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Artículos

Medida en serie deTuberculosis M.en sangre de pacientes

críticamente enfermos con tuberculosis asociada al VIH
David A. Barr,a,b*Carlota Schutz,a,gramoavuyonke balfour,amuki shey,a,gramoMireille Kamariza,dCarolyn R. Bertozzi,mi,F
Timothy J. de Wet,Cryan dinkele,Csala de Amy,a,gramoKathryn A. Haigh,bJean-Paul Kanyik,a,metroValeria Mizrahi,a,CMarcos P. Nicol,i,j
Roberto J. Wilkinson,a,gramo,h,kDavid G. Lalloo,yoDigby F. Warner,a,CGraeme Meintjes,a,gramo,1y Gerry Davisb,1

aWellcome Center for Infectious Diseases Research in Africa (CIDRI-Africa), Instituto de Enfermedades Infecciosas y Medicina Molecular,
Universidad de Ciudad del Cabo, Observatorio 7925, Sudáfrica
b Instituto de Infecciones y Salud Global, Universidad de Liverpool, Liverpool L7 3EA, Reino Unido
C SAMRC/NHLS/UCT Unidad de Investigación de Micobacteriología Molecular, Instituto de Enfermedades Infecciosas y Medicina Molecular y
Departamento de Patología, Universidad de Ciudad del Cabo, Observatorio 7925, Sudáfrica
dDepartamento de Biología, Universidad de Stanford, Stanford, CA 94305, EE. UU.
miDepartamento de Química, Universidad de Stanford, Stanford, CA 94305, EE. UU.
F Instituto Médico Howard Hughes, Universidad de Stanford, Stanford, CA 94305, EE. UU.
gramoDepartamento de Medicina, Universidad de Ciudad del Cabo, Observatorio 7925, Sudáfrica
h Instituto Francis Crick, Londres NW1 1AT, Reino Unido
iDivisión de Infecciones e Inmunidad Escuela de Ciencias Biomédicas, Universidad de Australia Occidental, Perth, Australia,
jDivisión de Microbiología Médica, Universidad de Ciudad del Cabo, Ciudad del Cabo, Sudáfrica
k Departamento de Enfermedades Infecciosas, Imperial College, Londres W12 0NN, Reino Unido
yoEscuela de Medicina Tropical de Liverpool, Pembroke Place, Liverpool L3 5QA, Reino Unido
metro Hospital Khayelitsha, Departamento de Medicina, Ciudad del Cabo, Sudáfrica

Resumen
FondoA pesar de ser altamente prevalente en pacientes hospitalizados con tuberculosis (TB) grave asociada al VIH y sepsis,
eBioMedicine 2022;78:
se sabe poco sobre la micobacteriología deTuberculosis micobacterianainfección del torrente sanguíneo (MTBBSI).
103949
Desarrollamos métodos para medir en serie la carga bacilar en sangre y los usamos para caracterizar la respuesta de
Publicado en línea 21
MTBBSI a la terapia antituberculosa (ATT) y la relación con la mortalidad. marzo 2022
https://doi.org/10.1016/j.
MétodosEstablecimos un método de microscopía para la visualización directa deTuberculosis M.bacilos en sangre utilizando un ebiom.2022.103949
nuevo protocolo de concentración de lisis y la sonda fluorescente, 4-N,N-dimetilaminonaftalimida-trehalosa (DMN-Tre). Probamos
sangre usando GeneXpert-Cultivo lítico de MTB/RIF-Ultra (Xpert-ultra) y Myco/F después de procesar la sangre a través de pasos de
lisis y lavado para eliminar los inhibidores de PCR y el arrastre de fármacos antimicrobianos. Los pacientes seropositivos con
pronóstico de MTBBSI dieron muestras de sangre 0, 4, 24, 48 y 72 h después del inicio de la ATT. Las cargas bacilares se cuantificaron
mediante microscopía, umbral de ciclo Xpert-ultra y tiempo de cultivo hasta la positividad. La farmacodinámica se modeló utilizando
estas medidas combinadas en una escala ordinal, incluida la asociación con la mortalidad a las 12 semanas.

RecomendacionesTuberculosis M.se detectó en 27 de 28 participantes reclutados; 25 (89%) por sangre Xpert-ultra, 22 (79%) por
microscopía DMN-Tre y 21 (75%) por hemocultivo lítico Myco/F. Ocho (29%) participantes murieron a las 12 semanas de seguimiento.
En un modelo farmacodinámico combinado, las probabilidades previstas de microscopía DMN-Tre negativa, Xpertultra de sangre o
hemocultivo después de 72 h de tratamiento fueron 0¢64, 0¢27 y 0¢94, respectivamente, en los que sobrevivieron, en comparación
con 0¢23, 0¢06 y 0¢71 en los que fallecieron (probabilidad posterior de depuración más lenta de MTBBSI en los que fallecieron
> 0¢99). La microscopía de sangre DMN-Tre demostró morfologías bacilares heterogéneas, incluidas microcolonias y grumos. La longitud de
las células bacilares varió significativamente con la exposición a ATT (aumento medio de la longitud de las células 0¢13 registro- µm/día;
95%CrI 0¢10-0¢dieciséis).

InterpretaciónLa farmacodinámica del tratamiento con MTBBSI se puede capturar mediante microscopía DMN-Tre, sangre Xpertultra
y cultivo. Esto podría facilitar los ensayos de intervención en la TB grave asociada al VIH.

FondosWellcome Trust, NIH Fogarty International Center, MRC de Sudáfrica, NIHR (Reino Unido), Fundación Nacional de
Investigación de Sudáfrica.

* Autor para correspondencia en: Instituto de Infecciones y Salud Global, Universidad de Liverpool, Liverpool L7 3EA, Reino Unido. Dirección de
correo electrónico:david.barr@liverpool.ac.uk (DA Barr).

1Autores principales conjuntos.

