UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO

FACULTAD DE QUÍMICA
ACADEMIA
INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

NOMBRE DE LA ASIGNATURA: LABORATORIO DE BIOLOGÍA

MOLECULAR

SEMESTRE: CUARTO

HORAS POR SEMANA: 3

MAESTRO QUE IMPARTE: Dra. María del Carmen González López

 Nombre de la práctica:
Práctica Páginas Página 1
Biología Molecular
1
Manejo y calibración de micropipetas

Realizó: Revisó: Autorizó:

Fecha:

Contenido

I. INTRODUCCIÓN
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS
III. OBJETIVO
IV. METODOLOGIA
IV. 1. Material y equipo.
IV. 2. Procedimiento.
V. RESULTADOS.
VI. DISCUSION.
VII. CONCLUSIONES.
VIII. BIBLIOGRAFIA

2
I. INTRODUCCIÓN
Las micropipetas son dispositivos que permiten medir volúmenes pequeños y su manejo
nos ayuda en las distintas técnicas científicas. Los volúmenes captables por estos
instrumentos varían según el modelo: los más habituales, denominados p20, p200 y
p1000, admiten un máximo de 20, 200 y 1000 μl, respectivamente.
En las de volumen variable, se puede seleccionar un volumen dentro de un rango de
valores determinado. Para absorber el líquido, el pistón es presionado hasta una primera
posición, la punta es puesta en contacto con el líquido y luego, lentamente, se permite
que el pistón vuelva a su posición original. Este paso permite el llenado de la punta con
el volumen correspondiente. La punta de plástico generalmente no se seca por fuera ya
que se considera que su superficie no absorbe líquido.

TIPOS DE MICROPIPETAS
Los tipos: P1000, P200, y P20.

P1000 es útil para volúmenes de 200 hasta 1000

μL
P200 es útil para volúmenes de 20 hasta 200 μL.
P20 es útil para volúmenes de 0.5 hasta 20 μL.

Asegurarse que está usando la micropipeta

correcta para el volumen que necesita. También,
asegúrese que la micropipeta está realmente lista
para el volumen que necesita revisando la
―ventana de volumen‖, si es necesario, cambiando
el volumen mediante el ―dispositivo‖ del control o
mando del volumen hasta que la micropipeta corrija
el volumen (la micropipeta no lee su mente; varias
personas usarán las pipetas, no siempre se
encontrará como usted la necesita).
No Trate de colocar la micropipeta para volúmenes
mayores que el máximo, o para volúmenes
menores del cero, esto descalibrará y dañará la
micropipeta.
Toda micropipeta utiliza puntas desechables (no
utilice la pipeta sin usar la punta apropiada, hacer
esto contaminará la micropipeta y la puede dañar).
No utilizar la micropipeta con líquidos que atacan
el polipropileno.
No utilizar líquidos que estén emitiendo vapores.
La temperatura de los líquidos debe estar entre 15 y 40 º C.
Al poner la punta, asegúrese que la punta sea del tipo correcto y que esté correctamente
ajustada. Generalmente para P1000 las puntas son azules, para P200 son amarillas y
para P20 pueden ser amarillas o blancas.

Por calibración de micropipetas se entiende la comparación de volumen real y volumen

teórico. El volumen real se determina por vía gravimétrica.

3
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Tipos de micropipetas.
2. Tipos de pipeteo
3. Cómo revisar la calibración de una micropipeta.
4. Que información me da el %E y CV en la calibración de una micropipeta.
III. OBJETIVO:
Conocer las partes y el funcionamiento adecuado de las micropipetas; para optimizar los
resultados al momento de utilizarla.

IV. METODOLOGIA

IV.1 MATERIALES
1 juego de micropipetas P1000, P200 y P20
Agua destilada
Glicerol
Balanza analítica
vidrios de reloj de 5 cm de diámetro
Puntas para las micropipetas.

IV.2 PROCEDIMIENTO
Para el uso adecuado de la micropipeta hay que asegúrese que está usando la
micropipeta correcta para el volumen que necesita medir. También que la micropipeta
está realmente lista para el volumen que necesita revisando la ―ventana de volumen‖. Si
es necesario, cambiar el volumen mediante el ―dispositivo‖ del control o mando del
volumen hasta que la micropipeta corrija el volumen (la micropipeta no lee su mente;
varias personas usarán las pipetas, no siempre se encontrará como usted la necesita).

1) Partes de la micropipeta
Identificar las partes de la micropipeta ayudándose de la imagen en la Figura.

4
 2) Llenado de la pipeta
a) Colocar una punta según corresponda.
b) Colocar el pulgar sobre el mando o émbolo de pipeteado.
c) Oprimir el émbolo hasta el primer un punto de resistencia ―alto‖ o "tope". Si continúa
presionando encontrará un punto donde el émbolo ya no se mueve hacia abajo, este
corresponde al segundo punto de resistencia ―alto‖ o "tope".
d) Oprimir el émbolo hasta el primer tope y colocar la punta dentro del líquido hasta una
profundidad menor a 1 mm. De una manera lenta y controlada, disminuya la presión del
émbolo para permitir que se desplace hacia arriba. No suelte el émbolo abruptamente,
al permitirlo causará que el líquido pueda salpicar dentro de la punta produciendo
volúmenes inexactos y generando contaminación de la pipeta. Una vez el émbolo se haya
desplazado hasta arriba mantenga la micropipeta en el líquido durante un segundo, esto
evita que se aspire aire en la parte final.

3) Expulsión de la muestra
a) Llevar la micropipeta al tubo de polipropileno de 1.5 mL.
b) Se apoya la punta en la pared inferior del tubo.
c) Oprimir el émbolo hasta el primer tope y luego hasta el segundo tope. Haga este
procedimiento a una velocidad moderada, hacerlo muy rápido hará que queden gotas

5
de muestra en la punta. Si observa cuidadosamente, entonces notará que al oprimir hasta
el segundo alto se expele todo el líquido de la punta.
d) Lo anterior es cierto para la mayoría de soluciones acuosas, excepto para las
soluciones de alta viscosidad como el Glicerol. Si es usada inadecuadamente, la
micropipeta transferirá volúmenes inexactos.

4) Calibración de Micropipeta
La micropipeta puede perder su calibración. Comprobar la calibración de la pipeta es un
procedimiento simple que puede ahorrar tiempo considerable, energía, y reactivos. En
esta práctica aprenderá a usar la micropipeta de tamaños diversos medir su exactitud,
precisión y calibración.
Para cada micropipeta revisar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de variación
(CV%) en todo el rango usando al menos dos volúmenes diferentes; por ejemplo: Para la
micropipeta P1000 revisar los volúmenes de 300 μL y 1000 μL. Para P200 revisar los
volúmenes de 60 y 200 μL. Para P10 revisar 3 y 10 μL.

a) Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas.

b) Colocar la tapa de la caja de petri en la balanza y tarar a cero.
c) Tomar el volumen de agua destilada con la micropipeta y dispénselo en la tapa
de la caja de petri. Registre el peso del agua añadido. La densidad del agua es 1
g/mL a 25ºC, por lo tanto un volumen de 1 mL corresponde aproximadamente a
una masa de 1 g, 300 μL a 0.3 g, 200 μL a 0.2 g, 60 μL a 0.06 g, 10 μL a 0.01 g y
3 μL a 0.003 g.
d) Repita el procedimiento de 5 a 10 veces para cada volumen.
e) Repetir todo el procedimiento para glicerol. La densidad del glicerol es de 1,2656
g/mL a 25 ° C.
f) Calcular la masa esperada para cada volumen

V. RESULTADOS
Cálculo de la exactitud (E%) y del coeficiente de variación (CV%)

 Valor medio
X = Σ Xi /n
donde Xi= pesadas, n= numero de pesadas

 Volumen medio
V=X.Z
donde X= valor medio y Z= factor z (1/densidad)
Valore del control a 21,5 ° C (Z = 1,0032)

 Exactitud E(%)= ((V-Vnominal)/Vnominal) *100

 Desviación estándar
S = Z .  Σ(Xi – X)2
n–1
 Coeficiente de Variación

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CV= (S*100)/V

Límites de tolerancia para micropipetas:

VI. DISCUSIÓN

VII. CONCLUSIÓN

VIII BIBLIOGRAFÍA

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 Nombre de la práctica:
Práctica Páginas Página 1
Biología Molecular
2
Extracción de DNA

Realizó: Revisó: Autorizó:

Fecha:

Contenido

I. INTRODUCCIÓN
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS
III. OBJETIVO
IV. METODOLOGIA
IV. 1. Material y equipo.
IV. 2. Procedimiento.
V. RESULTADOS.
VI. DISCUSION.
VII. CONCLUSIONES.
VIII. BIBLIOGRAFIA

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 I. INTRODUCCIÓN
La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primara etapa de la mayoría
de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN.
En este caso, los métodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos purificados a
partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de modificaciones
genéticas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza
de los ácidos nucleicos son dos de los elementos más importantes en ese tipo de
análisis. Si se desea obtener ácidos nucleicos muy purificados, que no contengan
contaminantes inhibidores, es preciso aplicar métodos de extracción adecuados.

