UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS
ACADEMIA DE BIOQUMICA

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUMICA GENERAL

MEDICINA (PLAN NUEVO)
PROPUESTA DE HOMOLOGACIN CON ODONTOLOGA Y ENTRENAMIENTO
DEPORTIVO

FECHA DE ACTUALIZACIN MAYO 2012

DRA. LAURA A. DE LA ROSA CARRILLO

Contenido
PRACTICA #. 1................................................................................................................................................ 3
BIOSEGURIDAD Y MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO ..................................................................... 3
PRCTICA #2 ................................................................................................................................................. 9
MANEJO DEL POTENCIMETRO Y TITULACIN CIDO BASE ....................................................................... 9
PRACTICA # 3............................................................................................................................................... 13
REACCIONES DE IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS................................................................................. 13
PRACTICA # 4............................................................................................................................................... 17
Prctica # 5 .................................................................................................................................................. 22
ANALISIS ENZIMATICO CUALITATIVO.......................................................................................................... 22
Prctica # 6 .................................................................................................................................................. 25
EXTRACCIN DE GLUCOGENO Y REACCIONES DE IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS......................... 25
Prctica # 7 .................................................................................................................................................. 29
CUANTIFICACION DE COLESTEROL SERICO ................................................................................................. 29
Prctica # 8 .................................................................................................................................................. 48
METABOLISMO ANAEROBIO: REACCIN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA ............................. 48

PRACTICA #. 1
BIOSEGURIDAD Y MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO
OBJETIVO
Que el alumno se familiarice con el material como de instrumentacin aplicable a tcnicas de
experimentacin en el rea bioqumica as como con el material Peligroso Biologico infeccioso, su
manejo y desecho adecuado, de acuerdo a las normas mexicanas NOM-087 y NOM 052.

PRERREQUISITOS
1.- Conocimientos sobre diluciones, soluciones y mezclas.
2.- Definicin de cido, base y amortiguador.
3.- Conocimiento bsico del manejo del potencimetro y el fotocolormetro.
4.- Que es una solucin Molar, Normal y % w/v

INTRODUCCION
Para llevar a cabo con xito un experimento en cualquier laboratorio es necesario que se manejen
tcnicas bsicas de experimentacin tales como:
- Tcnicas de medicin de lquidos.
- Tcnicas de pesado de slidos.
- Tcnicas de mezclado de lquidos y slidos.
Todas estas tcnicas se relacionan con frecuencia con las actividades que cotidianamente se llevan a
cabo en el laboratorio de Bioqumica. A continuacin se dan algunos datos sobre cada una de estas
tcnicas.
Medicin de lquidos: Los instrumentos de medicin de lquidos ms utilizados son: pipetas, probetas y
matraces volumtricos. Las pipetas sirven para medir volmenes de hasta 25 ml. En este rango de
volumen, las pipetas tienen un uso muy frecuente en el laboratorio por su exactitud y confiablilidad. hay
dos tipos generales de pipetas: las serolgicas y las volumtricas.
La pipetas serolgicas miden volmenes diversos debido a que estn graduadas en diferentes medidas,
por ejemplo, una pipeta de 1.0 ml. esta graduada en dcimas de mililitro y por lo tanto sirve para la
medicin de cualquier volumen menor de 1.0 ml. Las pipetas ms frecuentemente usadas son de 1.0,
2.0, 5.0 y 10.0 ml..
Las pipetas volumtricas slo miden volmenes fijos ya que estn graduadas para medir un solo
volumen, por ejemplo, una pipeta volumtrica de 1.0 ml. solo servir para medir este volumen.
Algunas pipetas estn diseadas para que al momento de liberar el lquido que se est midiendo quede
una pequea porcin en la punta de las mismas, esta porcin debe dejarse contenida en la pipeta
3

porque de otra manera se introducir un error en la medicin. La manera de reconocer este tipo de
pipetas es por las letras TD ( To Deliver ) que se encuentran en la parte superior de la pipeta. Otras
pipetas estn diseadas para liberar todo el volumen incluyendo la porcin que se queda en la punta,
este tipo de pipetas se reconocen por las letras TC ( To Contain ), en este caso, si no se libera el total del
lquido medido se incurre en un error de medicin.
Las buretas varan en tamao, generalmente de 1 a 100 ml. El flujo del lquido es controlado por una
llave de vidrio o de tefln. Si es de vidrio requiere lubricacin. Las buretas deben llenarse por arriba de
la marca de cero y posteriormente abrir la llave cuidadosamente para que fluya el lquido y el menisco
se ajuste a cero. Dentro de los usos indicados para las buretas se encuentran las titulaciones y para
medicin de volumenes de lquidos txicos, cidos, sustancias corrosivas, etc.
Las probetas son cilindros graduados que miden volmenes por arriba de los 25 ml. todas ellas son
usadas para medir volmenes diversos, por ejemplo, con una probeta de 50 ml. se pueden medir
volmenes de 26, 38 o 42 ml etc.. Estos volmenes se denotan por marcas que se encuentran entre una
graduacin y otra. las probetas ms frecuentemente utilizadas son: 50, 100, 250, 500 y 1000 ml.. Para
medir volumen en una probeta se tiene que tomar en cuenta la siguiente regla: La superficie de un
lquido dentro de una probeta siempre forma una curva o menisco. El diseo de la probeta esta hecho
para medir volmenes exactos al igualar la parte inferior del menisco con la graduacin. Si se mide el
volumen con la parte superior del menisco, se incurrir en un error.
Los matraces volumtricos, tambien llamados de aforacin, sirven para medir volmenes exactos y son
usados cuando se hacen soluciones porcentuales y molares. Los matraces ms frecuentemente usados
son de 50, 100, 500 y 1000 ml.. El uso de estos matraces sigue la misma tcnica de medicin que las
probetas.
Todos los recipientes arriba mencionados son material de vidrio, por lo tanto, estn expuestos a
cambios de tamao en altas y bajas temperaturas y esto puede modificar drsticamente la exactitud de
la medicin. El diseo de este material de cristalera est hecho para medir volmenes a una
temperatura promedio de 25C.
Medicin de slidos: La balanza granataria y la balanza analtica son las ms utilizadas en la medicin de
reactivos qumicos de textura slida. La granataria tiene una exactitud de aproximadamente una
dcima de gramo, se utiliza para pesar cantidades mayores de un gramo y cuando la precisin no sea
menor de 0.1 g.
La balanza analtica se utiliza cuando el peso deseado requiera una precisin menor de 0.1 g. Es uno de
los instrumentos ms sensibles y permite pesar hasta dcimas de miligramo.
Sin embargo, el uso de ambos tipos de balanzas requiere de cuidados bsicos comunes tales como:
limpieza completa de todas las partes de la balanza; mantener la tara especfica de la balanza antes de
cualquier pesada y hacer pesadas racionales con respecto a la capacidad de la balanza.
Las balanzas de torcin son tiles en el laboratorio de bioqumica como una herramienta para el buen
uso de la centrfuga ya que para equilibrar los tubos de centrfuga siempre debe hacerse en base al peso
y no al volumen del contenido.
4