www.thelancet.com Vol 78 Mes Abril, 2022 1

 Artículos
Derechos de autor-2022 Los Autores. Publicado por Elsevier BV Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY (
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)
Palabras clave:tuberculosis asociada al VIH; Farmacodinamia; Septicemia; infección del torrente sanguíneo; Enfermedad crítica
Investigación en contexto
Evidencia antes de este estudio
Se realizaron búsquedas en PubMed con los términos [("Blood
stream injection" OR BSI OR bacter?emia OR septic?emia) AND
(tuberculosis OR TB)] OR [mycobacter?emia] el 2021-12-01 sin
restricción de fecha o idioma.Tuberculosis M.infección del
torrente sanguíneo (MTBBSI) está presente en el 30-50% de los
adultos ingresados en el hospital con tuberculosis (TB) asociada
con el VIH y se asocia con un riesgo de muerte dos veces mayor
en comparación conTuberculosis M.enfermedad con hemocultivo
negativo. MTBBSI también es la principal causa de sepsis en
estudios de África subsahariana. MTBBSI y otros marcadores de
diseminación sistémica se han asociado con fenotipos adversos
de respuesta del huésped por parte de varios grupos.
A diferencia de otras formas de TB de alta mortalidad, como la
meningitis tuberculosa, no se encontraron ensayos de intervención
dedicados al tratamiento de la MTBBSI. Se encontraron dos estudios
pequeños que informaron la cuantificación de MTBBSI mediante el
recuento de unidades formadoras de colonias y ningún estudio en el
que se hubiera realizado una cuantificación en serie o donde se
observara el tiempo hasta la eliminación de MTBBSI durante el
tratamiento, o donde se evaluara la farmacodinámica del tratamiento
de MTBBSI. No se encontraron estudios en los que se usara con éxito la
microscopía directa de sangre para visualizarTuberculosis M.bacilos en
sangre.
Valor añadido de este estudio
Una novela 4-N,N-El método de microscopía de
dimetilaminonaftalimida-trehalosa permite visualizar
directamente los bacilos de la TB en las muestras de sangre de los
pacientes. Usando esta técnica, combinada con el umbral del ciclo
Xpert-ultra de sangre y el tiempo de positividad del hemocultivo
de TB, informamos la farmacodinámica de MTBBSI por primera
vez. La bacteriemia por TB sigue siendo detectable en la mayoría
de los pacientes después de 72 h de ATT. Algunos pacientes con
MTBBSI tienen concentraciones notablemente altas de bacilos en
la sangre, lo que se asocia con el fenotipo clínico y los marcadores
de gravedad de la enfermedad. La dinámica adversa de la carga
bacilar en MTBBSI está asociada con la mortalidad en un modelo
farmacodinámico que combina recuentos bacilares de
microscopía DMN-Tre, valores de umbral de ciclo Xpert-ultra de
sangre y tiempo de positividad de hemocultivo lítico Myco/F en
diferentes puntos de tiempo después del inicio de ATT.
Implicaciones de toda la evidencia disponible
SangreTuberculosis M.la carga bacilar puede medirse en serie en
pacientes en estado crítico con tuberculosis asociada al VIH y está
relacionada con la gravedad de la enfermedad y el riesgo de muerte.
Las medidas seriadas de MTBBSI son un biomarcador farmacodinámico
plausible que proporcionaen vivolecturas de respuesta a
2 www.thelancet.com Vol 78 Mes Abril, 2022
terapia. Esto motiva la realización de ensayos de intervención diseñados
para optimizar el ATT en una población de pacientes previamente
excluida de los ensayos a pesar de representar una fracción elevada de
muertes en personas que viven con el VIH.
Introducción
La TB es la principal causa de ingreso hospitalario, sepsis,
bacteriemia, enfermedad crítica y muerte en personas que viven con
el VIH.1-6La TB grave asociada con el VIH se puede caracterizar por
una diseminación bacilar extensa, con inflamación asociada,
señalización de células inmunitarias innatas, disfunción orgánica
progresiva y alto riesgo de mortalidad temprana.7Tuberculosis M.
infección del torrente sanguíneo
(MTBBSI) es frecuente entre los pacientes en estado crítico
con TB asociada al VIH, y un importante predictor
independiente de mortalidad.5Existe una relación dosis-
respuesta entre la carga bacilar en sangre, el fenotipo
clínico e inmunológico y el riesgo de muerte.7,8
Aparte de los ensayos de diagnóstico,9La TB grave asociada con
el VIH no ha sido el foco de los ensayos de intervención específicos
de terapias para reducir la mortalidad. La idoneidad del tratamiento
antituberculoso (ATT) en la enfermedad asociada al VIH se ha
evaluado predominantemente en pacientes ambulatorios con
baciloscopía positiva y TB pulmonar, y no en pacientes internados en
estado crítico con MTBBSI.10Esto se debe, al menos en parte, a que
los efectos farmacodinámicos de la ATT se evalúan tradicionalmente
mediante la cuantificación en serie deTuberculosis M. en el esputo.
Tales mediciones no se han intentado previamente en otros
compartimentos del cuerpo, incluida la sangre.
Además, a pesar de la importancia del torrente sanguíneo
como sitio de infección en la TB grave asociada con el VIH, se
sabe poco sobre la micobacteriología de MTBBSI, incluida la
ubicación de los bacilos.p.ej,intra o extracelular), sus
morfologías y sus estados fisiológicos. Visualización directa de
morfologías bacterianas bajo diferentes exposiciones
antimicrobianasen vivopuede permitir inferencias de respuestas
farmacodinámicas a nivel de una sola célula; por ejemplo, el
fenotipo de elongación celular visto en una variedad de
patógenos bacterianos en respuesta al estrés.11
Desarrollamos un método que comprende tres innovaciones
clave para medirTuberculosis M.en sangre durante las primeras
72 h de ATT como posibles biomarcadores farmacodinámicos.
En primer lugar, nuestro método de microscopía de lisis-
concentración utiliza la sonda de viabilidad micobacteriana, 4-
N,N- dimetilaminonaftalimida-trehalosa (DMN-Tre). DMN-Tre es
metabolizado por micobacterias y otras actinobacterias a un
micolato de trehalosa que se incorpora