La extracción de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras
que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificación, que
implica la retirada de la solución final de la mayoría de elementos que pueden interferir
en la PCR.

Etapas en la extracción de ADN

Los pasos necesarios para una correcta extracción y purificación del ADN mediante un
procedimiento químico son:

1. Lisis de las células o virus. Las sales caotró-picas ayudan a romper la estructura
tridimensional de macromoléculas como las proteínas o los ácidos nucleicos
consiguiendo su desnaturalización. La adición de un detergente como el SDS es
necesaria a menudo para eliminar las membranas.

2. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la

adición de una proteasa. La fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de
sales como el acetato de amonio o el acetato sódico.

3. Purificación. Consta de 3 fases:

• Precipitación del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar
etanol frío o isopropanol y recuperar mediante una centrifugación. El alcohol del
sobrenadante se llevará las sales añadidas previamente.

• Lavado del pellet. Se realiza con alcohol frío volviendo a centrifugarse

• Recuperación. El sedimento se puede resuspender en agua o tampón Tris tras ser

secado completamente.

La confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel

de agarosa y posterior tinción con bromuro de etidio y observación con luz UV o
directamente al espectrofotómetro mediante espectro de absorción de 200 a 350 nm. El
ADN purificado se puede cuantificar con un espectrofluorímetro mediante el uso de
fluoróforos específicos (Picogreen®, Molecular Probes).

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El paso 3 puede realizarse con la ayuda de minicolumnas equipadas con una membrana
de sílica que retiene específicamente el ADN permitiendo el paso de las moléculas y sales
que acompañan la reacción de lisis. Finalmente se lava con alcohol y se eluye el
contenido

II. CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Propiedades fisicoquímicas del DNA

2. ¿Cuál es la función del fenol-cloroformo en la extracción de DNA?
3. ¿Qué es y para qué sirve el Tris-HCL y SDS?
4. ¿Por qué utilizamos isopropanol y Etanol en la extracción de DNA?
5. ¿Para qué se adiciona la sal en el proceso de extracción de DNA?
6. Uso de la proteinasa K en la eliminación de proteínas.

III. OBJETIVO
Adquirir conocimiento de extracción de ADN por el método de fenol cloroformo de tejidos,
identificar el propósito de cada reactivo durante la extracción del ADN de la muestra.

IV. METODOLOGÍA
1. Materiales y equipo:
-Micro pipetas de 2-20uL, de 20-200uL y de 100-1000ul.
-Baño de María.
-Plato caliente.
-Termómetro.
-Incubadora.
-recipiente.
-Campana de extracción.
-Centrifuga para tubos de 1,5 ml, que alcance 14000 rpm.
-Cámara de electroforesis horizontal.
-Tubos de 1,5ml.
-Guantes de látex sin polvo.
-Micro centrifugadora.
-Matraz aforado de 5mL y 25mL.

2. Reactivos
-Tris-HCL.
-EDTA.

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-SDS.
-NaCl.
-Fenol:Cloroformo:Isoamilalcohol (25:24:1).
-Isopropanol.
-Etanol.
-H20 estéril.
-RNasa.
-Hielo.

3. Preparación de soluciones

A) Buffer de extracción

Nota: Mezcle los ingredientes, complete al volumen deseado y autoclave. Este Buffer se
puede almacenar por meses en refrigeración, a 4°C.

Protocolo:

Nota: muestra biológica (hígado de pollo o res)

1) Precalentar el buffer de extracción a 55°C por 10min.

2) moler el tejido hasta tener trozos pequeños.

3) En un tubo de 1,5 mL pesar 0.5 g de la muestra biológica.

4) Agregar 500 uL del buffer de extracción precalentado.

5) moler y mezclar.

6) Incubar a 55°C por 10 minutos.

7) Agregar 300 uL de Fenol:cloroformo:isoamilalcohol. Mezclar por agitación

cuidadosamente hasta que se forme una emulsión. El fenol:cloroformo es sumamente
tóxico y todo el trabajo con este reactivo debe hacerse en campana de extracción o con
uso de mascarilla.

11
8) Centrifugar a 8000 rpm durante 10 min.

9) Transferir la fase acuosa (superior) con una pipeta a un tubo nuevo y estéril de 1.5
mL.
Nota: No transferir el fenol cloroformo con la fase acuosa.

10) Repetir la limpieza con fenol:cloroformo:isoamilalcohol (pasos 7-8-9) por 2-3 veces.

11) Agregar un volumen de NaCl (5M) correspondiente al 10% de la muestra y mezclar

bien.

12) Agregar un volumen de isopropanol frio correspondiente al volumen de la muestra

resultante del punto 10.

13) Centrifugar a temperatura ambiente, a 12000rpm durante 5min y descartar líquido

por inversión del tubo.

14) Agregar 400 uL de etanol frio al 70%.

15) Centrifugar a temperatura ambiente a 12000rpm durante 3 min y descartar el líquido

por inversión del tubo.

16) Dejar secar el ADN a temperatura ambiente, con el tubo abierto.

17) Resuspender en 50uL de H2O estéril o buffer TE. Opcional: agregar 1uL de RNasa
(10mg/mL).

V. RESULTADOS
Cálculos.-
5 equipos (2 muestras por equipo)= 10 muestras.
Buffer:

-SDS1%
1𝑔 𝑆𝐷𝑆
(25𝑚𝑙) = 0.25 𝑔 𝑆𝐷𝑆
100𝑚𝑙

-EDTA de sodio (50mM), PM= 372.2 g/mol.

(. 05 𝑀)(372.2𝑔/𝑚𝑜𝑙)(. 025𝐿) = 0.465𝑔𝐸𝐷𝑇𝐴

-NaCl (500mM), PM=58.442g/mol.

12
(. 5𝑀)(58.442 𝑔/𝑚𝑜𝑙)(0.025𝐿) = 0.730𝑔𝑁𝑎𝐶𝑙

-Tris-HCl (100mM), PM= 121.14g/mol.

(. 1𝑀)(121.14𝑔/𝑚𝑜𝑙)(. 025𝐿) = 0.30285 𝑔𝑇𝑟i𝑠 − 𝐻𝐶𝑙

Otros reactivos a utilizar:

-400μL etanol 70% (15 muestras) = 6mL.
-NaCl (5M) en 5mL
(5𝑀)(58.442𝑔/𝑚𝑜𝑙)(. 005𝐿) = 1.461𝑔𝑁𝑎𝐶𝑙
VI. DISCUSIÓN

VII. CONCLUSIÓN

VIII. BIBLIOGRAFÍA
 Puerta C., Urueña C., 2009. Practicas de biología molecular. Pontificia
Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.
 Voet y Voet D. 2006. Bioquímica. 3a edición. Editorial medica panamericana,
Buenos Aires, Argentina.
 www.ivic.gob.ve/ecologia/ueg/formatos/Protocolos%20de%20extracci%C3%B3n
%20de%20ADN%20de%20mariposas%20fenol%20cloroformo.pdf
 http://campodocs.com/articulos-para-saber-mas/article_49691.html
 Rådström, P. y col. 2004. Pre-PCR processing: Strategies to generate PCR-
compatible samples. Mol. Biotechnol. 26, 133– 46.
 http://bitesizebio.com/2839/dna-precipitation-ethanol-vs-isopropanol/

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 Nombre de la práctica:
Práctica Páginas Página 1
Biología Molecular
Extracción de RNA

Realizó: Revisó: Autorizó:

Fecha:

Contenido

I. INTRODUCCIÓN
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS
III. OBJETIVO
IV. METODOLOGIA
IV. 1. Material y equipo.
IV. 2. Procedimiento.
V. RESULTADOS.
VI. DISCUSION.
VII. CONCLUSIONES.
VIII. BIBLIOGRAFIA

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 I. INTRODUCCIÓN:

En los organismos celulares el ARN es la molécula encargada de dirigir la síntesis de

proteínas, pues aunque el ADN es el que contiene la información que determina la
estructura de estas, no puede actuar solo y se vale del ARN para traducir esta información
y producir las proteínas necesarias para el desarrollo y actividades de la célula.