La centrfuga es un aparato que permite separar slidos de lquidos. Es un instrumento que separa
suspensiones a alta velocidad. El material slido se queda en la base del recipiente (sedimento) y la
porcin lquida en la parte superior del recipiente (lquido sobrenadante).
Los recipientes utilizados en la centrfuga generalmente son tubos de ensayo y estos siempre deben
balancearse en cuanto a peso y al ser colocados en la centrfuga siempre debe ser en direcciones
opuestas.
Mezclado de lquidos y slidos: Las soluciones normales, molares y porcentuales as como los diferentes
tipos de diluciones son las mezclas ms utilizadas en el laboratorio. Frecuentemente, las soluciones
involucran mezclas de slidos en lquidos o de lquidos en lquidos en tanto que las diluciones solo
involucran mezclas lquidos en lquidos. De la destreza con que se lleven a cabo estas mezclas depende
el xito de la experimentacin en el laboratorio.
El fotocolormetro permite cuantificar concentracin de sustancias en base al color desarrollado. La
concentracin de una sustancia en solucin generalmente es determinada por una reaccin de color,
siendo el principio general que a mayor concentracin de la sustancia en la solucin mayor ser la
intensidad del desarrollo del color. Los fotocolormetros son instrumentos que nos sirven para hacer
estas determinaciones.

Residuos peligrosos biolgicos infecciosos

Qu son los residuos peligrosos biolgicos infecciosos?
Los residuos peligrosos biolgicos infecciosos en lo sucesivo (RPBI), son aquellos que se generan durante
las actividades asistenciales a la salud de humanos o animales en los centros de salud, laboratorios
clnicos o de investigacin, bioteros, centros de enseanza e investigacin, principalmente; que por el
contenido de sus componentes puedan representar un riesgo para la salud y el ambiente.

Cules son considerados los RPBI?

De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, son considerados los
siguientes:
La sangre
La sangre y los componentes de sta, slo en su forma lquida, as como los derivados no comerciales,
incluyendo las clulas progenitoras, hematopoyticas y las fracciones celulares o acelulares de . la
sangre resultante (hemoderivados).
Los cultivos y cepas de agentes biolgico-infecciosos
Los cultivos generados en los procedimientos de diagnstico e investigacin, as como los generados en
la produccin y control de agentes biolgico-infecciosos.

Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes
biolgico-infecciosos.
Los patolgicos
Los tejidos, rganos y partes que se extirpan o remueven durante las necropsias, la ciruga o algn otro
tipo de intervencin quirrgica, que no se encuentren en formol.
Las muestras biolgicas para anlisis qumico, microbiolgico, citolgico e histolgico, excluyendo orina
y excremento.
Los cadveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes enteropatgenos en centros de
investigacin y bioterios.
Los residuos no anatmicos
Son residuos no anatmicos los siguientes:
Los recipientes desechables que contengan sangre lquida.
Los materiales de curacin, empapados, saturados, o goteando sangre o cualquiera de los siguientes
fluidos corporales: lquido sinovial, lquido pericrdico, lquido pleural, lquido Cfalo-Raqudeo o lquido
peritoneal.
Los materiales desechables que contengan esputo, secreciones pulmonares y cualquier material usado
para contener stos, de pacientes con sospecha o diagnstico de tuberculosis o de otra enfermedad
infecciosa segn sea determinado por la SSA mediante memorndum interno o el Boletn
Epidemiolgico.
Los materiales desechables que estn empapados, saturados o goteando sangre, o secreciones de
pacientes con sospecha o diagnstico de fiebres hemorrgicas, as como otras enfermedades infecciosas
emergentes segn sea determinado por la SSA mediante memorndum interno o el Boletn
Epidemiolgico.
Materiales absorbentes utilizados en las jaulas de animales que hayan sido expuestos a agentes
enteropatgenos.
Los objetos punzocortantes
Los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biolgicas durante el
diagnstico y tratamiento, nicamente: tubos capilares, navajas, lancetas, agujas de jeringas
desechables, agujas hipodrmicas, de sutura, de acupuntura y para tatuaje, bisturs y estiletes de
catter, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el laboratorio, el cual deber desinfectar o
esterilizar antes de ser dispuesto como residuo municipal.

Por qu representan un riesgo a la salud o al ambiente?

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Por sus caractersticas, ya que pueden contener agentes biolgicos infecciosos que se definen como
cualquier microorganismo capaz de producir enfermedades cuando esta presente en
concentraciones suficientes (inculo), en un ambiente propicio (supervivencia), en un
hospedero susceptible y en presencia de una va de entrada).

Existe regulacin para los RPBI?

Con la finalidad de prevenir alguna situacin de emergencia debida al mal manejo de los RPBI, la
autoridad Ambiental (SEMARNAT) public el 7 de noviembre de 1995 la Norma Oficial Mexicana NOM087-SEMARNAT-1995, Que establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento,
recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos
que se generan en establecimientos que presten atencin mdica.
Debido a que esta Norma present algunos problemas de interpretacin como en su aplicacin, se
gestiono en coordinacin con la Secretara de Salud, su modificacin, derivndose el 1 de noviembre de
2001 el Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2000, Proteccin Ambiental Salud Ambiental Residuos Peligrosos Biolgico-Infecciosos Clasificacin y especificaciones de
manejo. De este proyecto se derivaron 370 comentarios, mismos que fueron contestados y publicados
en el Diario Oficial de la Federacin el da 20 de enero de 2003.
Finalmente el 17 de febrero de 2003 se publica en el Diario Oficial de la Federacin la Norma Oficial
Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Proteccin Ambiental Salud Ambiental Residuos
Peligrosos Biolgico-Infecciosos Clasificacin y especificaciones de Manejo.