en la membrana externa rica en lípidos, lo que resulta en una
> Aumento de fluorescencia de 700 veces.12En consecuencia, DMN-
Tre tiene especificidad para las actinobacterias (de las cuales las
micobacterias son los únicos patógenos principales de la sangre) e
informa solo organismos viables metabólicamente activos.12
En segundo lugar, se desarrolló un método de lavado de lisis
para eliminar los inhibidores de PCR, lo que permite analizar la
sangre en el GeneXpert.-Plataforma MTB/RIF Ultra (Xpert-ultra,
Cepheid, Sunnyvale, California) con alta sensibilidad.8
En tercer lugar, para permitir el cultivo de sangre después del inicio
de la ATT, redujimos el arrastre de antimicrobianos al eliminar el
plasma o realizar un preprocesamiento de la sangre por lisis y
lavado.
Aplicando estas tres innovaciones,Tuberculosis M. se
midió en serie en sangre durante las primeras 72 h de
tratamiento de la TB en una cohorte de pacientes
hospitalizados con alta probabilidad predicha de MTBBSI.
Describimos la farmacodinámica de ATT en pacientes con
MTBBSI asociado al VIH y evaluamos la asociación con la
mortalidad. También investigamosTuberculosis M.
morfología celularen vivousando el método de microscopía
DMN-Tre de concentración de lisis, y evaluó la carga relativa
de bacilos en diferentes componentes sanguíneos usando
el método de lavado de lisis Xpert-ultra en un subconjunto
de muestras.
Métodos
Diseño del estudio
Se realizó un estudio de cohorte prospectivo con medición
seriada deTuberculosis M.en muestras de sangre tomadas
durante las primeras 72 h de ATT estándar entre el 08/11/2017 y
el 21/11/2017. Las muestras se recolectaron en 5 puntos de
tiempo: 0 h (antes de la primera dosis de ATT y 4, 24, 48 y 72 h
después de la primera dosis de ATT. El resultado del estado vital
a las 12 semanas se determinó por llamada telefónica.
Participantes y entorno
Este estudio se anidó dentro de un estudio de cohorte más grande7
ambientado en el Hospital Khayelitsha, Ciudad del Cabo, un hospital
de 240 camas que atiende a una población con alta seroprevalencia
del VIH e incidencia de tuberculosis. El reclutamiento para el
presente subestudio se enriqueció para pacientes con alta
probabilidad predicha de MTBBSI utilizando un conjunto de modelos
de aprendizaje automático desarrollados con datos del estudio
principal y envueltos en una aplicación basada en la web disponible
para usar al lado de la cama del paciente [ URL:https://
davidadambarr. shinyapps.io/MTBBSI_v2/]. Adultos (mayores de 18
años) con infección por VIH conocida e ingresados en el hospital con
sospecha de nuevo diagnóstico de TB en las últimas 24 h, con al
menos un parámetro clínico sugestivo (Fig. E2, suplemento en línea),
fueron evaluados formalmente e invitados a participar si la
probabilidad predicha de MTBBSI fue
> 0¢6.
www.thelancet.com Vol 78 Mes Abril, 2022
Artículos
Procesamiento de muestras
En cada punto de tiempo, se recogieron 18 ml de sangre en
botellas estériles de heparina sódica; Se centrifugaron 5 mL a
3000 xgramodurante 25 min y el sedimento celular se inoculó
en una botella de cultivo Myco/F Lytic (BD Biosciences) para
reducir el posible arrastre de fármacos antimicrobianos del
plasma. La sangre restante se dividió en alícuotas de 10 mL y 3
mL. Ambas alícuotas se mezclaron con 30 mL de 0,22µTampón
de lisis de glóbulos rojos filtrado con m [NH 155 mM4Cl; NaHCO
12 mM3; EDTA 0,1 mM], se incubaron a temperatura ambiente
durante 30 min con inversiones, luego se sedimentaron a 3000 x
gramodurante 25 min. Este paso de lavado se repitió luego en
45 ml de 0,22µagua desionizada filtrada m. Estos pasos de
lavado se diseñaron para eliminar los fármacos antimicrobianos
libres (para facilitar el cultivo), hemo (un inhibidor de PCR) y
células y desechos de células eucariotas (para facilitar la
microscopía DMN-Tre posterior).
La mitad del sedimento de la alícuota de sangre de 10 ml se
inoculó en una segunda botella Myco/F Lytic y la otra mitad se
almacenó a -20ºC.°C para pruebas posteriores Xpert-ultra. El
sedimento de la alícuota de sangre de 3 ml se resuspendió en 5
ml de caldo Myco/F Lytic que contenía DMN-Tre hasta una
concentración final de 154µM, y la muestra se incubó en la
oscuridad y con agitación durante 18 h a 37°C. Después de la
incubación, la muestra se mezcló con 25 ml de un detergente y
tampón de lisis enzimática [0,22µTriton-X-100 al 0,5 % v/v, agua
desionizada al 1,0 % v/v Tween-80 filtrada m con 0,8 mg/ml de
proteinasa-K añadida] precalentada a 37ºC°C, y se incubó a 37°C
durante 25 min con inversiones, antes de la granulación (3000 x
gramo,25 min) y resuspensión en 2 mL 0,22µm-agua filtrada.
Este paso de lisis se estableció empíricamente a partir de
permutaciones de métodos de lisis publicados y resultó en un
lisado filtrable sin
> 10 % de pérdida de células micobacterianas en muestras
enriquecidas. Luego, la muestra se colocó en un soporte de
ultrafiltración de centrífuga estéril de 13 mm [UFREU1301, Sterlitech
Corporation, Kent WA] precargado con un filtro negro de 0,6 mm de
13 mm.metrom filtro de membrana de policarbonato [PCTB0613100,
Sterlitech Corporation, Kent WA], que luego se centrifugó a 1800 x
gramodurante 10 min. A continuación, los filtros se sellaron dentro
de platos de cultivo celular con fondo de vidrio de 20 mm [801001,
Whitehead Scientific, Ciudad del Cabo] montados en un soporte de
aluminio hecho a medida para la platina del microscopio.
La orina (50 ml) se recogió diariamente, se sedimentó (3000 x
gramo, 25 min), y almacenado a -20°C para pruebas posteriores de
Xpertultra.
Microscopía DMN-Tre
La microscopía DMN-Tre se realizó en un Zeiss Axio
Observer 7 usando el objetivo Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil y
una lente ocular de 10x que proporciona un aumento de 1000x.
Cada membrana se examinó durante 2 h y, si se identificaron
bacilos, se examinaron 500 campos de visión aleatorios (FOV)
identificados por una matriz aleatoria de coordenadas de etapa
con un aumento de 1000x para cuantificar los bacilos en la
membrana. El área de superficie efectiva del
3
 Artículos
Se estimó que la membrana tenía un FOV de 2850 en base a
experimentos con perlas fluorescentes contadas por citometría
de flujo, dando un recuento bacilar:
recuento total de microscopía 2850campo de visión
bacilos ml-1¼ - Las variables de resultados de sangre se eligieron para
campo de visión examinado 3ml
Un microscopista (DAB) realizó el conteo bacilar, con una selección
aleatoria de 138 imágenes digitales capturadas usando el software
de imágenes Carl Zeiss revisado por un segundo analista (KAH) para
evaluar el acuerdo entre evaluadores sobre la clasificación de focos
fluorescentes como bacilos.
Análisis de sangre Xpert-ultra
Las muestras por lotes se descongelaron y analizaron con cartuchos
Xpert-Ultra.8Los resultados completos se generaron desde el
software Xpert como archivos .txt y los valores de umbral de ciclo (Ct)
se extrajeron mediante un script R personalizado. El valor medio de
Ct de los cuatrorpoBsondas se utilizó como valor de resumen; por
rpoBsonda negativa / IS1081-ES6110-muestras positivas ("trazas"
positivas), utilizamos el IS1081-ES6110Valores de Ct para imputar la
mediarpoBvalor Ct de la sonda.8
Hemocultivos líticos Myco/F
Los cultivos de Myco/F Lytic inoculados como se indicó anteriormente
se transfirieron al Servicio Nacional de Laboratorios de Salud (NHLS)
y se incubaron dentro de las 24 h posteriores a la venopunción en el
sistema BACTEC automatizado. El tiempo hasta la positividad (TTP) se
extrajo del software BACTEC.
Separación de componentes sanguíneos en un subconjunto de
muestras Para 10 puntos temporales de pacientes seleccionados al
azar, una muestra de sangre de 5 ml se separó en plasma, una capa
leucocitaria que contenía glóbulos blancos polinucleares y
mononucleares y un sedimento de glóbulos rojos mediante
centrifugación en gradiente de densidad (PolymorphPrep, PROGEN,
Heidelberg, Alemania) Luego, cada subcomponente se procesó para
la prueba Xpert-Ultra utilizando el mismo protocolo que para la
sangre total. Los valores de Ct se compararon por pares entre los
componentes sanguíneos para probar si los bacilos en MTBBSI se
encontraban predominantemente en la capa leucocitaria, como se
esperaría si estuvieran intracelulares dentro de los fagocitos.
métodos de estadística
Para resumir las características de los participantes y proporcionar
representaciones fundamentales de los fenotipos clínicos
potencialmente asociados con la carga bacilar en sangre, se
aplicaron métodos de reducción de dimensiones a las variables
clínicas. Específicamente, los mapas de calor de los hallazgos del
examen clínico de referencia se agruparon jerárquicamente
utilizando la distancia euclidiana y el enlace completo (Rmapa de
puntospaquete), y también reducido a dos dimensiones de variación
usando Análisis de Correspondencia Múltiple (MCA, usando R
factoMineRpaquete). Los resultados de sangre con medidas
continuas se resumieron de manera similar utilizando
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Análisis de Componentes Principales (PCA, usando R
psicoanalizar paquete). La asociación de las dimensiones de
MCA y PCA con medidas de carga bacilar en sangre en el punto
de tiempo 0 se evaluó gráficamente y mediante regresión lineal.
su inclusión en función de la disponibilidad y la
representación teórica de procesos que se sabe que son
marcadores fisiopatológicos importantes en la TB grave
asociada con el VIH o la sepsis del torrente sanguíneo:
hemoglobina (anemia inflamatoria regulada por hepcidina)
13; recuento de plaquetas y volumen plaquetario medio
(desregulación hemostática)14-16; recuento total de glóbulos
blancos y células CD4+ (inflamación e inmunosupresión)17,18;
urea, creatinina y sodio (daño renal y secreción de hormona
antidiurética); variación residual en aspartato transaminasa
(AST) después de ajustar por alanina transaminasa (daño
tisular/lesión mitocondrial),19lactato y glucosa (inflamación
inducida por glucólisis aeróbica acelerada y sepsis).20,21
Como medida de covalidez, la concordancia y la correlación
entre los tres métodos independientes para identificar y
cuantificar el MTBBSI, así como los resultados de Xpertultra en
orina como comparador, se evaluaron mediante el índice kappa
de Cohen y la regresión spline cúbica para los resultados
cuantitativos.
Investigamos la relación entre la dinámica de la carga bacilar
en sangre y la mortalidad en un modelo farmacodinámico
combinado de la siguiente manera. Las tres medidas
cuantitativas de bacilos en sangre (recuento de microscopía de
DMN-Tre, TTP de cultivo de MFL y Xpert-ultra Ct en sangre) se
convirtieron cada una a una escala ordinal que va desde 1 para
una prueba negativa hasta 10 para valores observados de
mayor carga, y regresión en variables:tiempoen días desde el
inicio del tratamiento, cuantificaciónmétodo (microscopía DMN-
Tre, cultivo MFL o sangre Xpert-ultra) y 12 semanasSalir
(sobrevivió o murió). También se incluyeron las interacciones
entre el tiempo y el método, y el tiempo y el resultado, lo que
permitió que variaran las intersecciones y las pendientes, para
evaluar si la carga total de bacilos y/o la tasa de cambio en la
carga de bacilos en el tratamiento variaba entre los niveles de
estas variables categóricas. Se utilizaron efectos aleatorios para
el intercepto y la pendiente por participante. La suposición que
motivaba este enfoque de regresión ordinal era que cada uno
de los tres métodos de cuantificación podía tratarse como
variables indicadoras que informaban sobre una variable latente
no observada, a saber, la carga de bacilos en sangre.22Permitió
que las tres medidas se representaran en la misma escala sin
hacer suposiciones distributivas (es decir,sin asumir que las 3
medidas eran métricas, con varianzas equivalentes bajo
diferentes condiciones evaluadas) y, además, permitió que se
incluyeran valores negativos teniendo en cuenta la no
normalidad de los efectos 'techo' y 'piso', evitando la necesidad
de imputación por debajo del límite -valores de detección.
Además de evaluar cuantitativamente la carga de bacilos en la sangre,
el método de microscopía DMN-Tre permite evaluar los efectos del
tratamiento en los bacilos a nivel de una sola célula. Nosotros