La mayor dificultad en la extracción del ARN es evitar la contaminación con RNAsas,

enzimas muy estables que no requieren cofactores para su función. Por lo tanto, se deben
tratar las soluciones y los materiales con Dietil-pirocarbonato (DEPC), el cual inactiva las
ribonucleasas por modificación covalente.

En una técnica sencilla de extracción de ARN, las células son homogenizadas en

tiocianato de guanidina y posteriormente purificado por fenol-cloroformo a pH reducido.
El rendimiento del ARN total extraído depende del tipo de muestra y generalmente esta
en un intervalo de 4-7 µg/mL iniciando de 5-10 mg de tejido o 106 células.

II. CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Propiedades fisicoquímicas del RNA.

2. ¿Cuáles son las precauciones que deben tomarse para evitar la contaminación
con ARNsas exógenas?
3. ¿Cuál es la función del PBS en la extracción de RNA?
4. ¿Cuáles son las diferencias entre los métodos de extracción de ADN y de ARN?
5. ¿Para qué es utilizado el Trizol?

III. OBJETIVO

Extraer ARN de Drosophila melanogaster por métodos físico-químicos así como

conocer la metodología básica para extracción de ARN.

IV. MATERIAL Y EQUIPO

PBS 1X
Trizol
Cloroformo
Isopropanol
Etanol 70%

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Agua para PCR o buffer TE (estéril)

1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10

Gradillas
Campana de extracción
Termobloques
Tubos de polipropileno 1.5 mL
Centrifuga
Vortex

Material biológico: insectos (por ejemplo moscas Drosophila melanogaster)

V. METODOLOGÍA
Colectar moscas de la fruta.
Realizar una trampa para moscas, coloque cascaras de plátano en el recipiente
para que las moscas sean atraidas por el olor.
Extracción de ARN
1. Colectar aproximadamente 10 moscas y colocarlas en un tubo eppendorf y
enjuagar con PBS 1X para eliminar residuos (3 veces) y mantener en hielo.
2. Macerar las moscas con 200 ul de PBS 1X , adicionar 500 ul de Trizol (lo más
rápido posible para evitar la degradación del ARN) y mezclar para homogenizar.
3. Incubar 5 min a temperatura ambiente y adicionar 50 ul de cloroformo.
4. Agitar vigorosamente por 15 s e incubar a temperatura ambiente por 3 min.
5. Centrifugar a 13000 rpm por 15 min y transferir el sobrenadante a un tubo limpio.
6. Repetir los pasos 3 al 5 una vez más
7. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y adicionar 750 ul de isopropanol,
mexclar e incubar 15 min a temperatura ambiente.
8. Centrifugar a 13000 rpm por 10 min y decantar para eliminar el sobrenadante.
9. Enjuagar con etanol al 70%, centrifugar a 6500 rpm por 5 min y remover el
sobrenadante.

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10. Secar el pellet de RNA y resuspender en 20 ul de agua para PCR.
11. Guardar a -20ºC para su posterior cuantificación y analisis en electroforesis.

Requerimientos de seguridad

Bata blanca de manga larga, pantalón largo, zapato cerrado y guantes de látex o
vinilo.

VI. RESULTADOS
VII. DISCUSIÓN
VIII. CONCLUSIÓN

IX. BIBLIOGRAFÍA

 Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª

ed. Ed Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs.
 David, L.G. dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular biology.
Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986.
 Catálogos de TRIzol casa comercial GIBCO.

17
 Nombre de la práctica:
Biología Molecular Práctica Páginas Página 1
Electroforesis en gel de agarosa y 4
cuantificación de DNA y RNA
Realizó: Revisó: Autorizó:

Fecha:

Contenido

I. INTRODUCCIÓN
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS
III. OBJETIVO
IV. METODOLOGIA
IV. 1. Material y equipo.
IV. 2. Procedimiento.
V. RESULTADOS.
VI. DISCUSION.
VII. CONCLUSIONES.
VIII. BIBLIOGRAFIA

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 I. INTRODUCCION.

La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas en

función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término electroforesis
describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico.
«Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego phoros, significa «trasladar».
Así pues, la electroforesis en gel es una técnica consistente en aplicar corriente eléctrica
a las moléculas para que atraviesen una placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis
es la tensión eléctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. Las
propiedades de una molécula determinan la velocidad con que un campo eléctrico puede
desplazarla a través de un medio gelatinoso.
Muchas macromoléculas biológicas importantes (por ejemplo, los aminoácidos, los
péptidos, las proteínas, los nucleótidos y los ácidos nucleicos) poseen grupos ionizables
y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas eléctricamente,
sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga neta, las partículas
cargadas migrarán hacia el cátodo o hacia el ánodo. Así, por ejemplo, cuando se aplica
un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados
negativamente lo harán migrar hacia el ánodo (Westermeier, 1997).
La electroforesis en gel de agarosa es un método normalizado que se utiliza para separar,
identificar y purificar fragmentos de ADN y RNA. Se trata de una técnica sencilla y rápida
que permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente
con otros procedimientos. Por otra parte, el ADN puede localizarse enel gel tiñendo con
una concentración baja de bromuro de etidio, que es un agente intercalante fluorescente
que se utiliza como colorante.

Los geles de poliacrilamida también constituyen un excelente medio de soporte para

separaciones electroforéticas, dado que reúnen una serie de propiedades idóneas:
transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad
de compuestos químicos. La poliacrilamida se forma por copolimerización de dos
compuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida), en una
reacción iniciada por la tetrametiletiléndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio.

Componentes de la electroforesis en gel de agarosa:

Agarosa
La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacárido lineal (con un
peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repetición de la unidad básica, la
agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6- anhidrogalactosa.
La agarosa es muy frágil y las manipulaciones pueden destruirla con facilidad. Los
geles de agarosa poseen grandes «poros» y se emplean fundamentalmente para separar
las moléculas grandes con un peso molecular de más de 200 kDa. Los geles deagarosa
se obtienen por suspensión de agarosa seca en polvo en un tampón acuoso, tras lo cual
se hace hervir la mezcla hasta que la agarosa se funde y se convierte enuna solución
transparente. A continuación, se vierte esta solución en un molde para gely se deja enfriar
a temperatura ambiente hasta que se forma un gel rígido. Al endurecerse, la agarosa
forma una matriz cuya densidad viene determinada por su concentración.

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Tampón de electroforesis:
Se dispone de varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo bicatenario.
Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o tris- fosfato (TPE) a una
concentración de aproximadamente 50 mM (pH 7,5 – 7,8). Los tampones de electroforesis
suelen prepararse en forma de soluciones concentradas y se conservan a temperatura
ambiente. El TBE se utilizaba inicialmente a una concentración de trabajo de 1x en el
caso de la electroforesis en gel de agarosa. No obstante, una solución de trabajo de 0,5x
proporciona un poder más que suficiente y en la actualidad prácticamente todas las
electroforesis en gel de agarosa se practican utilizando esta concentración.

Concentración de agarosa
Un fragmento de ADN de un tamaño determinado migra a diferentes velocidades a través
de los geles según la concentración de agarosa. En función de la concentración de
agarosa o tampón, se pueden separar segmentos de ADN que contengan de 20 a
50 000 pb. En los geles horizontales, la agarosa se emplea por lo general en
concentraciones comprendidas entre un 0,7 % y un 3 % (véase el cuadro 1).

Cuadro 1: concentración recomendada de gel de agarosa para separar

moléculas lineales de ADN

% Agarosa Gamas de tamaños de

ADN (pb)
0,75 10 000 – 15 000
1,0 500 – 10 000
1,25 300 – 5 000
1,5 200 – 4 000
2,0 100 – 2 500
2,5 50 – 1 000

Marcador de peso molecular de DNA o RNA.