A quines aplica la NOM-087-SEMARANT-SSA1-2002?

Con base en el campo de aplicacin de esta norma es de observancia obligatoria a todos aquellos que
por sus actividades generen los RPBI descritos en la Norma, sin importar el volumen de sus generacin,
aclarando que aquellos que su generacin sea menor a 25 kilogramos al mes, podrn ubicarse como
generadores de Nivel I, esto para el tiempo de almacenamiento de sus RPBI.

Existe otra Norma Oficial Mexicana donde aparezcan los RPBI?

Existe la Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005 que establece las caractersticas, el
procedimiento de identificacin, clasificacin y los listados de los residuos peligrosos, sin embargo esta
es de carcter General, por lo que para los RPBI prevalecen las condiciones establecidas en la NOM087-SEMARNAT-SSA1-2002.

Cul es la infraestructura para el tratamiento de los RPBI?

A partir de la publicacin de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-1995, se desarrollo la

infraestructura para el tratamiento de este tipo de residuos, con la condicin de que dicha norma
establece que los residuos denominados patolgicos sean incinerados, por ese motivo se incremento el
nmero de hornos para el tratamiento de los residuos, sin embargo han sido muchos equipos que han
cerrado por no cumplir con los parmetros establecidos en la Norma Oficial Mexicana NOM-098SEMARNAT-2002, Proteccin ambiental-Incineracin de residuos, especificaciones de operacin y
lmites de emisin de contaminantes. Actualmente la incineracin es uno de los procesos de tratamiento
ms observados por las asociaciones no Gubernamentales por ese motivo se concluye que las empresas
que actualmente cuentan con esta autorizacin son capaces de cumplir con los parmetros establecidos
en la NOM-098.

PRCTICA #2
MANEJO DEL POTENCIMETRO Y TITULACIN CIDO BASE
OBJETIVO:
Que el alumno conozca el instrumento de medicin, principios y fundamento para aplicarlo en las
caractersticas cido base de las soluciones.
Observar una reaccin acido-base fuerte utilizando un indicador de pH y comprobar el pH de la solucin
mediante el uso del potencimetro.

INTRODUCCIN:
El potencimetro, es un sensor utilizado en el mtodo electroqumico como equipo de medicin, en la
cuantificacin del potencial Hidrgeno (pH) de cualquier disolucin.
La determinacin del pH, consiste en medir el potencial que se desarrolla a travs de una fina
membrana de vidrio que separa dos soluciones, con diferente concentracin de protones. En
consecuencia, se conoce la sensibilidad y la selectividad de las membranas de vidrio ante el pH.
Un electrodo para medir el pH consiste en un par de electrodos, uno de calomel (mercurio, cloruro de
mercurio) y otro de vidrio, sumergidos en la disolucin en la que queremos encontrar el pH. El soporte
del electrodo es de vidrio comn y no es conductor, mientras que el bulbo sensible se encuentra
formado por un vidrio polarizable (vidrio sensible de pH). Se llena el bulbo con la solucin de HCl 0.1N
saturado con AgCl. El voltaje en el interior del tubo es constante (pH 7) de manera que la diferencia de
potencial solo depende del pH del medio externo. El alambre que se sumerge al interior (normalmente
Ag/AgCl) permite conducir este potencial hasta un amplificador.
El pH metro es relativamente inmune a las interferencias de color, turbidez, material coloidal, cloro
libre, substancias oxidantes y/o reductoras. La medicin es afectada solo cuando la superficie de la
membrana est sucia con grasa o material orgnico insoluble en agua, que le impide hacer contacto con
la muestra, por lo que se recomienda la limpieza escrupulosa de los electrodos. Los electrodos deben ser
enjuagados con agua destilada entre muestras (el uso adecuado de la pizeta es de vital importancia),
posteriormente deber secarse el electrodo preferentemente con papel klenex o papel sanitario de
textura suave pero que no deje pelusa, nunca debe secarse con tela porque podra cargase
electrostticamente.
Como los electrodos de vidrio de pH cuantifican la concentracin de H+ relativa a sus referencias, deben
ser calibrados peridicamente para asegurar la precisin, es por eso que se utilizan soluciones
especficas llamadas buffers de calibracin (disoluciones reguladoras de pH conocido). Estas soluciones
son: solucin buffer (fosfato) de pH 7 color amarillo, solucin buffer (biftalato) de pH 4 color rojo,
solucin buffer (borato) de pH 10 color azul.
INTRODUCCION
9

Es una tcnica o mtodo de anlisis cuantitativo muy usada, que permite conocer la concentracin
desconocida de una disolucin de una sustancia que pueda actuar como cido o base, neutralizndolo
con una base o cido de concentracin conocida.1 Es un tipo de valoracin basada en una reaccin
cido-base o reaccin de neutralizacin entre el analito (la sustancia cuya concentracin queremos
conocer) y la sustancia valorante.
Un indicador de pH es una sustancia que permite medir el pH de un medio. Habitualmente, se utilizan
como indicador sustancias qumicas que cambian su color al cambiar el pH de la disolucin. El cambio de
color se debe a un cambio estructural inducido por la protonacin o desprotonacin de la especie. Los
indicadores cido-base tienen un intervalo de viraje de unas dos unidades de pH, en la que cambian la
disolucin en la que se encuentran de un color a otro, o de una disolucin incolora, a una coloreada.
Los ms conocidos son el naranja de metilo, que vira en el intervalo de pH 3,1 - 4,4, de color rojo a
naranja, y la fenolftalena, que vira desde un pH 8 hasta un pH 10, transformando disoluciones incoloras
en disoluciones con colores rosados / violetas.
Los indicadores de pH tienen una constante de protonacin, K, que informa sobre el desplazamiento de
la reaccin de protonacin de la forma bsica del indicador.

Se dice que el cambio de color de un indicador es apreciable cuando la concentracin de la forma cida
o de la forma bsica es superior o igual a 10 veces la concentracin de la forma bsica o la forma cida
respectivamente.