planteó la hipótesis de que la morfología bacilar, específicamente la
longitud celular, podría verse afectada por la exposición a los
antimicrobianosen vivo.Para evaluar la distribución de la longitud de
las células de los bacilos, se capturaron imágenes digitales de
microscopía DMN-Tre y se midieron las longitudes de los bacilos
individuales con la función de línea segmentada en Fiji ImageJ23para
36 muestras de los 10 pacientes con las cargas de bacilos más altas
observadas en microscopía DMN-Tre. El efecto de la exposición a los
antimicrobianos y la heterogeneidad en la longitud de las células
entre los individuos se probó con una regresión lineal de efectos
mixtos modelando la longitud de los bacilos logarítmicos (asumiendo
una distribución logarítmica normal) en función detiempoen días
desde el inicio del tratamiento, con efectos aleatorios para
intersección y pendiente por participante individual.
Todos los modelos de regresión se ajustaron usando un enfoque
bayesiano, con parámetros estimados usando el algoritmo No-U-
Turn-Sampler implementado en Stan y compilado usando elbrms2¢
13¢Paquete de 5 en R.24Se eligieron priores moderadamente
informativos para tres coeficientes beta. Se usó un coeficiente beta
normal (media = 1, SD = 0.5) anterior al resultado de mortalidad,
derivado de sangre Xpert-ultrarpoBDatos de TTP de hemocultivos Ct
y MFL recopilados en un solo punto temporal (día de reclutamiento)
en el estudio principal más grande. Para eltiempocoeficiente beta, se
estableció un valor previo de normal (-0,5, SD = 1) para reflejar la
creencia previa de que, en promedio, era más probable que la
exposición a ATT disminuyera que aumentara el número de bacilos.
Para el modelo de longitud de celda bacilar, una distribución previa
para log longitud de celda enµM se estableció [normal (media = 0,43,
SD = 0,06)], derivado del trabajo de Vijay et al. enTuberculosis M.
mediciones en muestras de esputo de pacientes.25
Los modelos se verificaron mediante inspección gráfica de
distribuciones posteriores contra datos observados, gráficos de
trank, Rhat y estimaciones de muestras efectivas.
Todo el análisis se realizó en R versión 3¢5¢2, con
código y datos disponibles enhttps://github.com/
davidadambarr/serial_mtbbsi.
Ética
Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los
participantes; el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de
Investigación Humana de la Universidad de Ciudad del Cabo (ref.
057/2013, enmienda del 11 de julio de 2017).
Papel de la fuente de financiación
Los patrocinadores del estudio no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio,
la recopilación de datos, el análisis de datos, la interpretación de datos o la
redacción del informe.
Resultados
Se reclutaron veintiocho pacientes con alta probabilidad predicha de
MTBBSI (Fig. E2, suplemento en línea); 19 (68%) eran mujeres, la
mediana de edad fue de 35 años (IQR 30 a 40), la mediana del
recuento de células CD4+ fue de 33 células/mm3(RIQ
www.thelancet.com Vol 78 Mes Abril, 2022
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17 a 72), y 8 (29%) participantes murieron a las 12 semanas de
seguimiento. La mediana de tiempo hasta la muerte fue de 21 días
(rango 1-75 días). Todos los participantes comenzaron con el ATT
estándar (comprimidos de combinación de dosis fija de 4
medicamentos basados en el peso que contienen rifampicina,
isoniazida, etambutol, pirazinamida, según las pautas nacionales),26
excepto un paciente tratado con un régimen ahorrador de isoniazida
y pirazinamida debido a bioquímica hepática anormal, y un paciente
tratado sin etambutol debido a insuficiencia renal. Todos los
participantes tenían TB sensible a la rifampicina confirmada en
pruebas de sensibilidad directa.
Como se esperaba de los criterios de selección, los participantes
estaban gravemente enfermos con alta prevalencia de disfunción
orgánica y marcadores clínicos adversos (Figura 1), incluidos
periféricos fríos, taquipnea, uso de músculos accesorios de la
respiración, deterioro funcional, anemia, daño renal, elevación de
AST independiente de la variación en ALT y trombocitopenia con
aumento del volumen plaquetario medio (lo que implica destrucción
de plaquetas en lugar de insuficiencia de la médula ósea). Incluso
dentro de este estrato de pacientes gravemente enfermos, los
componentes principales de la variación en el fenotipo clínico se
correlacionaron con las medidas de la carga bacilar de MTBBSI y el
resultado (probabilidades posteriores de tamaño del efecto distinto
de cero > 0,9,Figura 1).
Los resultados de al menos dos de los tres ensayos de MTBBSI
estaban disponibles para 116 (83 %) de los 5 puntos temporales en
28 pacientes (140 puntos temporales de pacientes). Se detectó
MTBBSI en al menos una muestra de 27 (96 %) participantes. En
general, de los 114 resultados disponibles de la prueba de sangre
Xpert-ultra, 81 (72 %) fueron positivos; de 99 resultados de
microscopía DMN-Tre disponibles, 72 (72%) mostraron bacilos; y de
117 puntos de tiempo con resultado de hemocultivo MFL disponible,
53 (45%) tuvieron -1 botella de recuperaciónTuberculosis M. (Figura 2
A). El acuerdo entre evaluadores para imágenes digitales de
microscopía DMN-Tre fue alto (Kappa 0 de Cohen¢86,pag <0¢0001).
La proporción de resultados positivos de la prueba permaneció
alrededor del 75 % para la microscopía de sangre Xpert-ultra y DMN-
Tre después de 72 h de ATT, mientras que la positividad del
hemocultivo MFL disminuyó del 68 % al inicio al 29 % a las 72 h (
Figura 2B). La carga bacilar de MTBBSI disminuyó con el tiempo en la
mayoría de los pacientes, independientemente del método de
cuantificación (Figura 2D). Las tres cuantificaciones de MTBBSI
mostraron una fuerte correlación por pares, pero con evidencia de
no linealidad (Figura 2MI).
Los tres ensayos MTBBSI se escalaron en categorías ordinales
que van desde 1 (muestra negativa) a 10 (correspondiente al
recuento bacilar de DMN-Tre más alto observado, los valores más
bajos de TTP de cultivo Xpert-ultra Ct y MFL en sangre) y se
modelaron conjuntamente en un análisis de regresión ordinal que
resume farmacodinámica de MTBBSI durante los primeros 3 días de
ATT (figura 3). A partir de este modelo, hubo pruebas sólidas de que,
en promedio, la carga bacilar de MTBBSI disminuyó durante los
primeros 3 días de tratamiento: la probabilidad de una carga de
bacilos de categoría ordinal más alta se redujo con el tiempo de
tratamiento (odds ratio para una distribución ordinal más alta por
aumento de 1 día en tiempo desde el inicio de la terapia 0¢56, 95%
intervalo de credibilidad 0¢38 a
5
 Artículos