Para una tensión, un gel de agarosa y unas concentraciones de tampón determinadas,

la distancia de migración depende del peso molecular del material inicial. Así pues,
debe cargarse un ADN marcador de tamaño conocido en las ranuras situadas en los
extremos derecho e izquierdo del gel. Generalmente un marcador contiene un número
determinado de segmentos de ADN conocidos, lo cual facilita la labor de determinar el
tamaño de los ADN desconocidos en caso de que se produjese alguna distorsión
sistemática del gel durante la electroforesis.

Tampón de carga

Las muestras de ADN que deben cargarse en el gel de agarosa se mezclan en primer
lugar con un tampón de carga que por lo general contiene agua, sacarosa y un

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colorante (por ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de bromocresol,
etc.). El tampón de carga se emplea con tres fines:
• Aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan
uniformemente en el pocillo
• Añadir color a la muestra, simplificando de este modo el proceso de carga
• Incorporar un colorante a la muestra que, en un campo eléctrico, se desplace
hacia el ánodo a una velocidad previsible.

II. CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Fundamento del método de electroforesis

2. ¿de qué esta compuesto el buffer de carga y cuál es su función?
3. Función del bromuro de etidio, qué alternativa se puede usar
4. Factores que afectan la separación de las moléculas en la electroforesis de
agarosa.
5. ¿Cómo se cuantifican los ácidos nucléicos?
6. Valores de referencia para la pureza de los ácidos nucleicos

II. OBJETIVO

Separar fragmentos de DNA y RNA previamente extraídos, para su posible

identificación.
Cuantificar DNA y RNA de las prácticas anteriores

IV. METODOLOGIA

IV.1. Material y equipo

 Unidad de electroforesis horizontal con alimentación eléctrica

 Horno microondas o incubador-agitador
 Micropipetas
 Tubos de reacción de 1,5 ml
 Balanza analítica
 Espátulas
 Soporte para tubos de reacción
 Material de vidrio
 Fotodocumentador
 Peines y charola para gel de agarosa
 Puntas amarillas y azules para micropipeta

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 IV. 2. Reactivos y soluciones

Advertencia: El bromuro de etidio es una sustancia mutágena/carcinógena potente

y moderadamente tóxica. Se deberán llevar siempre guantes cuando se manipulen
soluciones y geles que contengan bromuro de etidio.

 Agua desionizada
 Agarosa grado biología molecular
 Bromuro de etidio, CAS 1239-45-8, (0,5 g/mL)
 Agua estéril o buffer TE.
 Tampón de TBE o TAE 50x
 Tampón de carga

IV. 3. Requerimientos de seguridad

Bata blanca larga y de mangas largas. Necesario guantes, lentes o mascarilla porque
solamente se trabaja con agua .

IV.4 Disposición de residuos

Según indique el responsable del laboratorio.

IV. 5. Procedimiento

 Sellar los bordes de un molde de plástico limpio y seco con cinta adhesiva o de
otro modo. Colocar el peine adecuado de modo que se formen pocillos completos
al añadir la solución de agarosa.
 Diluir tampón de TBE 50x y preparar la cantidad adecuada de tampón de TBE 0,5x
para llenar la cubeta de electroforesis y preparar el gel.
 Pesar la agarosa en polvo según lo indicado para obtener la concentración
requerida (0.8-1 % para DNA genómico, )y añadirla a una cantidad apropiada de
tampón de TBE 0,5x en un matraz de Erlenmeyer con tapa suelta (normalmente
150 ml de solución de gel para un molde de 15 x 15 cm y 100 ml de gel para un
molde de 15 x 10 cm).
 Calentar la mezcla en un horno microondas o en plato caliente hasta que se disuelva
la agarosa (comprobar el volumen de la solución tras haberla calentado).
 Enfriar la mezcla a 50 - 60°C y añadir bromuro de etidio (de una solución madre de
10 mg/ml) hasta lograr una concentración final de 0,2 μg/ml y mezclar bien.
 Verter la solución en el molde y dejar que se forme el gel. La cantidad de gel
empleado debe corresponder a un grosor de aproximadamente 3 - 5 mm.

22
  Una vez completamente formado el gel, retirar cuidadosamente el peine y la cinta
adhesiva y colocar el gel en la cubeta de electroforesis.
 Añadir tampón de TBE 0,5x a la unidad de electroforesis de modo que el gel
quede cubierto por una capa de aproximadamente 2 - 5 mm.

Preparación de la muestra

Tampón de carga 3 μl
Muestra 7 μl

 Cargar 10 μl de cada muestra en pocillos consecutivos y el ADN marcador

adecuado en las calles primera y última.
 Cerrar la tapa de la cubeta del gel y conectar los cables eléctricos para que el
ADN migre hacia el ánodo y aplicar una tensión de 5 - 10 V/cm.
 Hacer la electroforesis hasta que el cianol de xileno haya recorrido la distancia
adecuada a través del gel (~ 40 - 60 minutos).
 Desconectar la corriente y retirar los cables y la tapa de la cubeta. Introducir el gel
en un transiluminador UV (320 nm) y fotografiarlo.
 Tirar el gel en el recipiente para residuos sólidos destinado al bromuro de etidio
previsto a tal fin.

Cuantificación y pureza de ácidos nucleicos

(lo investigará el equipo correspondiente a la práctica)

V. RESULTADOS

VI. DISCUSIÓN
VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFIA

Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989). «Gel electroforesis of DNA» en:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a Laboratory Manual.
New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA,capítulo
6.

Westermeier, R. (1997). Electroforesis in Practice: a Guide to Methods and Applications

of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.

23
 Nombre de la práctica: Práctica Páginas Página 1
Laboratorio de Biología Molecular 5
Digestión de fago lambda

Realizó: Revisó: Autorizó:

Fecha:

Contenido

I. INTRODUCCIÓN
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS
III. OBJETIVO
IV. METODOLOGIA
IV. 1. Material y equipo.
IV. 2. Procedimiento.
V. RESULTADOS.
VI. DISCUSION.
VII. CONCLUSIONES.
VIII. BIBLIOGRAFIA

24
 I. INTRODUCCIÓN.

FABRICACIÓN DEL DNA RECOMBINANTE.

El desarrollo de las técnicas de DNA recombinante ofrece nuevas oportunidades

para la investigación, ya que simplifica la obtención de grandes cantidades de DNA
que codifican genes específicos, y facilita las investigaciones de la organización,
estructura y expresión génicas.
Esta metodología también ha dado un impulso al desarrollo de la naciente industria
biotecnológica, que está suministrando un número creciente de productos al mercado.
El DNA recombinante produce grandes cantidades de copias desegmentos de DNA
específicos, incluyendo genes.

La tecnología del DNA recombinante tiene sus raíces en el descubrimiento de las

enzimas de restricción, una clase especial de enzimas capaces de cortar el DNA
en muchas bacterias. Dichas enzimas fueron aisladas por primera vez en 1970, sin
embargo, dichas enzimas habían sido observadas antes en la naturaleza cuando se
descubrió que ciertos bacteriófagos tenían un espectro limitado de huéspedes.
Cuando el bacteriófago infectaba las células del huésped, éste tenía enzimas capaces
de destruir el DNA del fago. Las enzimas de restricción protegen a las células
bacterianas porque causan la hidrólisis del fago. El DNA bacteriano está protegido de
la destrucción porque la célula metila (inserta grupos metilo) algunas de sus citosinas
en el DNA.

Lo importante de las técnicas con rDNA, es que la enzima reconozca y corte un sitio
en especifico (digiera) en el DNA y que corte esa secuencia en el DNA cada vez. En
experimentos de clonación, se emplean enzimas que reconocen cuatro, seis u ocho
bases. En ocasiones algunas enzimas cortan la molécula de DNA de manera alterna,
es decir, que cortan la doble cadena en sitios que no son directamente opuestos entre
sí.

Las enzimas de restricción escinden el DNA en sitios muy específicos. Existen

diferentes tipos de enzimas:

 Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posición aleatoria
a cierta distancia del sitio de restricción. No se utilizan normalmente en la
investigación de DNA recombinante ya que el sitio de corte no es preciso.
 Las enzimas de Tipo II reconocen una secuencia específica y cortan las dos
cadenas de la molécula de DNA con absoluta precisión dentro de la secuencia
reconocida. Se usan ampliamente en investigación de DNA recombinante puesto
que cortan en sitios específicos. Las secuencias reconocidas por las enzimas de
Tipo II son simétricas (―palindrómicas‖), es decir, la secuencia de una de las
cadenas leída en dirección 5'-->3' es la misma que la secuencia de la cadena
complementaria leída también en dirección 5'--> 3'

Las enzimas de restricción pueden diferir en la forma de cortar la molécula de DNA.