MATERIALES
2 buretas 50 mL
2 Matraz erlenmeyer 150 ml
HCl 0.1N
NaOH 0.1N
Fenolftaleina

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pHmetro digital porttil Conductronic pH 10, modelo 1024, electrodo y batera cuadrada. El electrodo
debe mantenerse siempre humedecido.
MATERIALES
2 buretas 50 mL
2 Matraz erlenmeyer 150 ml
HCl 0.1N
NaOH 0.1N
Fenolftaleina
1. Calibracin del pHmetro
Para su calibracin a un punto:
1. Conecte el electrodo al instrumento y encienda la tecla ON.
2. Introduzca el electrodo en la solucin patrn de pH 7 y permita la lectura que la lectura se estabilice
(aproximadamente 30 seg).
3. Ajuste la perilla de compensacin de temperatura temp oC a la temperatura de la solucin patrn
(buffer).
4. Ajuste la perilla de calibracin calbrate, hasta que el medidor indique el valor pH 7.0 de la solucin
patrn (buffer).
5. Retire el electrodo de la solucin patrn (buffer) y enjuguelo muy bien con agua destilada (pizeta),
pero no seque el electrodo.
6. Ajuste la perilla de compensacin de temperatura temp. oC a la temperatura a la temperatura de la
solucin a medir.
7. Introduzca el electrodo en la solucin a medir y lea el valor pH del medidor. Si el valor de la solucin
no est entre 3 unidades de pH de la solucin patrn (7.0 pH), se necesita hacer una calibracin a
dos puntos (con dos buffers de diferente pH, 7 y 4, o 7 y 10 dependiendo de las soluciones que vaya
a manejar).
8. Despus de cada medicin, retire el electrodo y enjuguelo muy bien con agua destilada (pizeta)
Calibracin a dos puntos
1. Siga los pasos de calibracin a un punto hasta el paso 5
2. Sumerja el electrodo en la segunda solucin patrn de pH 4.00 o pH 10.00. La temperatura de esta
solucin patrn debe ser idntica a la de la primera
3. Ajuste el control de pendiente slope, hasta que el medidor indique el valor del pH de la segunda
solucin patrn.
4. Retire el electrodo, enjuguelo con agua destilada y proceda a efectuar las mediciones. No olvide
enjuagar el electrodo muy bien con agua destilada (pizeta) despus de cada medicin.
Precauciones
El pHmetro debe siempre mantenerse en su estuche si no se est utilizando, con respecto al electrodo
deber mantenerse en la solucin buffer de pH 4.0, misma que se encuentra en el pequeo recipiente
en el que descansa el electrodo.
11

2. Titulacin cido base

1. Verter NaOH y HCl en buretas graduadas.
2. Tomar 20 mL de HCl y colocarlo en un matraz erlenmeyer.
3. Medir el pH de la solucion un potencimetro
4. Agregar 4 gotas de fenolftalena y mezclar
5. Agregar gota por gota NaOH a los 20 mL de HCl siempre mezclando
6.

Observar cambios de coloracin.

7. Una vez obtenido el cambio de coloracin del indicador de pH medir una vez ms el pH de la
solucin ahora titulada.
RESULTADOS
Volumen de NaOH utilizado durante la titulacin de HCl_____________
Concentracin de NaOH y de HCl en la solucin final ______________
Establecer la relacin entre el indicador de pH y el pH obtenido con el potencimetro.

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PRACTICA # 3
REACCIONES DE IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS
OBJETIVO
Al trmino de esta practica el alumno sera capaz de diferenciar a los aminocidos utilizando tcnicas
colorimtricas mas comunes para identificarlos, as cmo, relacionar la estructura de los aminocidos
con su reactividad y sus funciones en el organismo.
PREREQUISITOS
1.- Conocer las caracteristicas diferenciales de la estructura de los aminocidos.
2.- Identificar las diferencias y semejanzas de los aminocidos con otros monmeros (por ejemplo :
carbohidratos y lpidos).
3.- Identificar las propiedades qumicas en base a su polaridad.
INTRODUCCION
Los aminocidos son los monmeros que dan la estructura de los polmeros conocidos como protenas o
polipptidos, 20 tipos de aminocidos, son los principales componentes de las protenas, los cuales
poseen las siguientes caracteristicas estructurales:

Contienen un carbn asmetrico (con excepcin de la glicina) llamado carbono alfa. Al cual se le unen
cuatro radicales que son:
- un grupo carboxilo (COO-)
- un grupo amino (+NH3)
- un tomo de hidrgeno (H)
- un radical de composicin variable que permite diferenciar a los aminocidos (R). Llamado cadena
lateral.
Debido a las caracteristicas fisicoqumicas de la cadena lateral, es posible relacionar su posicin, dentro
de la estructura proteca ya que si es de caracteristicas no polares (hidrofbico), al contacto con el agua
tender a esconderse; o en su defecto, si es de caracteristicas polares (hidroflico), tender a
interaccionar con el agua. Desde luego, para saber cual es la estructura de la cadena lateral debemos de
conocer cual es el pH de la solucin ya que dependiendo del pH la cadena lateral estar protonada (H+) o
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desprotonada, este parmetro se puede conocer utilizando los pKa de cada aminocido y la ecuacin de
Henderson-Hasselbach lo cual permite determinar cual es la estructura predominante a un pH dado.
Los cambios de carga observados en el aminocido mostrado, dependen del pH en que se encuentre el
aminocido, ya que como se observa en la figura anterior, bajo condiciones cidas el aminocido est
totalmente protonado y en condiciones alcalinas est totalmente desprotonado, esto se debe a que los
aminocidos son cidos dbiles y por lo tanto tienen una constante de disociacin por cada grupo o
radical capaz de comportarse como cido o base dbil. Esto permite conocer el punto isoeltrico de un
aminocido, el cual se define como el pH en el cual la carga neta es cero.
Los aminocidos que son utilizados para la sntesis de protenas son 20, los cuales se les ha identificado
como aminocidos naturales y los no naturales son los que an cuando siendo aminocidos, no forman
parte estructural de las protenas (no estn codificados en el cdigo gentico).
El cuerpo humano es incapaz de sintetizar los 20 aminocidos requeridos para la formacin de todas las
protenas y por lo cual partiendo de esta base, los aminocidos se dividen en : esenciales; porque es
necesario que el individuo ingiera en la dieta y no esenciales; los cuales son producidos por el propio
organismo y por lo tanto no es crtico si el individuo no los consume en su dieta. Cabe hacer notar, que
los 20 aminocidos son importantes para el buen desarrollo del organismo.
MATERIAL.1.-15 tubos de ensaye
5.-pipetas de 5.0 ml
2.-gradilla
6.-pipeta de 10.0 ml
3.-pipetas de 1.0 ml
7.-Bureta
4.-pipetas Pasteur
METODOLOGIA
Nota.- A menos que se especifique, todos los volmenes a aadir estn dados en mililtros (ml)
Experimento No. 1
Prueba de sullivan
REACTIVOS

