Inmunidad e Infección

2022-2
Semana 1 - Guía N° 2
Micropipetas y Microdiluciones

Responsables de la Práctica: Miguel Marzal, Adriana Paredes

I. INTRODUCCIÓN

1. Micropipetas

En inmunología, la habilidad para medir de manera exacta y transferir pequeños volúmenes

de líquidos menores a 1 mL son críticos para obtener resultados reproducibles, y se requiere
de micropipetas. La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado para absorber
y transferir pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas
científicas.

La acción de recolectar sustancias con las micropipetas se denomina “pipeteo”. El uso de

micropipetas permite emplear distintos líquidos sin tener que lavar el aparato: para ello, se
emplean puntas desechables, de plástico, que habitualmente son estériles. Existen varios
tipos de puntas para los diferentes volúmenes de pipeteo.

Existen varios tipos de micropipeta dependiendo del volumen que se desea medir:
• P1000 es útil para volúmenes de 100 hasta 1000 µL
• P200 es útil para volúmenes de 20 hasta 200 µL.
• P20 es útil para volúmenes de 0.5 hasta 20 µL.

Estos equipos son de alta precisión, pero pueden ser fácilmente descalibrados por mal
manejo o por el uso continuo, perdiendo así su condición de precisión. Por ejemplo: Utilizar
la micropipeta para tomar volúmenes que no están señalados por el fabricante, conlleva a
descalibración del equipo. El uso de estos equipos bajo estas condiciones puede ocasionar
falsos resultados.

La calibración de micropipetas es el procedimiento a través del cual se verifica que estos

equipos estén usando los volúmenes adecuados y señalados por el fabricante. La
verificación consiste en determinar la desviación o error del volumen que pueda tener el
equipo respecto a su capacidad nominal (volumen nominal, VN) señalada por el fabricante.
El volumen preciso de una micropipeta se determina por gravimetría, pesando un volumen
determinado, midiendo la temperatura del líquido de trabajo y usando un factor de
corrección z. Además, se determina la Exactitud (E%) y el Coeficiente de Variación (CV%).

La micropipeta es fácil de utilizar, es un instrumento bastante intuitivo y es usado tanto por

profesionales con experiencia como por estudiantes de ciencias. Sin embargo, hay unas
cuantas cosas para tener en cuenta sobre todo dependiendo el tipo de líquido que estés
tratando.
• Para líquidos normales se debe verificar que este se encuentre limpio. Presiona
el botón del extremo superior hasta el primer tope. Sumerge verticalmente en
 el líquido la pipeta para tomar la muestra y para botarla presiona hasta el
segundo tope. Para quitar la punta solo presiona el eyector.

• Para líquidos viscosos. Luego de verificar que el instrumento está limpio se

presiona el botón superior hasta el segundo tope. Al introducir la punta en la
sustancia, suelta lentamente el botón, asegurándote que la punta haya
recolectado la muestra. Para desechar la solución presiona el botón hasta el
primer tope.

El mantenimiento del instrumento es esencial para asegurar su buen funcionamiento; para

ello siempre limpia el polvo que le haya podido caer al mismo. La limpieza de la micropipeta
se hace con etanol al 70%. Recuerda que el pistón y el cilindro son checados anualmente
para asegurarse de su óptimo funcionamiento.

Otro punto importante para el mantenimiento del instrumento es que utilices las puntas
correctas para las pipetas y a su vez estas para el volumen que deseas recolectar. De lo
contrario podrías forzar su capacidad u obtener resultados no deseados respecto a la
medida.

Las micropipetas se usan frecuentemente para colectar sustancias biológicas, líquidos

fisiológicos, y preparación de soluciones y microdiluciones.

2. SOLUCIONES Y MICRODILUCIONES

La preparación de soluciones en la inmunología es una práctica muy frecuente, estas pueden

ser desde preparación de soluciones de desinfección, tales como alcohol 70% o solución de
hipoclorito de sodio al 5% (legía al 5%), o preparación de diluciones de la muestra de suero
o sangre de un paciente, o para la preparación de soluciones diluyentes o amortiguadoras,
como la preparación del Búfer salino fosfato (PBS, Phosphate buffer saline) pH 7,2, uno de
los más usado en el desarrollo de ensayos del laboratorio.

La preparación de soluciones requiere de equipos calibrados y precisos, tales como las

micropipetas para preparación de microdiluciones, es decir con volúmenes menores de 1
mL.