Algunas cortan en medio de la secuencia de reconocimiento lo que produce un ―flush‖ o
25
un ―extremo roto (blunt end)‖. Otras enzimas escinden de ―forma escalonada‖, dando
como resultado cadenas cortas de una sola cadena sobrepuesta (generalmente de 2 o
4 nucleotidos) a cada lado, se les denomina ―extremos cohesivos (cohesive ends)‖ ya
que pueden unirse de nuevo por complementariedad de bases.

N-N-A-G-C-T-N-N ----------> N-N-A-G C-T-N-N

N-N-T-C-G-A-N-N N-N-T-C G-A-N-N
Alu I
Romos

N-N-G-A-A-T-T-C-N-N --------
N-N-G A-A-T-T-C-N-N
N-N-C-T-T-A-A-G-N-N N-N-C-T-T-A-A G-N-N
Eco RI
Cohesivos

Figura 1. El sitio de corte de una enzima de restricción es específico y lo hace en una

secuencia palíndrome en el DNA, el corte puede generar extremos romos o extremos
cohesivos (en escalera).

COMO CONFIGURAR UNA REACCIÓN CON ENZIMA DE RESTRICCIÓN

Una reacción con una enzima de restricción contiene el DNA a analizar, una enzima de
restricción, y un buffer mixto para enzima de restricción. Cada enzima prefiere un buffer
en particular. Este buffer mixto, generalmente a una concentración de 10X, contiene un
agente buffer (comúnmente Tris) para mantener el pH constante, sal (NaCl o KCl) para
proveer una fuente ionica fuerte para la digestión, y Mg++ (MgCl2) como un cofactor de
actividad enzimática.

Existen en el mercado enzimas de restricción que suelen tener actividad a 10-20

unidades/ul. Una ―unidad‖ se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir
1 ug de DNA virus lambda bacteriano en 1 hr en una reacción de 50 ul. Generalmente se
usan 10-20 unidades (1 ul) de enzima de restricción por reacción. Es más del necesario,
pero este exceso asegura que la digestión sea completa. El tiempo de la digestión toma
1.5 hrs, pero puede ser más lenta.

Después de la reacción, las muestras son almacenadas bajo refrigeración hasta el

momento en el que se necesite. El colorante de carga es añadido al DNA digerido y las
muestras son cargadas en un gel.

26
 Figura 2. Mecanismo de acción de una enzima de restricción. La enzima corta en
secuencias específicas del DNA generando extremos cohesivos, este fragmento
permite el apareamiento de bases para ser unido a un vector.

II. CONOCIMIENTOS PREVIOS.

1. Explique los fundamentos de latecnología de DNA recombinante.

2. ¿Qué son las enzimas de restricción? ¿Cómo funcionan?
3. ¿Cuáes son los sitios de corte para las enzimas EcoRI, HindIII y PstI?
4. ¿Qué factores afectan la actividad de las enzimas de restricción?
5. Definir una unidad de endonuclesa de restricción.
6. Explique en que consiste la actividad estrella de las enzimas de restricción
7. Describe la función de un bacteriófago.
8. ¿Cuáles son las carácterísticas del fago lambda y por qué se utiliza para este
estudio?

27
III. OBJETIVOS.

III.1 Objetivo general.

 Comprender el uso de las enzimas de restricción como herramientas

biotecnológicas.

III.2 Objetivos particulares

 Realizar la digestión del fago lambda usando tres enzimas de restricción.

 Separar por electroforesis los fragmentos generados en la digestión.
 Realizar una gráfica para determinar el peso de cada uno de los fragmentos,
usando un marcador de pesos moleculares conocido.
 Realizar un análisis de restricción usando herramientas bioinformáticas para
comparar con los resultados obtenidos experimentalmente.

IV. METODOLOGÍA

IV.1. Material y equipo

Micropipetas y puntas para micropipeta

Horno de microondas o plato caliente
Tubos Eppendorf
Baño Maria a 37ºC
Camara de electroforésisi horizontal.
Fuente de poder
Matraz Erlenmeyer 250 ml.
Termómetro.
Transiluminador o fotodocumentador.
Probeta 100 ml.
Espátula.

IV. 2. Reactivos y soluciones

DNA fago lambda sin digerir

DNA fago lambda digerido conHind IIII 0.2 g/l
Enzimas de restricción PstI, EcoRI, HindIII
Buffer de restricción 2x
Agarosa
Buffer TAE 1x y 0.25x
Buffer de carga
Bromuro de etidio.

IV. 3. Requerimientos de seguridad

Bata de seguridad

28
Guantes de látex

IV.4 Disposición de residuos

El gel de agarosa será depositado en un contenedor especial para desechos con

bromuro de etidio.
El buffer TAE puede guardarse para otra corrida de electroforesis.

IV. 5. Procedimiento

Digestion de DNA

1. Los tubos eppendorf serán marcados de la siguiente manera:

L = DNA lambda sin cortar
P = DNA lambda digerido con PstI
E = DNA lambda digerido con Eco RI
H = DNA lambda digerido con HindIII

2. A cada tubo se le agregarán 4 L del DNA de fago lambda sin cortar, 5 L del buffer
de restricción, y 1 l de enzima, de acuerdo con el siguiente esquema. Completa
el esqema. (Nota: primero adicionar el DNA, luego el buffer de restricción y
finalmente la enzima. Usar una punta limpia para el buffer y cada enzima)

Tubo DNA Buffer de PstI EcoRI HindIII

lambda restricción
L 4 L 6 L --- --- ---
P 4 L 6 L 1 L --- ---
E 4 L 6 L --- 1 L ---
H 4 L 6 L --- --- 1 L

3. Cerrar cada tubo y mezclar de la siguiente manera: tomar el tubo entre el dedo
indice y el pulgar de una mano y dar pequeños golpes al fondo del tubo con el dedo
índice de la otra mano.
4. incubar a 37ºC por 30 min.
5. Después de la incubación, las muestras se pueden guardar en el refrigerador hasta
el siguiente periodo de laboratorio (si se desea, si no, puede continuar).

Mientras se espera el tiempo de incubación preparar el gel de agarosa para la

realización de la electroforesis

La concentración recomendada para el análisis de los fragmentos es agarosa al

1%. Esta concentración da una buena resolución de los fragmentos. Se recomienda
que el grosor del gel sea de 0.75 a 1 cm para facilitar su manejo.

29
 6. Después de la incubación, se le agrega a cada uno de los tubos 2 L de buffer
de carga, el cual contiene dos colorantes para poder monitorear la electroforesis.
Siempre se debe usar una punta de micropipeta nueva para cada tubo, de esta
manera se evita la contaminación cruzada.
7. Los tubos se mezclan bien.
8. Opcional: se pueden incubar las muestras de DNA a 65°C por 5 minutos y al
terminar, ponerlas en hielo.
9. Se retiran los peines y se coloca la bandeja dentro de la cámara de electroforesis
(los pozos del gel tienen que estar orientados hacia el catodo: electrodo con
carga negativa).
10. La cámara de electroforesis se llena TAE 0.25x hasta que se cubran los pozos.
11. Cargar 10l de cada muestra en pozos separados en la cámara con el siguiente
orden.

Pozo 1 2 3 4 5
M L P E H
M = Marcador de peso conocido

12. Una vez cargadas las muestras se coloca la tapa con los electrodos y se conecta
a la corriente (fuente de poder). Aplicar 200V por 20 min. Verificar que las
muestras corran hacia el lado positivo de la cámara.
13. Cuando termine la electroforesis, desconectar el equipo y observar el gel en el
transiluminador.
14. Fotografiar el gel para su análisis.

V. RESULTADOS

o Organización de datos

Uno de los primeros pasos para analizar los datos es determinar los tamaños
aproximados de cada uno de los fragmentos de restricción. Esto se puede hacer
comparando los fragmentos de DNA de restricción con fragmentos de DNA de tamaños
conocidos o estandarizados.