Figura 1.Descripción del fenotipo clínico y relación con el resultado y marcadores de MTBBSI
una.Mapa de calor de los signos clínicos binarios de la evaluación inicial en el momento del reclutamiento (mosaico negro = presente, mosaico blanco = ausente). Par-
los participantes (filas) y los signos clínicos (columnas) están agrupados jerárquicamente (indicados por dendrograma de fila), con dos grupos de participantes de nivel
más alto indicados por una clave de color (grupo A, diez filas superiores, verde; grupo B, 18 filas inferiores, azul) . El estado del resultado de 12 semanas de cada
participante y los resultados de la cuantificación de MTBBSI desde el día del reclutamiento también se muestran en una escala de color amarillo marino para indicar el
nivel de correspondencia con los datos de signos clínicos agrupados. La figura muestra que el fenotipo clínico del paciente observado desde la cabecera y clasificado por
un algoritmo de agrupamiento no supervisado se corresponde estrechamente con las medidas de carga bacilar en sangre y el riesgo de mortalidad.b.Los mismos datos
de signos clínicos que los anteriores representados en dos dimensiones usando Análisis de Correspondencia Múltiple (MCA). Cada punto es un participante, con el
estado del resultado de 12 semanas indicado por el color de relleno y la pertenencia al grupo del panel A indicada por la forma y el color del contorno. También se
muestran las proyecciones de los marcadores de la carga bacilar de MTBBSI en este espacio MCA: el coeficiente de correlación de Pearson con las dimensiones 1 y 2 de
MCA se indica con una punta de flechaXyycoordenadas respectivamente. Las siguientes tablas muestran los coeficientes beta de regresión para los modelos univariables
que retroceden los marcadores de la carga bacilar de MTBBSI y el resultado de 12 semanas en las dimensiones 1 y 2 de MCA, respectivamente.C.Histogramas de
densidad que muestran la distribución de 12 resultados de sangre clave por estado de resultado de 12 semanas.d.Análisis de componentes principales con rotación
varimax que resume las mismas 12 variables. Las variables en las que los valores más altos observados se asocian con un estado clínico más adverso están coloreadas
en amarillo; las variables en las que los valores más bajos son generalmente más adversos están coloreadas en azul; y las variables en las que el trastorno fuera del
rango normal en cualquier dirección es adverso están coloreadas en gris.mi.Proyección de individuos y marcadores de carga bacilar de MTBBSI en el espacio PCA de
análisis de sangre bidimensional, con modelos lineales univariables que retroceden marcadores de carga bacilar de MTBBSI y resultado de 12 semanas en PC 1 y 2
respectivamente.
Hb = hemoglobina; MCHC = concentración media de hemoglobina corpuscular; plaquetas = recuento de plaquetas x109/L; MPV = volumen plaquetario
medio; wcc = recuento total de glóbulos blancos x109/L; cd4 = recuento de células CD4+ células/mm3; urea = urea sérica mmol/L, creat = creatinina sérica
umol/L; Na = sodio sérico mmol/L; AST = aspartato transaminasa U/L; lactato = lactato venoso mmol/L; glucosa = glucosa venosa mmol/L. AST_resid =
variación residual en aspartato transaminasa después de ajustar por alanina transaminasa.

0¢82, con 0¢998 probabilidad posterior de que esta razón de probabilidades 3¢1; 95%CrI 1¢2 a 7¢7; probabilidad O >1 = 0¢994), y alguna
fuera inferior a 1). Los participantes que fallecieron tenían una mayor evidencia de que el cambio a una distribución ordinal de carga
probabilidad de una distribución ordinal de carga bacilar más alta en todos los bacilar más baja ocurrió más lentamente en los que fallecieron (OR
puntos de tiempo en comparación con los que sobrevivieron (OR para la interacción entre el tiempo en tratamiento y el fallecimiento).