BLANCO

PATRON

PROBLEMA

AGUA

0.5

-----------

--------

CISTEINA

----------

0.5

---------

NH4OH

2 gotas

2 gotas

2 gotas

NaCN

0.5

0.5

0.5

NITROPRUSIATO DE

2 gotas

2 gotas

2 gotas
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SODIO
Sol. Problema

------------

----------

0.5

Experimento No. 2
Reaccin de identificacin de fenoles para-sustituidos (tirosina)
REACTIVOS

BLANCO

PATRON

PROBLEMA

AGUA

1.0

---

---

TIROSINA

---

1.0

---

PROBLEMA

---

---

1.0

NITROSONAFTOL

2 gotas

2 gotas

2 gotas

2 gotas

2 gotas

Mezclar y calentar en bao a ebullicin durante 5 minutos.

ACIDO NITRICO

2 gotas

La aparicin de un color rosa violceo es positiva.

Experimento No. 3
Reaccin de identificacin de aminocidos con ninhidrina
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un agente oxidante que reacciona con todos los alfa
aminocidos dando un color purpura. La prolina e hidroxiprolina da un color amarillo.
REACTIVOS

BLANCO

PATRON

PROBLEMA

AMINOACIDO

---

1.0

---

PROBLEMA

---

---

1.0

NINHIDRINA

1.0

1.0

1.0

AGUA

1.0

---

1.0

Mezclar y calentar en bao de agua hirviendo durante 10 min.

La aparicin de un color azul violceo es positiva con excepcin de la prolina y la hidroxiprolina.
RESULTADOS
En la siguiente tabla indicar si los resultados del problema fueron positivos o negativos.
Tubo

EXP. No. 1

EXP. No. 2

EXP. No. 3

15

1
2
3
4
Por lo cual conclumos que el o los aminocidos presentes en la muestra son:______________
CUESTIONARIO
1.- Mencione 5 diferencias fundamentales tanto qumicas como bioqumicas que permiten diferenciar a
los aminocidos de los carbohidratos y de los lpidos.
2.- Existe un enorme grupo de aminocidos no naturales, mencione 10 ejemplos e indique su
importancia bioqumica.
3.- Cmo se calcula el punto isoelctrico de un aminocido?
4.- Cual es el fundamento de la reaccin de Pauly.
5.- Que importancia mdica tiene la identificacin de los aminocidos.?
6.- Cul es el mecanismo de identificacin de aminocidos al utilizar ninhidrina.
7.- Cul es la funcin del cianuro de sodio en la reaccin del nitroprusiato?

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PRACTICA # 4
IDENTIFICACION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS

INTRODUCCION:

La palabra protena proviene del griego preemintente, que significa primero. Fue
inicialmente propuesta por Berzelius en 1838 para referirse a una serie de compuestos
orgnicos con cierta complejidad, nitrogenados, que se encuentran altamente distribuidos en la
naturaleza y son la base estructural y funcional de todo organismo vivo.
Las protenas estn compuesta por aminocidos naturales ordenados en una secuencia
discreta, y unidos entre si por enlaces peptdicos que siempre involucran radicales amino y
carboxilo de cada aminocido de la siguiente manera:
Aminocido 1:

Aminocido 2:

NH2-CH-COOH

H-N-CH-COOH

H R
Prdida de Agua

Enlace peptdico:

La variabilidad de las protenas se debe a una serie de aspectos tales como:

complejidad estructural, residuos aminocidos que la forman, propiedades qumicas y fsicas de
cada protena en el organismo que la contiene.
Por tanto el anlisis qumico de las protenas en base a sus propiedades es muy amplio.
Ya que la identificacin de protenas es muy importante en el campo medico, clnico y
para su investigacin, existen tcnicas muy utilizadas con este objetivo. En esta ocasin
consideramos algunas como: reaccin de Xantoproteica, reaccin con ninhidrina y reaccin de
Biuret.
Reaccin Xantoproteica:
Esta reaccin afecta la integridad estructural de los residuos aminoacdicos de las
protenas. Es debida a la formacin de un compuesto aromtico nitrado de color amarillo,
cuando las protenas son tratadas con cido ntrico concentrado. La prueba es especfica, y da
resultado positivo en aquellas protenas con aminocidos portadores de grupos bencnicos,
especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un
lcali vira a un color anaranjado oscuro (anillo por esterificacin).

Reaccin de Biuret:
17

Entre las reacciones coloreadas especficas de las protenas, que sirven por tanto para
su identificacin, destaca la reaccin de Biuret. Esta reaccin la producen los pptidos y las
protenas, pero no los aminocidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptdico CO-NH
que se destruye al liberarse los aminocidos. En el reactivo de Biuret (CuSO 4 + NaOH), el Cu,
en un medio fuertemente alcalino, se coordina con los enlaces peptdicos, formando un
complejo de color violeta, cuya intensidad de color depende de la concentracin de protenas.
Reaccin con Ninhidrina:
Al igual que las otras reacciones, esta forma un complejo color prpura, para todas las
sustancias o mezclas que presentan aminocidos. No es especfica como las anteriores, pero
es de gran ayuda para la identificacin primaria de protenas, que despus nos lleven a
realizar ms pruebas de identificacin ya especfica.

Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es tambin una tcnica

de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena concreta,
cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el
diagnstico de enfermedades, as como para otros muchos propsitos.
Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se
basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, b) para la
formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos
colorantes. En la Tabla I se recogen los mtodos ms usados as como algunas de sus
ventajas e inconvenientes.