Se usarán dos métodos: El primero está basado en una valoración visual, la cual
no es tan precisa. El segundo método involucra la creación de una curva estándar. El
marcador que se utilizará para ambos métodos es el DNA digerido por HindIII lambda.

1. Usando una regla, mide la distancia (en mm) que cada uno de los fragmentos o
bandas que han migrado desde el pocillo. Mide la distancia desde la parte baja del
pozo a la línea baja de cada banda de DNA y registra los datos en lasiguiente
tabla.

30
 2. Valora los tamaños de cada banda en pares de bases. Compara la distancia
recorrida de las bandas conocidas (lamda, pstI, EcoRI) con las bandas de HindIII.
Escribe los datos estimados en la tabla.

3. Una forma más exacta para conocer el tamaño de fragmentos de DNA utiliza la
construcción de una curva estándar en base a las medidas obtenidas de las
bandas de HindIII. Después, se construye una curva estándar con las medidas
de los otros fragmentos y se determinará con precisión el tamaño de cada
fragmento.

*Tabla de datos: Mide la distancia en mm que cada fragmento migró, compara eltamaño
con el número de pares de bases de HindIII.

Ánálisis de los fragmentos de DNA

Los datos que escribiste en HindIII fueron las posiciones relativas de las bandas
de DNA de tamaño conocido. Como el tamaño y la posición exacta de estos fragmentos
es conocida, pueden ser usados como un punto de referencia para valorar el tamaño de
los fragmentos de DNA desconocidos.

La otra forma de determinar el número de pares de bases en los fragmentos de

DNA de tu gel, es usando una gráfica del tamaño de los fragmentos conocidos del DNA
estándar contra la distancia recorrida de cada banda de DNA para generar una curva
estándar. Se hace mejor en papel semilogaritmico

31
 Ya hecha la curva del control digerido con HindIII, ubicar en la gráfica las distancias
recorridas de una banda de DNA desconocida y hacer la relación con los pares de bases:
con ayuda de una regla perpendicular al eje x, sigue la distancia de banda hasta que
intercepte con la curva que trazaste. En ese punto, girar la regla para que quede paralela
al eje x y traza una línea hacia el eje y. Determinar el tamaño en pares de bases de ese
fragmento.

Utiliza una gráfica diferente para cada DNA (EcoRI, PstI, lambda).

1. Compara los dos métodos –examinación directa y gráfica semilogritmica—para

determinar el tamaño de los fragmentos en pares de bases. ¿Qué método es
más exacto? Explica porque.
2. Compare sus resultados experimentales con el análisis de restricción hecho
computacionalmente.

VI. DISCUSIÓN

VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFÍA

32
 Nombre de la práctica:
Biología Molecular Práctica Páginas Página 1
Transformación bacteriana con el plásmido
PGLO
Realizó: Revisó: Autorizó:

Fecha:

Contenido

I. INTRODUCCIÓN
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS
III. OBJETIVO
IV. METODOLOGIA
IV. 1. Material y equipo.
IV. 2. Procedimiento.
V. RESULTADOS.
VI. DISCUSION.
VII. CONCLUSIONES.
VIII. BIBLIOGRAFIA

33
34
I. INTRODUCCIÓN

Un gen es un fragmento de DNA que provee la información necesaria para sintetizar

una proteína particular, las cuales determinan las características físicas y químicas de
la célula.

Las bacterias poseen plásmidos que contiene genes para una o más características
que pueden ser beneficiosas para su sobrevivencia, y en la naturaleza pueden
transferirlos entre sí, permitiendo su adaptación a nuevos ambientes.

La transformación es el proceso por el cual una célula incorpora DNA exógeno tal que
esta nueva información provee al organismo de una nueva característica, alterando su
fenotipo y el de sus descendientes.

La transformación genética es un proceso utilizad en muchas áreas de la biotecnología,

para la inserción de uno o más genes con características deseables en un organismo:
en la agricultura genes que codifican para características como la resistencia contra
descomposición, congelación y alimañas; en la biorremediación, bacterias con genes que
le permiten digerir sustancias contaminantes; en la medicina el desarrollo de la terapia
genética; entre otras.

Los genes pueden ser aislados del genoma. El 1960 Osamu

Shimomura, Marty Chalfie y Roger Tsien identificaron y aislaron la
proteína responsable de la fluorescencia presente en Aequorea
victoria, denominada GFP (Green Fluorescent protein) por su
característica emisión de fluorescencia verdosa al ser iluminada por
luz ultravioleta. En 1992 se demostró que su expresión enorganismos
distintos de la medusa produce fluorescencia sin
requerir cofactor alguno. En 2008 les fue otorgado el Premio Nobel de Química por su
descubrimiento y desarrollo de la GFP.

La GFP se utiliza en disciplinas biológicas con fines principalmente

de marcaje de proteínas, cuyo análisis ha redefinido la comprensión
de muchos procesos biológicos incluyendo el plegamiento de
proteínas, el transporte de proteínas, la dinámica deRNA, y regiones
del DNA. De igual forma puede expresarse en diferentes estructuras
que permitan su distinción morfológica.

II. CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. ¿Cuáles son los principales métodos de transformación y su fundamento?

2. ¿Cómo se realiza una célula competente?

35
 3. ¿Cuáles son las características del plásmido pGLO?
4. Explique el sistema de regulación génica que posee el sistema pGLO.

III. OBJETIVOS

 Aprender los pasos del método de transformación bacteriana y sus aplicaciones

en la biología.
 Analizar e interpretar los resultados para calcular la eficacia de transformación.
 Comprender la regulación de la expresión génica por el operón de arabinosa.

IV. METODOLOGÍA

IV.1 Material
Tubos eppendorf estériles
Puntas para micropipeta estériles
Asa para sembrar
Mechero bunsen
Hielera
Reloj

Reactivos:
Células competentes de E. Coli
Plásmido pGLO
Solución de transformación
Medio LB/amp (2 cajas)
Medio LB/amp/ara (1 caja)
Medio LB (1 caja)
50 ml de LB
Hielo

Equipo:
Juego de micropipetas.
Baño de incubación a 37 y 42ºC
Incubadora

Nota: Medio de cultivo LB:

Triptona 10g
Extracto de levadura 5g
NaCl 5g

36
IV.2 PROCEDIMIENTO
1. Rotular un tubo eppendorf con +pGLO y otro con –pGLO.
2. Abra los tubos y utilizando una pipeta de transferencia estéril, añada 250
μl de la solución de transformación (CaCl2).
3. Coloque los tubos en hielo.
4. Con un asa de siembra tome una colonia de la placa con E.coli. Colóquelo
en el tubo +pGLO, y disperse en la solución girando el asa. Coloque el tubo
nuevamente en hielo. Repita con el tubo –pGLO.
5. Observe la solución del DNA pGLO bajo la luz ultravioleta. Anote sus
observaciones. Introduzca un asa en el tubo con el plásmido pGLO, cargar
el asa y mezclar en el tubo +pGLO.
6. Incube los tubos en hielo por 10 minutos
7. Rotule 4 placas de agar LB de la siguiente manera: LB/amp +pGLO,
LB/amp/ara +pGLO, LB/amp –pGLO, LB –pGLO.
8. Realice un choque térmico, al transferir los tubos al baño a 42 °C/50 seg.
Pasar inmediatamente a hielo e incubar por 2 min.
9. Agregar 250 μl de caldo LB en cada tubo e incube por 10 min a
temperatura ambiente.
10. Transfiera 100 μl de cada tubo a las placas correspondientes.
11.Extender la suspensión por la superficie de la placa utilizando un asa con
movimientos de izquierda a derecha.
12. Incubar a 37°C/12h.
13. Observar las cajas bajo luz normal y después bajo luz UV.