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 Artículos

Figura 2.Resultados de la cuantificación en serie de MTBBSI durante los primeros 3 días de terapia antituberculosa
Resultados cualitativos y cuantitativos de tres métodos de detección de MTBBSI, con resultados de orina Xpert-ultra como comparación.una.Gráfico de tiempo que
muestra los resultados cualitativos por punto de tiempo del paciente. pid = Número de identidad del paciente del estudio. Faltan datos de 20 puntos de tiempo de
pacientes porque cualquiera de los pacientes había muerto (norte =3), o no estaba disponible/rechazó la venesección (norte =17). Las muestras no disponibles restantes
se deben a fallas técnicas, incluida la contaminación y la pérdida de muestras.b.Proporción de resultados positivos de la prueba por tiempo. Se usaron pruebas
disponibles válidas como denominador, como se muestra en la tabla "en riesgo" debajo de la gráfica.C.Concordancia por pares entre los resultados de las pruebas
evaluados por la estadística Kappa de Cohen, con agrupación jerárquica aplicada a los valores de Kappa por pares que se muestran con el dendrograma.d.Resultados
cuantitativos por punto de tiempo. Las líneas conectan datos de participantes individuales. Las muestras negativas no se trazan para el cultivo Xpert-ultra y MFL;
resultados de microscopía DMN-Tre negativos representados como valores 0.mi.Distribuciones univariadas (histograma de densidad para la variable del eje x) y
bivariadas (diagrama de dispersión) de resultados cuantitativos de (D). También se muestra la regresión spline cúbica natural bivariable con tres grados de libertad: la
línea negra indica los valores medianos posteriores ajustados; la banda sombreada es un intervalo del 95% para valores ajustados posteriores. Tal como se evaluó
mediante la validación cruzada de exclusión basada en la probabilidad posterior, los modelos spline cúbicos no lineales tuvieron un ajuste significativamente mejor que
los modelos lineales correspondientes para todas las distribuciones bivariables observadas, con la excepción de la media de sangre » orina.rpoBCt que se incluye solo
como comparador.

resultado 1¢3; 95%CrI 0¢8 a 2¢2; probabilidad O
> 1 = 0¢880) (figura 3C). Para pacientes "promedio" (cero efectos
aleatorios), las probabilidades previstas de microscopía DMN-
Tre negativa, Xpert-ultra de sangre o cultivo de MFL después de
3 días de tratamiento fueron 0¢64, 0¢27 y 0¢94,
respectivamente, en los que sobrevivieron, en comparación con
0¢23, 0¢06 y 0¢71 en los que fallecieron (figura 3B). El tiempo
medio estimado en días hasta que el 50 % de probabilidad de
una muestra negativa de microscopía DMN-Tre, sangre Xpert-
ultra o cultivo MFL extrapolada del modelo fue de 2¢3 (95% CrI,
1¢8 a 2¢8), 4¢8 (95% CrI, 4¢0 a 6¢1), y 1¢0 (95% CrI,
0¢8 a 1¢2), respectivamente, en los que sobrevivieron, en
comparación con 5¢5 (95% CrI, 4¢2 a 7¢6), 11¢5 (95% CrI, 8¢3 a
18¢4), y 2¢2 (95% CrI, 1¢8 a 2¢6) en los que murieron.
Veintidós participantes tenían al menos una muestra de
sangre positiva con microscopía DMN-Tre. El recuento bacilar
máximo observado por participante osciló entre 10 y 23 000
bacilos/mL. La microscopía DMN-Tre reveló heterogeneidad en
las morfologías de los bacilos recuperados de la sangre (Figura
4A). Se observaron microcolonias y células agrupadas en
múltiples muestras de 7 pacientes. Las longitudes de celda se
midieron en imágenes de 1200 bacilos de

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Fig. 3.Modelo de regresión ordinal de la farmacodinámica de la carga bacilar de MTBBSI y su relación con la mortalidad
una.Valores observados para los resultados de cuantificación de MTBBSI en escala ordinal por punto de tiempo, desglosados por método y resultado.
por lo tanto, se muestran con líneas de colores que conectan los resultados de los participantes individuales. Sobre estos datos sin procesar se superponen los valores
pronosticados del modelo de regresión ordinal por las tres variables predictoras de efectos fijos (nivel de población): punto de tiempo, método y estado del resultado. La
línea negra indica el valor medio predicho de 1000 extracciones de las predicciones posteriores del modelo; el área sombreada es el intervalo de predicción del 50 %
(rango intercuartílico para 1000 extracciones de las predicciones posteriores del modelo). Este intervalo de predicción incluye la incertidumbre en la ubicación de los
parámetros a nivel de la población (intersecciones y coeficientes beta), así como la variación residual y los efectos aleatorios para los participantes individuales; por lo
tanto, el intervalo de predicción del 50 % representa valores simulados para nuevos pacientes no observados extraídos de la población de pacientes en estudio.b.
Proporciones esperadas de pacientes en cada categoría de escala ordinal por punto de tiempo, método y estado de resultado según el ajuste del modelo. Estas son
probabilidades posteriores medias para cada categoría ordinal, para un participante "promedio" (es decir,con efectos aleatorios de 0).C.Incertidumbre en los coeficientes
beta de efectos fijos (a nivel de población) del modelo. La distribución posterior de los coeficientes se muestra con diagramas de violín y diagramas de caja (rango, rango
intercuartílico y mediana), en escala logit. Por ejemplo, el valor medio

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Figura 4.Análisis microscópico de morfologías bacilares en sangre mediante fluorescencia DMN-Tre

una.Microscopía DMN-trehalosa de bacilos MTBBSI. Se muestran imágenes de varios pacientes, que han sido ordenados por bacilar
características morfológicas no por paciente. La mayoría de los bacilos fueron 2-4µvarillas curvas de m de largo (panel de la fila superior), pero longitudes de celda de 4-6
µm (panel de la segunda fila) y más largos (panel de la tercera fila). Se muestra la captación de la sonda DMN-Tre homogénea y heterogénea. Se observaron dobletes
(panel de la cuarta fila). Se observaron microcolonias y grumos en algunos participantes (paneles de quinta y sexta fila). También se observaron ocasionalmente
morfologías sugestivas de ramificación (panel de la séptima fila).b.Distribución de longitudes de células medidas para 1200 bacilos en muestras de sangre de 10
participantes. Los anchos de los contenedores son 0.2µmetro.C.Longitud de celda esperada y predicha enµm de la regresión de efectos mixtos de la longitud de la celda
logarítmica en el tiempo en días, con intercepción aleatoria y pendiente por participante. Se muestran la mediana y el intervalo creíble del 95 % para la longitud de celda
mediana (que indica el efecto fijo del tiempo a nivel de la población); las líneas discontinuas exteriores muestran un intervalo de predicción del 95 % en el que se predice
que el 95 % de las longitudes bacilares se encontrarán en un paciente determinado (lo que indica la variación aleatoria entre pacientes más la variación residual).d.
Modele la distribución posterior predicha (diagramas de caja) superpuesta a los valores de longitud de celda observados por participante y punto de tiempo que
demuestra el ajuste del modelo a los datos.

los 10 participantes con mayores cargas bacilares. La mayoría de los
bacilos fueron 2-4µbastones curvos de m de largo, pero bacilos más largos
hasta aproximadamente 10µm se observaron en una distribución
logarítmica normal de longitudes de celda (Figura 4B). Un modelo de
efectos mixtos de estos datos demostró una heterogeneidad significativa
entre pacientes en las longitudes de las células bacilares sanguíneas (entre
0¢24), y un aumento significativo en la longitud bacilar media con la
exposición a ATT (longitud celular media aumentada en 0¢13
registro-µm por día de ATT; 95%CrI 0¢10 a 0¢dieciséis; probabilidad
posterior de aumentar la longitud de la celda por punto de tiempo
> 0¢999,Figura 4CD).
Los valores emparejados de Xpert-ultra Ct fueron más bajos pero similares para la

los participantes sd 0¢13 registro-µmetro; 95%CrI 0¢07 a sangre total en comparación con la sangre blanca de la "capa leucocitaria".