Tabla I. Principales mtodos para la cuantificacin de protenas, principales ventaja e

inconvenientes
Mtodo
Mtodos de Absorcin

Ventajas
No se pierden las muestras

Mtodos Derivados Colorimtricos

Biuret
Bastante especfico para
protenas
Muestra pocas interferencias
Es barato
Lowry
Tiene bastante sensibilidad

Bradford

Muy sensible

BCA
Mtodos Derivados Fluorimtricos
o-ftalaldehido
Muy sensible

Inconvenientes
Interfieren muchos
compuestos que absorben en
el UV
Tiene poca sensibilidad

No todas las protenas

reaccionan igual
Mustra muchas interferencias
como detergentes no inicos,
sulfato amnico etc.
Muestra interferencias con
detergentes
Es el mtodo mas sensible
Es el que muestra menos interferencias
La interferencia de aminas
contaminantes en la muestra
No todas las muestras
reaccionan igual

18

En esta prctica para la cuantificacin de protenas por el metodo de Biuret, se realizara: una
curva estndar, el clculo del coeficiente de extincin y el rango de sensibilidad. Se realizar la
cuantificacin de dos muestras problemas de baja y alta concentracin, respectivamente, y se
discutir las ventajas e inconvenientes de cada uno de los mtodos.

OBJETIVO:
Identificar protenas por la presencia de enlaces peptdicos y grupos aromticos, y
cuantificarlas mediante la tcnica de Biuret.

MATERIAL:
-

15 tubos de ensaye
1 gradilla
5 pipetas de 1.0mL
4 pipetas Pasteur
2 pipetas de 5.0mL
1 pipeta de 10.0mL
1 bureta

METODOLOGIA:
Experimento No. 1: Identificacin de protenas
A) Reaccin de Ninhidrina
Los estndares utilizados para esta prueba sern Peptona, Gelatina, Albmina y
Tirosina. Tomar estndares en tubos limpios y etiquetados.
Colocar las cantidades indicadas de estos standares y de ninhidrina en tubos por
separado, como se muestran en el siguiente cuadro:

Tubo
1
2
3
4
5 (blanco)

Estandar (mL)
0.5 peptona
0.5 gelatina
0.5 albmina
0.5 tirosina
-

Agua Dest. (mL)

0.5

Ninhidrina (mL)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5

Se dejan reposar las soluciones de cada tubo por 10 minutos para leer resultados.
19

B) Reaccin Xantoprotica

Colocar los mismos estndares de la prueba anterior en tubos por separado, como lo
indica el siguiente cuadro:

Tubo
1
2
3
4
5 (blanco)

Estandar (mL)
0.5 peptona
0.5 gelatina
0.5 albmina
0.5 tirosina
-

Agua Dest. (mL)

0.5

HNO3 (mL)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5

Las soluciones anteriores, se llevan a ebullicin por 5 minutos en bao mara

previamente preparado en estufa.
Se deja reposar y enfriar por 10 minutos y se le agregan a todos los tubos algunas gotas
de NH4OH por estratificacin para observar los cambios de color y en algunos casos la
formacin de anillo de interfase.

C) Reaccin de Biuret.
Colocar los mismos estndares de la prueba anterior en tubos por separado, como lo indica el
siguiente cuadro:

Tubo
1
2
3
4
5 (blanco)

Estandar (mL)
1 peptona
1 gelatina
1 albmina
1 tirosina
-

Agua Dest. (mL)

1

Reactivo de Biuret
1
1
1
1
1

Experimento II. Curva de calibracin y cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret.

1.-.Tomar 1 mL de cada solucin estpndar de albmina (0, 1, 2, 5 y 10 mg/mL ) y

colocarlos en tubos limpios y etiquetados (5 tubos).
2.- Tomar 1 mL de cada muestra problema y colocarlos en otros tubos.
20

3.- Agregar a cada tubo 1 mL de reactivo de Biuret.

4.- Colocar en reposo durante 15 minutos, a temperatura ambiente, esperando el
cambio de color.
5.- Medir en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 595nm, utilizando como
blanco agua destilada.
6.- Con las absorbancias medidas para cada uno de los estndares de calibracin,
realizar una curva de calibracin que ser utilizada para determinar la concentracin de las
muestras problema.

RESULTADOS:
Se reportan los resultados de las pruebas de Ninhidrina, Xantoproteica, y Biuret, como
la descripcin de los cambios de colores en las soluciones de la siguiente forma: (++) color
intenso, (+) cambio ligero, y (-) sin formacin de color. Indicar que significa el cambio de color
en cada reaccin.
Se reportara una grfica en la que se presenten las distintas concentraciones de
albmina (estndares) contra la absorbancia que presentan de modo que se obtenga una curva
de calibracin. Incluya una tabla con los valores de absorbancia de cada estndar y muestra
problema.
Utilizar esta curva para determinar las concentraciones de las soluciones problema con
su respectivo porcentaje de error:

CUESTIONARIO:
1) Describir y explicar mediante un esquema la reaccin entre el reactivo de Biuret y los
enlaces peptdicos.

2) Investigue otros dos mtodos empleados comnmente para cuantificar protenas. Diga cual
es el rango de concentraciones en el que se utilizan estos dos mtodos, as como el mtodo de
Biuret. Cul de los tres mtodos es el mas sensible?

3) Explique por qu razn en la presente prctica se utiliz una curva de calibracin de

albmina para luego cuantificar muestras problema que no contenan albmina.