V. RESULTADOS

Control Transformadas
# colonias # colonias # colonias # colonias
totales transformadas totales transformadas
LB

LB-
amp

Carcular:
 Proporción de células transformadas:
𝐶𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠ƒ𝑜𝑟𝑚𝑎𝑑𝑎𝑠
=
𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

 Tasa de transformación:

37
 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
=
𝐶𝑎𝑛𝑡 𝐷𝑁𝐴 (µ𝑔)

Considera que:
ADN (µg) = Concentración ADN (µg/µl) x Volumen ADN (µl)
Fracción ADN utilizada = Volumen en la placa (µl) / Volumen total tubo
(µl)
ADN pGLO transferido (µg) = cantidad total de ADN pGLO usada (µg) x
fracción de ADN pGLO

VI. DISCUSIÓN

1. ¿Qué características inicialmente observadas en E. coli no parecen

haberse alterado?
2. De las características de E. coli iniciales ¿cuáles parecen ser
significativamente diferentes después de la transformación?
3. Si las células transformadas han adquirido la capacidad para crecer en
presencia del antibiótico ampicilina, ¿qué puedes decir acerca de losotros
genes presentes en el plásmido utilizado para la transformación?
4. Basándote en los resultados obtenidos, ¿cómo puedes demostrar que los
cambios producidos se deben al proceso realizado?
5. ¿Qué factores ambientales deben estar presentes para observar el color
verde?
6. ¿Qué ventajas tendrá para un organismo el poder activar o desactivar
determinados genes en respuesta a diferentes condiciones?

VII. CONCLUSIÓN

VIII. BIBLIOGRAFÍA

 Segal Kischinevzky C.A., Ortega Lule G.J. 2005. Manual De prácticas.

Biología molecular de la célula. Facultad de ciencias de la UNAM. México.
 Kit de transformación bacteriana con pGLO. Biotechnology Explorer. Bio-
Rad.

38
 Nombre de la práctica:
Práctica Páginas Página 1
Biología Molecular
Reacción en cadena de la polimerasa

Realizó: Revisó: Autorizó:

Fecha:

Contenido

I. INTRODUCCIÓN
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS
III. OBJETIVO
IV. METODOLOGIA
IV. 1. Material y equipo.
IV. 2. Procedimiento.
V. RESULTADOS.
VI. DISCUSION.
VII. CONCLUSIONES.
II. BIBLIOGRAFIA

39
 I. INTRODUCCIÓN

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), es una técnica de biología

molecular mediante la cual un pequeño fragmento de ácido desoxirribonucleico
(ADN) se clona o duplica varias veces para obtener copias múltiples. A través de
ciclos; donde en cada uno se duplica la cantidad de ADN, por lo que permite
obtener hasta mil millones de copias de un solo fragmento y en unas pocas horas.
Esta metodología fue ideada por el bioquímico estadounidense Kary B. Mullis en
1983 y desarrollada posteriormente por Mullis y su colaborador Fred A. Faloona
en una de las primeras compañías dedicadas a la comercialización de la
Ingeniería Genética la Cetus Corporation de Emeryville, California. Aunque la
utilidad de esta técnica no se reconoció inmediatamente, en 1991 su uso ya se
había generalizado. En 1993 Mullis obtuvo el Premio Nobel de Química por este
trabajo.
La idea básica de la técnica es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de
ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas,
ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas
(79ºC a 85ºC), de ahí su nombre comercial más conocido: taq polimerasa. Cuando
hacemos una reacción de PCR simulamos lo que sucedeen una célula cuando
se sintetiza el ADN y en el tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para
hacerlo: la polimerasa, el ADN del organismo que queremos estudiar –donde se
encuentra el fragmento que queremos sintetizar– , los oligonucleótidos (llamados
también primers, iniciadores, cebadores, ―oligos‖, etc.) necesarios para que se
inicie la transcripción, dinucleótidos (dNTPs), y las condiciones para que la enzima
trabaje adecuadamente (cierto pH, determinadas cantidades de magnesio en
forma de MgCl2, KCl, y pueden necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo
de cada polimerasa).
Ya que se tienen los tubos listos con todo lo necesario para que la síntesis del
fragmento que nos interesa que se lleve a cabo (taq polimerasa, dinucleótidos,
ADN, agua, buffer con magnesio y otras sales, y oligonucleótidos). El siguiente
paso es colocar los tubos en un termociclador, que básicamente sirve para

40
calentarlos o enfriarlos a temperaturas muy precisas. el termociclador calienta o
enfría los tubos a tres temperaturas distintas, que se repiten una y otra vez (lo que
se llama los ciclos de reacción), la primera es a 95ºC (y a este paso se le llama
desnaturalización) durante la cual las dobles cadenas del ADN se abren o
desnaturalizan, quedando en forma de cadenas sencillas; después el
termociclador ajusta la temperatura en un intervalo entre 40º y 60ºC (llamada de
alineamiento), a esta temperatura se forman y se rompen constantemente los
puentes de hidrógeno entre los oligonucleótidos
y el ADN, y aquellas uniones más estables (las que son complementarias) durarán
mayor tiempo, quedando los oligonucleótidos ―alineados‖ formando una pequeña
región de doble cadena. La polimerasa se une a este pequeño pedazo de ADN de
doble cadena y comienza a copiar en sentido 5’ a 3’; al agregar unas bases más,
los puentes de hidrógeno que se forman entre las bases estabilizan más la unión
y el oligonucleótido permanece en este sitio para el siguiente paso. Después la
temperatura sube a 72ºC (paso que se conoce como extensión), ya que 72ºC es
la temperatura en la cual la polimerasa alcanza su máxima actividad, y continúa
la síntesis de los fragmentos de ADN a partir de los oligonucleótidos que ya se
habían alineado. En el primer ciclo, con estas tres temperaturas, se sintetizarán
los primeros fragmentos a partir del ADNgenómico. Estos primeros fragmentos
no tendrán el tamaño esperado, serán un poco más grandes ya que la taq copiará
hasta donde le sea posible, pero como veremos más adelante, se obtendrán en
cantidades tan pequeñas que al final no podremos detectarlos. Después se repiten
una vez más las tres temperaturas, pero en este segundo ciclo, los
oligonucleótidos, además de unirse al ADN que pusimos al inicio, también se
unirán a los fragmentos recién sintetizados del primer ciclo (ver segundo ciclo de
la figura 1), por lo tanto en este segundo paso la polimerasa sintetizará 2
fragmentos largos copiados directamente del ADN y 2 fragmentos del tamaño
esperado, que es el tamaño que hay entre los dosoligonucleótidos que hemos
usado. De esta forma con cada ciclo aumentará el número de fragmentos del
tamaño que queremos. Cabe mencionar que antes y después de estos ciclos se
programan dos pasos, uno de 95ºC durante varios

41
minutos para iniciar con desnaturalización, y al final de los ciclos, un paso último
de extensión a 72ºC para permitir que la taq termine de sintetizar todos los
fragmentos que pueden haber quedado incompletos.
Dentro de las principales aplicaciones de la PCR se encuentran: Estudios
Arqueológicos, Medicina Forense, Genética, Pruebas de paternidad,
Investigaciones Biomédicas, Ambientales, Industriales y Diagnóstico Clínico. En
este último, los Laboratoristas Clínicos, pueden tomar una muestra mínima de
material genético, copiar la secuencia de interés las veces necesarias y generar
suficiente cantidad de muestra para detectar la presencia o ausencia de
patógenos y en muchos casos realizar la cuantificación del mismo.
PCR hace uso de los mismos procesos básicos que utilizan las células para
duplicar su ADN.
 Cadena complementaria de ADN de hibridación
 Síntesis de la hebra de ADN a través de la ADN polimerasa
Los dos cebadores de ADN proporcionadas en este kit están diseñados para
flanquear una secuencia de ADN dentro de su genoma y así proporcionar la señal
de inicio exacto de la ADN polimerasa a " concentrarse " y comenzó a sintetizar (
replicación ) copias de dicho ADN diana . Cadena complementaria de hibridación
tiene lugar cuando los dos cebadores hibridan diferentes , o se unena cada uno
de sus respectivas secuencias de bases complementarias en el ADN plantilla.
Los cebadores son dos moléculas cortas de ADN de cadena sencilla ( 23 bases
de largo ) , que es complementaria a una porción de una cadena de la plantilla, y
otro que es complementario a una porción de la cadena opuesta . Estos cebadores
se hibridan a la separado cadenas de molde y servir como puntos de partida para
el ADN Taq la replicación por la ADN polimerasa. Taq ADN polimerasa extiende
los cebadores apareados "leyendo " la cadena molde y sintetizando la secuencia
complementaria . De esta manera, Taq polimerasa replica los dos hebras de ADN
plantilla

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 II. CONOCIMIENTOS PREVIOS

• Qué características debe tener el ADN utilizado

• ¿Qué tipos de ADN polimerasas se pueden emplear para PCR y que
utilidad tienen?
• ¿Qué características debe tener el buffer para la mezcla de reacción?
• ¿Cuál es la función del Mg en la reacción de PCR?
• ¿Cómo se sabe la Tm de un primer?
• Factores que afectan la PCR
• Describir los tres pasos principales de cada ciclo de amplificación por
PCR y lo que ocurre en cada temperatura de las reacción.