Para elTiempo en días (pendiente)el coeficiente es -0,58; esto indica un cociente de posibilidades de exp(-0,58) = 0,56 para la diferencia en la distribución ordinal de la
carga bacilar hacia la categoría 10, por aumento de 1 día en el tiempo desde el inicio del ATT;es decir,categorías ordinales inferiores con el tiempo. Los pacientes que
fallecieron tenían, en promedio, mayores probabilidades de una distribución de categoría ordinal más alta en comparación con los que sobrevivieron (Murió
(intercepción)coeficiente), y un cambio menos rápido en la distribución ordinal hacia la categoría 1 a lo largo del tiempo en ATT (Tiempo * Interacción muerto (pendiente)
coeficiente). Las distribuciones de escala ordinal de hemocultivos DMN-Tre y MFL en promedio tenían menos probabilidades de una distribución ordinal más alta en
comparación con la sangre Xpert-ultra. La evidencia de que los coeficientes eran diferentes de 0 (efecto nulo) en la dirección indicada se tabula formalmente: la
probabilidad posterior muestra la proporción de la distribución posterior de las estimaciones de coeficientes > o < 0 como se indica; razón de evidencia es la evidencia de
las distribuciones posteriores a favor y en contra de la hipótesis establecida. Por ejemplo, el modelo estima una probabilidad del 99,8% de queTiempo en días (pendiente)
el coeficiente es menor que 0;es decir,que la distribución ordinal cambia hacia la categoría 1 con el tiempo, y 88% de probabilidad de que este cambio sea menos
marcado en los que fallecieron.