21

PRCTICA # 5
ANALISIS ENZIMATICO CUALITATIVO
OBJETIVO:
Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de definir el efecto fisicoqumico que generan las
enzimas sobre diferentes sustratos. Indicando adems, las propiedades qumicas que permiten que un
enzima, catalize la modificacin de un sustrato
PREREQUISITOS:
1. Definicin de enzima, substrato, apoenzima, holoenzima, proenzima, zimgeno, coenzima,
cofactor.
2. Determine lo que significa: especifidad enzimtica y alosterismo.
3. Defina el efecto de una hidrolasa, oxidoreductasa, transferasa, liasa, ligasa e isomerasa.
INTRODUCCION:
Todos los organismos vivos pueden obtener y gastar la energa muy rpidamente, debido a la presencia
de catalizadores biolgicos llamadas enzimas. Al igual que los catalizadores inorgnicos; las enzimas
modifican la velocidad de una reaccin qumica sin afectar el equilibrio final y slo se requieren
pequeas cantidades para efectuar la transformacin de un gran nmero de molculas de sustrato. Sin
embargo, a diferencia de la mayora de los catalizadores inorgnicos las enzimas son bastante
especficas ya que catalizan un nmero comparativamente pequeo de reacciones; en algunos casos,
tan solo una reaccin , as mismo las enzimas funcionan solo bajo condiciones muy definidas de pH,
temperatura, concentracin de sustrato, coenzimas etc.
Estas condiciones se ilustran en algunos de los experimentos que se tienen determinados en este tema.
Las enzimas se designan y se clasifican de acuerdo con el tipo de reaccin que catalizan; los 6 grupos
principales de enzimas son: Oxidoreductasas, Transferasas, Hidrolasas, Liasas, Isomerasas, Ligasas o
Sintetasas.
MATERIAL:
1.- 6 tubos de ensaye
2.- 3 pipetas de 1.0 ml
3.- 2 pipetas de 5.0 ml
4.- 2 pipetas Pasteur
5.- 2 gradillas
6.- Tapones de algodon
METODOLOGIA.Experimento No. 1
EFECTO DEL CALOR SOBRE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS. "ACTIVIDAD DE LA UREASA"
Tubo
Semilla de Vegetal

1
pizca

2
pizca

3
pizca
22

Agua
0
5.0
5.0
Mezclar para tratar de homogenizar el polvo de sandia y enseguida coloque un tapn de algodn a los
tubos 1 y 2 y colquelos en bao a ebullicin durante 20 minutos. (cuidar que no se acabe el agua del
bao,)
Agua
5.0
0
Azul de Bromotimol
2 Gotas
2 Gotas
Aadir cido dbil (GOTAS) en caso de que la solucin tenga un color azul.

0
2 Gotas

Urea
5.0
5.0
5.0
Mezclar y tomar el tiempo que transcurre hasta alcanzar el vire de color amarillo a azul en cada uno de
los tubos.
Experimento No. 2
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE RENINA.
Tubo

Leche
3.0
3.0
3.0
Oxalato de Amonio
0
0.5
0.5
Solucin renina
3 Gotas
3 Gotas
3 Gotas
Mezclar e incubar a 37C durante 10 minutos y anotar los cambios observados en cada uno de los tubos.
Calentar el tubo No. 2 a ebullicin y enfriar.
Cloruro de Calcio
0
10 Gotas
Mezclar y comparar los cambios observados en los tubos No 2 y 3 con el 1.

10 Gotas

CUESTIONARIO:
1.- Deacuerdo a la clasificacin enzimtica a que clase pertenecen las enzimas utilizadas (renina y
ureasa) y porqu?
2.- Mencione 3 bacterias que contengan la enzima ureasa:
3.- Qu grupos qumicos participan en el sitio activo de las enzimas ?
4.- Las enzimas cambian la constante de equilibrio de las reacciones que catalizan ? si, no ; porqu?
5.- Porqu algunas protenas actan como catalizadores (enzimas) de reacciones con alta especificidad,
mientras que otras protenas que tambin contienen aminocidos en su estructura no lo hacen?

23

24

PRCTICA # 6
EXTRACCIN DE GLUCOGENO Y REACCIONES DE IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS
OBJETIVO.
a) Desarrollar una tcnica de extraccin de glucgeno a partir de tejido heptico de conejo o rata y
determinar la calidad del glucgeno obtenido por medio de reacciones cualitativas de
caracterizacin.
b) Conocer las tcnicas de anlisis cualitativo que permiten identificar carbohidratos y su
utilizacin como herramienta de trabajo en ciertos experimentos.
PREREQUISITOS.
1. Identificar la composicin del glucgeno y sus diferencias estructurales y funcionales con el
almidn.
2. Diferenciar los efectos sobre el metabolismo del glucgeno de las siguientes hormonas :
Insulina, Glucagn y Adrenalina
3. Identificar las caractersticas de por lo menos tres enfermedades por almacenamiento de
glucgeno.
4. Definir el trmino carbohidrato.
5. Diferenciar los tipos de carbohidratos y mencionar ejemplos.
6. Identificar las propiedades qumicas de los carbohidratos.
INTRODUCCIN.
Los carbohidratos son derivados aldehdicos o cetnicos de alcoholes superiores polivalentes ( ms de
un OH). se clasifican en base al nmero de molculas que los componen. Monosacridos (azcares
simples) no se pueden hidrolizar en molculas ms sencillas, pueden subdividirse en triosas, tetrosas,
pentosas, hexosas etc. segn el nmero de tomos de carbono que tengan. Las siguientes reaccines
permiten identificar de manera cualitativa la presencia de cierto tipo de azucares en una muestra
problema y se utilizan en la prctica tanto clnica como vegetal.
Muchas de las pruebas que se estudiarn en el laboratorio requieren tiempo para que aparezca un
precipitado o se desarrolle un color. La mayara de las reacciones son muy sensibles, por lo que el uso de
reactivos en cantidades mayores pueden conducir a interpretaciones errneas.
El glucgeno es un polisacrido ramificado constitudo de molculas de alfa d-glucosa unidas por enlaces
glucosdicos. Es el nico polisacrido que se produce y se almacena en el humano, siendo el hgado el
principal promotor de la glucognesis que es la va metablica de dicho polisacrido.
Todas las clulas del organismo son capaces de producir glucgeno y la capacidad de sntesis de cada
clula estar dada por la cantidad de enzima glucgeno sintetasa que presenta. El hepatocito, por lo
tanto, es la clula que mayor cantidad de glucgeno sintetasa presenta.
Desde el punto de vista energtico, ste polisacrido es importante ya que por ser una fuente
almacenadora de glucosa es factible que se pueda utilizar cuando el organismo as lo requiera mediante
una va de hidrlisis del glucgeno que se conoce como glucogenolisis.

