por ratón) con este documento. Los datos de origen se proporcionan con este documento.
y αPD-L1 (100 µg por ratón) por vía intraperitoneal. Estos inhibidores de puntos de control
murinos (αCTLA-4 clon 9D9 y αPD-L1 clon 10 F.9G2) se obtuvieron de BioXCell. Para la activación
térmica mediante ultrasonidos, los ratones se anestesiaron con una mezcla de aire e isoflurano Disponibilidad de código
al 2 % y se colocaron en un soporte para animales específico. La anestesia se mantuvo durante El código personalizado utilizado para operar el sistema de ultrasonido enfocado está disponible en un
el transcurso del procedimiento de ultrasonido utilizando isoflurano al 1-1,5%, repositorio de GitHub [https://github.com/drmittelstein/thermal_control].

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ARTÍCULO
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Enterococcus faecium.mol. Microbiol47,1419–1432 (2003). Foundation, el Army Institute for Collaborative Biotechnologies (W911NF-19-D-0001) y la
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para la implementación de redes de genes sintéticos en Escherichia coli.iCiencia14,323– beca de investigación de posgrado de la NSF. MHA también recibió el apoyo de Paul and Daisy
334 (2019). Soros Fellowship for New Americans. AB-Z. fue apoyado por el programa de investigación e
59. Sleight, SC y Sauro, HM Visualización de la dinámica de estabilidad evolutiva y innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el Marie Skłacuerdo de subvención
aptitud competitiva de Escherichia coli diseñada con circuitos multigénicos odowska-Curie No. 792866. La investigación relacionada en el laboratorio de Shapiro cuenta con
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