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Figura 4Continuado.
fracción celular (la probabilidad posterior de que los valores de Ct en sangre total
fueran en promedio más bajos que los valores de Ct de la capa leucocitaria fue
del 69%); Los valores de Ct en sangre total fueron más convincentemente
inferiores en promedio que los valores de Ct en sedimentos de glóbulos rojos,
mientras que los valores de Ct en plasma fueron los más altos en todos los casos
(Fig. E3, suplemento en línea). En general, el orden de clasificación para los
valores de Ct de [capa leucocítica < sedimento de glóbulos rojos < plasma] tenía
una probabilidad posterior del 93 % en comparación con cualquier otra
permutación.
Discusión
bacteriémicoTuberculosis M.se puede detectar y medir durante
las primeras 72 h de ATT utilizando un nuevo método de
microscopía DMN-Tre cuantitativo, tiempo de cultivo para
10
positividad y análisis Xpert-ultra de sangre preprocesada
usando los métodos descritos. El tiempo de eliminación de
MTBBSI en respuesta a ATT fue significativamente más lento en
pacientes que fallecieron durante las primeras 12 semanas de
tratamiento. Las lecturas cuantitativas en serie de MTBBSI
brindan información de pronóstico sólida y, por lo tanto, deben
considerarse biomarcadores farmacodinámicos potenciales en
la TB grave asociada al VIH.
Los pacientes hospitalizados con TB grave asociada al VIH han
sido excluidos de los estudios de eficacia de la ATT, por lo que la
idoneidad de la ATT estándar no está bien establecida para este
grupo. El riesgo excepcionalmente alto de muerte en esta población
de pacientes: la mortalidad a las 12 semanas es del 30 % en aquellos
con MTBBSI5,7- sugiere que es importante optimizar la eficacia del
tratamiento. Biomarcadores farmacodinámicos
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ofrecen mayor poder estadístico que los resultados dicotómicos
como la mortalidad, aumentando la eficiencia de los ensayos de
fase II y, por lo tanto, acelerando potencialmente el desarrollo
de terapias basadas en evidencia. La correlación de un
biomarcador con el resultado clínico a nivel individual no
garantiza la correlación a nivel de grupo (o brazo de prueba).27
Plausibilidad biológica de que un biomarcador se encuentra en
elcausalvía entre la intervención y el resultado es por lo tanto
deseable, y las lecturas bacteriológicas tienen un fuertea priori
caso de cumplir esta condición.28En apoyo de una relación
causal, encontramos que la carga bacilar en sangre medida con
los métodos novedosos descritos tenía una relación dosis-
respuesta con el fenotipo clínico y la mortalidad, lo que se suma
a la evidencia anterior.[8]
Se han informado previamente dos intentos de cuantificar
MTBBSI, ambos utilizando unidades formadoras de colonias
(UFC) de lisis-centrifugación contando con muestras de sangre
previas al tratamiento.29,30Crump et al. encontró <1 a 150 CFU/
mL (mediana »40) en muestras de sangre de 9 pacientes;
Munseri et al. encontró de 1 a 23 CFU/mL (mediana »3) en 21
muestras de sangre de pacientes. Microscopía directa para
detectarTuberculosis M.en sangre se intentó a principios del
siglo XX, pero posteriormente se abandonó debido a dificultades
técnicas.31Este estudio informa el primer uso exitoso de la
microscopía en sangre, con bacilos identificados en 68 de un
total de 99 muestras de pacientes examinadas. El recuento de
microscopía de DMN-Tre máximo observado por participante
tuvo una distribución sesgada hacia la derecha de hasta 23 000
bacilos/mL. También encontramos morfologías bacilares
heterogéneas, incluida evidencia de microcolonias en muestras
de sangre de pacientes, consistentes con un crecimiento activo.
32Las densidades de bacteriemia superiores a 10 000 bacilos/mL
no son típicas de otros patógenos,33,34pero han sido
denunciados porM.avium complejo.35
Encontramos que la longitud de las células bacilares en la sangre
varía en una distribución logarítmica normal, con una mediana de 3µ
m y rango 1¢2-10µmetro. Esto coincide con las distribuciones de
longitud celular reportadas para bacilos en esputo, lavado bronquial
y bioaerosoles en pacientes con TB pulmonar,25,36,37pero no en las
cavidades pulmonares.36Mostramos una heterogeneidad significativa
en la longitud de las células bacilares en la sangre entre los
pacientes, lo que también replica los informes deTuberculosis M.en el
esputo donde el alargamiento bacilar se ha asociado con estrés del
huésped.25Además, mostramos un aumento significativo en la
longitud de las células durante los 3 días observados de ATT. El
alargamiento aparente deTuberculosis M.bacilli en respuesta al
estrés antimicrobiano sugiere tentativamente la filamentación
(crecimiento sin división) que se ha informado para otras bacterias.11
En conjunto, nuestros resultados sugieren que la microscopía de
sangre DMN-Tre es una herramienta informativa y novedosa que
proporciona información fenotípica de una sola célula relevante para
la patobiología de la TB grave asociada al VIH, en particular, la
respuesta micobacteriana a la exposición a los antimicrobianos.en
vivo.
La diseminación de bacilos a través de la sangre se consideraba un
paso fundamental en la historia natural de la TB en las descripciones
clásicas de la infección desde el período preantimicrobiano.
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Artículos
era.38-40Esto está respaldado por estudios de fisiopatología
contemporáneos.41,42Sin embargo, aún no está claro cómo los bacilos
acceden y se diseminan en la sangre.43En el modelo de pez cebra, los
macrófagos infectados con micobacterias salen de los granulomas y
translocan el endotelio para diseminar sus bacilos intracelulares a
través del torrente sanguíneo.44Los macrófagos infectados pueden
facilitar aún más esto al estimular la angiogénesis en los sitios de
granuloma a través de la secreción de VEGF.45Tuberculosis M.se
detecta en células mononucleares de sangre periférica durante la
infección activa y latente,42,46,47nuevamente lo que implica
diseminación intracelular. Alternativamente, se ha demostrado que
los bacilos libres se adhieren y se trasladan a través de las células
epiteliales y endoteliales.in vitro.48La interacción de las micobacterias
con las células epiteliales del huésped depende de la adhesina de
hemaglutinina que se une a la heparina, cuya pérdida impide esta
diseminación hematógena de bacilos extracelulares en ratones.49
DetectamosTuberculosis M.en todos los componentes sanguíneos
probados, y los valores de Ct fueron similares en muestras
emparejadas de glóbulos rojos y de capa leucocitaria. Esto implica
que, en pacientes con tuberculosis avanzada asociada con el VIH, los
bacilos en el torrente sanguíneo no se encuentran exclusivamente
dentro de las células fagocíticas, sino que pueden diseminarse
extracelularmente o en asociación con los eritrocitos.
Las limitaciones de este estudio incluyen el reclutamiento de un
solo centro y el pequeño tamaño de la muestra con la incertidumbre
resultante en torno a los parámetros clave. Más repeticiones habrían
agregado poder para detectar diferencias, pero estábamos limitados
por lo que se consideraba un volumen seguro para la venopunción.
Debido a que la mayoría de los pacientes siguieron siendo positivos
en la microscopía de sangre Xpert-ultra y DMN-Tre en el último punto
de tiempo observado, la mediana del tiempo hasta la esterilización
de la sangre mediante estos ensayos solo pudo extrapolarse; en el
futuro, se deben evaluar puntos de tiempo posteriores. Sin embargo,
el uso de datos cuantitativos para los tres ensayos en un modelo de
regresión ordinal debería aumentar la confianza en las tendencias
generales. Aunque el método de microscopía DMN-Tre ofrece
avances significativos en la caracterización de MTBBSI y especificidad
relativa para micobacterias, requiere mucha mano de obra y, como
toda microscopía manual, requiere llamadas subjetivas al clasificar
los objetos fluorescentes como bacilos. Cabe destacar que todos los
pacientes que eran DMN-Tre positivos teníanTuberculosis M.
confirmado por cultivo de laboratorio de referencia de al menos una
muestra, lo que reduce el riesgo de resultados falsos positivos. Los
objetivos futuros deben incluir la automatización y adaptaciones de
alto rendimiento de la microscopía DMN-Tre. Finalmente, si bien
brindamos la primera evidencia de que el seguimiento de la carga de
bacilos en la sangre es una métrica farmacodinámica potencial,
dichos biomarcadores solo pueden validarse en ensayos de
intervención.
Colaboradores
Concepción y diseño del estudio: DAB, GM, GD, CS, DGL.
Adquisición de datos clínicos: DAB, CS, AW, J-PK. Métodos de
laboratorio de desarrollo: DAB, MS, MK, CRB, TdW, RD, VM,
DFW. Supervisión de métodos de laboratorio: GM, GD,
11
 Artículos
DFW, VM, MPN, RJW, CRB. Supervisión clínica: CS, GM, GD,
DGL. Adquisición de datos de laboratorio: DAB, MS, AB.
DMN-Tre invención y producción: MK, CRB. Interpretación y
procesamiento de imágenes: DAB, KAH, TdW, RD.
Suministro de instalaciones de laboratorio y
almacenamiento: GM, RJW, DFW. Análisis de datos: DAB con
supervisión de GD, GM, DFW. DAB escribió el manuscrito
con revisión y contribución de todos los coautores. Todos
los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final. Datos
subyacentes verificados por DAB y GD.
Declaración de intercambio de datos
Todos los códigos y datos disponibles enhttps://github.com/
davidadambarr/serial_mtbbsi.
Declaración de intereses
CRB y MK son cofundadores de OliLux Biosciences, que ha licenciado
patentes relacionadas con los dos colorantes presentados en este
documento. Todos los demás autores han declarado que no existe
ningún conflicto de intereses.
Expresiones de gratitud
El personal del Hospital Khayelitsha que facilitó el reclutamiento
y los pacientes que participaron en el estudio. Sr. Kensen
Hirohata de Sterlitech Corporation por su asesoramiento
detallado sobre la tecnología de filtración-concentración. El
profesor Robin Wood de la Universidad de Ciudad del Cabo,
quien brindó asesoramiento y mecanizó el soporte de aluminio
utilizado en microscopía.
DAB respaldado por Wellcome Trust (105165/Z/14/A) y
NIHR (Reino Unido). CS apoyado por el Consejo de
Investigación Médica de Sudáfrica en el marco del
Programa Nacional de Becas de Salud. MK recibió el apoyo
de Diversifying Academia, Recruiting Excellence Fellowship y
NIH Predoctoral Fellowship F31AI129359 de la Universidad
de Stanford. Esta investigación fue apoyada por
subvenciones de la Fundación Bill y Melinda Gates
(OPP115061) y NIH (AI051622) a CRB GM y MS con el apoyo
de Wellcome Trust (098316, 203135 y 211360/Z/18/Z). GM
apoyado por la Iniciativa de Cátedras de Investigación de
Sudáfrica del Departamento de Ciencia y Tecnología y la
Fundación Nacional de Investigación (NRF) de Sudáfrica
(Subvención No 64787). RJW apoyado por el Francis Crick
Institute, que recibe fondos de Wellcome (FC00110218),
Cancer Research UK (FC00110218), el Consejo de
Investigación Médica del Reino Unido (FC00110218). RJW
también recibe apoyo de Wellcome (104803, 203135) y los
Institutos Nacionales de Salud (U01AI115940) y EDCTP (SRIA
2015-1065). MPN respaldado por el Consejo Nacional de
Investigación Médica y de Salud de Australia (1174455). KAH
cuenta con el respaldo de Wellcome Trust (203919/Z/16/Z).
VM apoyado por subvenciones de South African Medical
12
Consejo de Investigación y Fundación Nacional de Investigación
de Sudáfrica.
Materiales complementarios
El material complementario asociado con este artículo se
puede encontrar en la versión en línea en doi:10.1016/j.
ebiom.2022.103949.
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