III. OBJETIVO
Realizar la amplificacion de fragmentos de DNA previamente extraídos
mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

IV. METODOLOGÍA
IV.1 Material y equipo
• Micro tubos de ensayo 1,5 ml
• Tubos de PCR
• Tubos tapa rosca con 200 l de matriz InstaGene ™
• Espuma soporte para tubos
• P-20 micropipeta, 2-20 μl, 20-200 μl, 200-1000 μl
• Puntas de pipeta (tipo de filtro), 2-20 μl, 20-200 μl, 200-1000 μl
• Marcador permanente
• Copia de la Guía Rápida o en el protocolo
• Contenedor de residuos
• Bote o matraz para baño maría
• Vasos precipitado de 100, 50 mL
• Matraz EM

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 • Probeta
• Tubos ensayo
• Micropipeta 1, 5 mL
• Jeringas
• Vortex
• Plato caliente
• Bandejas para gel
• Centrifuga

IV.2 Reactivos y soluciones

• Tazas con 10 ml de solución salina al 0,9%
• Mezcla completa principal (con cebadores) sobre hielo 1 tubo.
• Hielo
• Muestras de PCR por estudiante
• MMR (ADN estándar)
• ADN XC PV92 carga de tinte.
• TAE 1x Tampón de electroforesis 275 ml.

IV.3 Requerimientos de seguridad

Bata blanca larga y de mangas largas. Necesario guantes, lentes o mascarilla
debido a que se trabajara con bromuro de etidio nuevamente.

IV.4 PROCEDIMIENTO

Preparación muestra de DNA por enjuague bucal

1. Cada miembro del equipo debe contar con 1 tubo de tapón de rosca que
contenga con 200 μl Matriz InstaGene ™, un micro tubo de ensayo de1,5 ml,
y una taza que contiene 10 ml de 0,9% de solución salina. Marque uno de
cada tubo y una taza con sus iniciales.

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2. No se deshaga de la solución salina después de completar este paso. Vierta
la solución salina de la copa en la boca. Enjuague vigorosamente durante 30
segundos. Expulsar a la solución salina de nuevo en la copa.

3. Con una micropipeta de 1000 μl pasar 1 ml de su enjuague bucal en el micro

tubo de ensayo con sus iniciales.

4. Hacer girar su tubo en una centrífuga balanceada durante 2 minutos a

velocidad máxima. Cuando la centrifugadora se ha detenido completamente,
retire el tubo. Usted debe ser capaz de ver una bolita de células blanquecinas
en la parte inferior del tubo. Idealmente, la pastilla debe ser de
aproximadamente del tamaño de la base del tubo. Si el pellet es demasiado
pequeño, verter la solución salina al sobrenadante, añadir más de su
enjuague de solución salina, y girar de nuevo.

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5. Retirar el sobrenadante y desechar. Teniendo cuidado de no perder el pellet
celular, cuidadosamente limpiar o golpear el micro tubo de ensayo en un
pañuelo o toalla de papel. No está mal que quede una pequeña cantidad de
solución salina (~ 50 μl, aproximadamente el mismo tamaño que la de
pellets) en la parte inferior de la tubo.
6. Resuspender el pellet del fondo por agitación o agitando los tubos hasta que
no queden grupos de células.
7. Usando una micropipeta de volumen ajustado a 20 μl, transferir sus células
resuspendidas en el tubo que contiene el tapón de rosca InstaGene con sus
iniciales. Puede que tenga que utilizar la pipeta varias veces para transferir
todas sus células.
8. Enrosque las tapas firmemente en los tubos. Agite manualmente o el vortex
para mezclar el contenido.
9. Colocar los tubos en a espuma para tubos de ensayo. Cuando todos los
miembros de su equipo han recogido sus muestras, flotar el soporte con
tubos en un baño de agua a 56 ° C durante 10 minutos. A mitad de camino (5
minutos), sacudir y agitar los tubos varias veces. Coloque los tubos de nuevo
en el baño de agua durante los 5 minutos restantes.

46
10. Retire los tubos del baño de agua y agitar varias veces. Ahora colocar el
soporte con los tubos en un baño de agua a 100 ° C durante 5 minutos.

11. Retire los tubos del baño de agua a 100 ° C y agitar varias veces para
resuspender la muestra. Coloque los ocho tubos en una centrífuga haciendo
girar durante 5 minutos a 6000 xg (o 10 minutos a 2.000 xg).

Amplificación por PCR (Protocolo de Laboratorio)

1. Obtener el tubo de tapón de rosca que contiene la plantilla de ADN genómico
de la nevera. Centrifugar los tubos durante 2 minutos a 6000 xg o durante 5
minutos a 2000 xg en una centrífuga.

2. Cada miembro del equipo debe obtener un micro tubo de ensayo y un tubo
de PCR y sin tapa. Etiquetar cada tubo de PCR en el lado del tubo con sus
iniciales y colocar el tubo de PCR en el tubo de prueba de micro sin tapa
como se muestra. Coloque el tubo de PCR en la espuma de retención del
tubos.

47
3. Transfiera 20 microL del templado de ADN , del sobrenadante de su tubo de
tapón de rosca a la parte inferior del tubo de PCR. No transferir cualquiera
de las perlas de matriz en la reacción de PCR, ya que se inhibe la reacción
de PCR.

4. Localice el tubo de color amarillo de la mezcla maestra de PCR (con la

etiqueta "Master") en el cubo de hielo.
5. Transfiera 20 microL de la mezcla maestra a su tubo de PCR. Mezclar con la
pipeta hacia arriba y abajo 2-3 veces. Tape el tubo de PCR herméticamente y
mantener en hielo hasta que sea instruido para proceder con el siguiente
paso. Evitar burbujas, especialmente en la parte inferior de los tubos.

6. 5. Retire el tubo de PCR del tubo de micro ensayo sin tapa y colocar el tubo
en el termociclador Gene o MyCycler termociclador.
7. 6. Cuando todas las muestras de PCR están en el termociclador, el profesor

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 comenzará la reacción de PCR. La reacción se someterá a 40 ciclos de
amplificación, que tendrá una duración aproximada de 3 horas.
8. Si su maestro le indica que debes hacerlo, ahora verterá sus geles de
agarosa (los geles pueden haber sido preparados de antemano por el
profesor).

Electroforesis en gel de muestras amplificadas de PCR

1. Retire sus muestras de PCR del termociclador y colocar en el micro tubo de
ensayo. Si una centrífuga está disponible, coloque los tubos de PCR en los
tubos de ensayo sin tapa y girar los tubos (~ 3 segundos a 2.000 xg) para
llevar a cabo la condensación que se pudo haber formado en las tapas a la
parte inferior de los tubos.
2. Añadir 10 μl de PV92 XC colorante de carga a cada tubo de PCR y mezclar
suavemente.
3. Obtener un gel de agarosa (ya sea el que usted vierte o una pre-vertido por
su profesor).
4. Coloque la bandeja de colada con el gel solidificado en ella, la plataforma en
el cuadro de gel y los pozos deben estar en el cátodo - extremo de la caja,
donde se conecta el cable negro.

5. Con mucho cuidado retire el peine del gel tirando de él hacia arriba,
lentamente.
6. Vierta ~ 275 ml de tampón de electroforesis en la cámara de electroforesis,

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 hasta que sólo cubra los pozos.
7. Cuando electroforesis este completa, desconecte la alimentación y retire la
tapa de la caja del gel. Retire con cuidado la bandeja de gel y el gel de la
caja de gel. Ten cuidado, el gel es muy resbaladizo. Empujar el gel fuera de
la bandeja de gel con el dedo pulgar y cuidadosamente deslícelo en la
bandeja de tinción de plástico.

V. RESULTADOS
VI. DISCUSIÓN
VII. CONCLUSIÓN
VIII. BIBLIOGRAFÍA
• Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989). «Gel electroforesis of
DNA» en: Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (Eds.) Molecular
Cloning: a Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, capítulo 6.
• Westermeier, R. (1997). Electroforesis in Practice: a Guide to Methods
and Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.

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