Adicionalmente al uso de micropipetas, también se requiere la aplicación de fórmulas que

nos ayuden a obtener las soluciones a concentraciones óptimas de manera rápida y fácil.
Una de las fórmulas más empelada se muestra a continuación:

C1 x V1 = C2 x V2

Donde,

C1 = Concentración inicial o Ci.

V1 = Volumen inicial o Vi.
C2 = Concentración final o Cf.
V2 = Volumen final o Vf.
2.1. Conceptos y tipos de diluciones

2.1.1. Diluciones seriadas

Una dilución seriada puede definirse simplemente como la reducción
progresiva, paso a paso, de la concentración de una sustancia en disolución. Por
lo general, el factor de dilución en cada paso es constante, lo que da como
resultado una progresión geométrica de la concentración, en forma logarítmica.
Las diluciones seriadas se utilizan para crear disoluciones muy diluidas con
precisión, así como disoluciones para experimentos en los que se pretenda
estudiar curvas de concentración con una escala logarítmica. Las diluciones
seriadas son ampliamente utilizadas en las ciencias experimentales, como
inmunología, bioquímica, química, farmacología, microbiología y física.

2.1.2. Razón de dilución

La llama razón de dilución es la “RAZÓN” del volumen de la solución original y el
volumen de solvente usado. Por ejemplo: una dilución 1:1 se interpreta que por
cada volumen de solución se añade un volumen de solvente.

2.1.3. Factor de dilución (FD)

El factor de dilución corresponde a la razón entre el volumen de la solución
original que se toma para preparar la solución y el volumen total luego de
preparada (solución diluida). Como la cantidad de soluto permanece constante
durante la dilución también equivale a la razón entre la “CONCENTRACIÓN” de
la solución original y la “CONCENTRACIÓN” de la solución preparada (solución
diluida).

2.2. Tipos y preparación de diluciones

2.2.1. Diluciones directas: Se realiza en un

solo paso, desde la solución original
hasta la solución final.
Note que al pasar 1 ml de la solución
original al tubo que contiene 9 ml del
solvente, obtenemos un volumen final
(VF) de 10 ml, con lo que habremos
disminuido la concentración 10 veces.
Es decir, el factor de dilución (FD) es 10. El FD es el número de veces que disminuye
la concentración de la sustancia original en un paso de dilución.
 2.2.2. Diluciones seriadas: Se prepara un conjunto de diluciones en secuencia, cada una
a partir de la anterior, con un FD constante, las llamamos diluciones seriadas.

II. LOGRO

Al finalizar el laboratorio, el estudiante explica el uso de las micropipetas y las buenas

practicas de pipeteo; así como, los fundamentos para la preparación y cálculos de
microdiluciones.

III. MATERIALES (Solo en prácticas presenciales)

• Micropipetas 0.5 – 20 L, 20-200 L, 200 – 1000 L
• Piseta con alcohol al 70%
• Beakers con solución azul
• Beaker con solución roja
• Beaker con agua destilada
• Caja de puntas blancas
• Caja de puntas amarillas
• Caja de puntas azules
• Placa de microdilución
• Gradilla con tubos de ensayo
• Gradilla con tubos de microcentrífuga
• Calculadora

IV. PROCEDIMIENTO

1. BUENAS PRACTICAS DE LABORATORIO

1.1. Colocarse las barreras primarias (bata blanca totalmente abotonada, pelo largo
recogido, guantes de látex).
1.2. Colóquese los guantes de látex y desinfecte la mesa con hipoclorito de sodio y luego
con alcohol etílico al 70%. Debata con sus compañeros el tiempo adecuado para
desinfectar.
1.3. Discuta con sus compañeros y responda las siguientes preguntas:
• ¿Cuál es la concentración frecuentemente usada de legía y de alcohol para
desinfectar?
 • ¿Cuál es el tiempo idóneo para desinfectar con legía y alcohol?
• ¿Qué tipo de microorganismos son desinfectados usando estas soluciones?

2. USO CORRECTO DE MICROPIPETAS Y TÉCNICAS DE PIPETEO

Las micropipetas son partes de la familia de las pipetas, pero su diseño varía enormemente
respecto a las primeras. Esto debido al mecanismo que emplea para realizar la absorción de
las sustancias con medidas precisas del volumen a obtener. Por ello, te dejo a continuación
las características de la micropipeta:

• Botón superior: Pulsa un resorte interno, accionando el funcionamiento del

instrumento.
• Tornillo: mantiene el resorte y el botón conectado, en sí, es parte del botón
superior.
• Rueda: con ella se gradúa el volumen a recolectar; esto solo en los analógicos.
• Cuerpo de la pipeta: donde van todas las piezas unidas.
• Botón expulsor: botón para expulsar la punta de la pipeta luego de ser usada.
• Punta: extremo inferior extraíble, es donde se almacena la sustancia y es una parte
desechable.

2.1. Identifique las partes y estructura de una micropipeta. Observe las figuras 1 y 2

2.2. Gradúe el volumen en una micropipeta, Para graduar el volumen de la micropipeta

identifique la rueda, control y/o tornillo de graduación (Figura 1 y 2).
2.3. Seleccione el tipo de micropipeta y el tipo de puntas (Tips) que va a utilizar teniendo en
cuenta el volumen de solución a pipetear:

2.4. Seleccione el volumen por medio de la rueda y/o tornillo de graduación. Luego de
forma firme pero suavemente de vuelta al tornillo mientras observa el cambio de la
 numeración del display. Tenga cuidado de NO EXCEDER los límites de la micropipeta y
evitar su descalibración.
2.5. Ponga la punta correspondiente, presione la punta firmemente usando un
movimiento de torsión ligero. (siga las recomendaciones del docente)
2.6. Observe las figuras a continuación y siga las recomendaciones del docente instructor.
2.7. Practique las técnicas de pipeteo: 1: posición normal; 2: primer tope; 3: segundo tope.

2.8. RECOMENDACIONES:
2.8.1. Cambie la punta si el líquido es diferente al ya muestreo o si el volumen
establecido es cambiado o diferente. Recuerde que cuando se pipetean líquidos
que tienen una viscosidad y densidad diferentes a la del agua, por ejemplo,
 solventes orgánicos, una película de líquido se forma sobre las paredes internas
de la punta. Esta película puede crear error.
2.8.2. Desde que la película remanente es constante en sucesivas pipeteadas con la
misma punta, este error puede ser evitado mediante la formación de la película
antes de transferir la primera muestra. Para esto haga una aspiración de la
muestra y dispensarla en el mismo vaso, cuando la película es formada ya todas
las muestras siguientes tendrán mejor exactitud y repetitividad. Esta operación de
pre-enjuague deberá ser repetida cuando el volumen a ser aspirado cambia o
cuando se usa una nueva punta.
2.8.3. No pipetee volúmenes que sobrepasen la capacidad de la micropipeta.
2.8.4. Durante el uso y manejo las micropipetas deben permanecer en forma vertical.
2.8.5. Ubicar las pipetas en soportes adecuados o en el embalaje original sin puntas.
2.8.6. Mantener limpias las micropipetas.
2.8.7. Revisar la pipeta al inicio del día de trabajo para retirar suciedad y polvo
2.8.8. Si sus micropipetas son autoclavables y son sometidas a este proceso, estas
deberán ser verificadas antes de su uso.
2.8.9. Evite autoclavar las micropipetas si esta característica no se encuentra dentro de
las especificaciones.
2.8.10. Una vez terminado el uso de la micropipeta debe limpiarse el área de
acoplamiento con una servilleta para evitar contaminación
2.8.11. Sujetar la pipeta de forma que el reposamanos de la pipeta descanse sobre el
dedo índice.
2.8.12. Para maximizar exactitud, la pipeta, la punta y el líquido deben estar a la misma
temperatura. La temperatura de los líquidos debe estar entre 15 y 40 º C.
2.8.13. Comprobar que las puntas son las adecuadas para la pipeta y que está
correctamente ajustada. Toda micropipeta utiliza puntas desechables. Usar las
puntas una sola vez
2.8.14. No volver la pipeta del revés, de forma que el líquido de la punta afecte al
interior de la pipeta.
2.8.15. No utilizar la micropipeta con líquidos que atacan el polipropileno.
2.8.16. No utilizar líquidos que estén emitiendo vapores.
2.8.17. Evitar contaminaciones de las puntas usando el eyector y los guantes
2.8.18. Calibrar las pipetas de forma regular, al menos una vez al año

3. MICRODILUCIONES Y DILUCIONES SERIADAS

3.1. Materiales
a. Placa de microtitulación
b. Micropipetas de 10 µl a 200 µl
c. Puntas amarillas
d. Agua destilada (AD)
e. Soluciones colorantes
f. Guantes
g. Papel toalla
h. Deposito con hipoclorito de sodio 5%
i. Tubos de microcentrifugación
 3.2. Procedimiento:

1. Preparar 1 ml de una dilución 1:10 del colorante en AD: 100 µl de colorante +

900 µl de agua destilada. Esta será la solución madre o stock.
2. A partir de la solución madre prepare 8 diluciones seriadas dobles (1:2), por
duplicado. Para ello usar una placa de microtitulación y seleccionar 8 pocillos.
Colocar en el primer pocillo 200 µl de la solución madre y en los siguientes
pocillos 100 µl de AD.
3. Para realizar las diluciones tomar 100 µl del primer pocillo y colocarlo en el
segundo pocillo, homogenizar pipeteando 3 veces. Luego tomar 100 µl del
segundo pocillo y llevarlo al tercero, y así sucesivamente hasta completar el
ultimo pocillo.
4. Para realizar el duplicado, realice la misma operación
5. Calcule la concentración final de colorante en cada dilución seriada, asumiendo
que la solución madre contiene 200 mg/ml de colorante. Expresar sus resultados
en mg/ml.
6. Calcular la dilución final de cada dilución seriada. Hay que recordar que la
solución madre inicial esta diluida 1:10.

4. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

4.1. EJERCICIO 1. PREPARACIÓN DE 1 LT DE HIPOCLORITO DE SODIO AL 1%

Partiendo de un stock de lejía común al 4% ó hipoclorito industrial al 10%.

Aplicar la siguiente formula:

C1 x V1 = C2 x V2

C1: Concentración de hipoclorito deseada 1%

V1: Volumen de hipoclorito a determinar
C2: Concentración de hipoclorito común 4%
V2: Volumen de hipoclorito al 1% deseado

V1= C2xV2/C1

V1= 1% x 1 lt/ 4%
V1=1/4%
V1= 0.25lt.

Diluir 0.25 Lt de hipoclorito de sodio al 4% en 750ml de agua destilada y mezclar

suavemente una probeta de 1Lt

4.2. EJERCICIO 2. PREPARACIÓN DE 1 LT DE HIPOCLORITO DE SODIO AL 5%

C1: Concentración de hipoclorito deseada 5%

V1: Volumen de hipoclorito a determinar
C2: Concentración de hipoclorito común 10%
V2: Volumen de hipoclorito al 5% deseado en 1Lt
 V1= 5% x 1 lt/ 10%
V1= 5/10%
V1= 0.5Lt.

Diluir 500ml de hipoclorito de sodio al 10% en 500 ml de agua destilada y

mezclar suavemente una probeta de 1Lt.

4.3. EJERCICIO 3. PREPARACIÓN DE ALCOHOL A 70% A PARTIR DE ALCOHOL 96%

C1 x V1 = C2 x V2

C1: Concentración de alcohol 70% deseado

V1: Volumen de alcohol a determinar
C2: Concentración de alcohol de 96%
V2: Volumen de alcohol al 70% deseado

V1= C2 x V2/C1

V1= 70% x 1 lt/ 96%

V1= 70/96%
V1= 0.730Lt

Diluir 0.730Lt de alcohol de 96% en con 0.270 Lt de agua destilada en una

probeta de 1Lt

5. BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO

5.1. Ordenar adecuadamente el material usado en la práctica.

5.2. A continuación, proceda a realizar maniobras de buenas prácticas de laboratorio para
eliminar adecuadamente los objetos identificados como potencialmente peligrosos.
5.3. Nuevamente desinfecte la mesa de trabajo usando Hipoclorito de sodio (lejía) y alcohol
etílico 70%.
5.4. Ahora ejecute adecuadamente la maniobra para el descarte de los guantes de látex.
Practique varias veces este procedimiento.
5.5. Finalmente proceda a realizar la maniobra universal para el lavado y desinfección de
manos. (Ver Anexo)

V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• OMS. 2005. Manual de bioseguridad en el laboratorio. Tercera edición. Ginebra.

• MINSA. 2005. Serie de Normas Técnicas No 18. BIOSEGURIDAD EN LABORATORIOS
DE ENSAYO, BIOMÉDICOS Y CLÍNICOS. Comité de Bioseguridad del INS. Perú.

Otros recursos

• https://youtu.be/IPbqqPXFtFc
VI. ANEXOS