25

Tanto en la glucognesis como la glucogenolisis son vas reguladas hormonal y alostricamente. La

insulina promueve la actividad de la glucognesis y en forma directa sobre la glucgeno sintetasa y la
adrenalina activa en forma indirecta a la glucogenlisis e inhibe de la misma forma a la glucogenesis esto
es , induce la formacin de AMP-Cclico para que este a su vez active a la glucogeno-fosforilasa e inhiba
a la glucgeno sintetasa.
El mecanismo de regulacin es complejo y algunas veces puede fallar a tal grado que altera el
almacenamiento de glucgeno y generar estados patolgicos llamados glucognosis, algunos de los
cuales pueden llegar a ser fatales tales como las enferedades de Von-Gierke, Andersen, de Pompe, Mc.
Ardle, Hers, etc. Estas enfermedades se caracterizan por presentarse debido a una deficiencia congnita
de algunas de las enzimas arriba mencionadas y otras relacionadas con ellas.
MATERIAL.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

6 Tubos de ensaye 15 X 150 mm

1 Mortero con pistilo
2 Pipetas de 1.0 ml.
1 Pipeta de 5.0 ml.
1 vaso de precipitados
Gradilla.
Vidrio de reloj

8. Balanza granataria
9. Probeta de 100 ml.
10.- Bao de agua a ebullicin
11 Tubos de ensaye
12.- 2 Pipetas de 1.0 ml
13.- Pipeta de 5.0 ml
14.- Gradilla

METODOLOGIA:
Extraccin de Glucgeno
1. Pesar 5g de hgado y cortarlo en trozos pequeos (utilizar el vidrio de reloj).
2. Colocar unos trozos en un mortero fro al cual se le aade TCA al 10 % en proporcin de 1.0 ml
por cada gramo de tejido y una pizca de arena lavada.
3. Centrifugar 5 min. a 2000 r.p.m.
4. Recuperar el sobrenadante en un tubo de ensaye grande y medir el volmen.
5. Aadir 2 volmenes de alcohol al 95 % por volmen de sobrenadante agitando lentamente
hasta que el glucgeno flocule.
6. Centrifugar a 2 000 r.p.m. 5 Min.
7. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 4.0 ml. de agua destilada.
8. Utilizado la suspensin de glucgeno como muestra problema, desarrolle las tcnicas de Fehling
,Lugol y Molish al mismo tiempo que los carbohidratos provedos por el profesor.

EXPERIMENTO # 1
REACCION DE FEHLING (IDENTIFICACION DE COMPUESTOS REDUCTORES )
Esta reaccin nos identifica carbohidratos con capacidad reductora, se basa en que algunos azcares en
un medio fuertemente alcalino y en presencia de oxgeno o de diversos agentes oxidantes ej. Cu, Ag dan
las reacciones de reduccin que dependen de la existencia de un grupo carbonilo libre como en la
glucosa, galactosa, fructosa, maltosa y lactosa. Si la prueba se efecta con una solucin que contenga
cloroformo como conservador, puede obtenerse un resultado positivo, sin que exista azcar, las sales de
amonio tambin interfieren en la reaccin. Si la solucin problema es cida debe neutralizarse antes de
efectuar la prueba.
26

Fundamento: si calentamos una solucin de Cu(OH)2 en un medio alcalino formamos oxido cprico
(negro) CuO y en presencia de sustancias reductoras se precipita como oxido cuproso Cu2O de color
caf rojizo pardo .
Solucion A contiene sulfato de cobre .
Solucion B contiene tartrato de sodio y potasio e Hidroxido de potasio .
METODO
MUESTRA (carbohidratos sealados y glucgeno)
1.0 ml.
SOL. DE FEHLING A
0.5 ml
SOL. DE FEHLING B
0.5 ml.
MEZCLAR Y CALENTAR A BANO DE EBULLICION 5 MIN. COLOR ROJO ES POSITIVO.
EXPERIMENTO # 2
REACCION DE MOLISH-UDRANSKY.
Esta prueba es positiva con aldehidos y algunos cidos como el frmico, oxlico, lctico, ctrico, etc. Esta
reaccin es muy sensible , dicha sensibilidad para la glucosa es de hasta 0.001% y para sacarosa de
0.0001%.
METODO
MUESTRA (carbohidratos sealados y glucgeno)
Reactivo de Molish
3 GOTAS

1.0 ml

Mezclar y aadir 0.5 ml de cido sulfrico concentrado ( resbalando por la pared del tubo ) NO
mezclar.
La aparicin en la interfase de un anillo violceo es indicativo de que la prueba result positiva.
EXPERIMENTO # 3
REACCION DE SELIWANOFF
Est reaccin permite diferenciar Aldosas de Cetosas. Anote el tiempo en el cual aparece el color en
cada uno de los tubos. Una reaccin positiva est dada por la aparicin de un color rojo. Es utilizada
para diferenciar Cetosas de Aldosas ( Reaccin de Seliwanoff )
METODO
MUESTRA (carbohidratos sealados y glucgeno)
REACTIVO DE SELIWANOFF 5.0 ml

1.0 ml

Mezclar y calentar en bao de ebullicin durante 1 minuto, anote el resultado.

Las cetosas dan un color rojo y las aldosas dan la prueba dbil y lentamente.
EXPERIMENTO # 4
REACCION DEL YODO O LUGOL
27

Esta reaccin identifica los polisacridos como Amilosa, Amilopectina, Glucogeno, Almidon formando
un complejo adsortivo entre el Iodo y las cadenas helicoidales del polisacrido (enlaces alfa 1,4
glucosdicos y enlaces alfa 1,6 glucosdicos de por lo menos 8 residuos de glucosas ) .
METODO.
MUESTRA (carbohidratos sealados y glucgeno) 1.0 ml.
LUGOL 3 GOTAS
Mezclar y si es necesario calentar 2 segundos en bao de ebullicin.
La aparicin de un color azul o violeta indica la presencia de un polisacarido.
RESULTADOS
FEHLING

LUGOL

MOLISH

MUESTRA
GLUCGENO
AGUA
CUESTIONARIO
1. Mencione las diferencias en las propiedades qumicas de los monosacridos con los aminocidos
y los lpidos.
2. Mencione 3 funciones fundamentales de los carbohidratos en la clula, ejemplificando en cada
caso.
3. Mencione 2 homopolisacaridos y 3 heteropolisacaridos y su composicin, indicando tambin los
tipos de enlaces que presentan.
4. Defina y ejemplifique con carbohidratos los siguientes conceptos: Isomera ptica, Anomerismo,
Epimerismo.
5. Explique el mecanismo de accin de los segundos mensajeros en la regulacin hormonal y
enzimtica del metabolismo del glucgeno.
6. Describa las implicaciones bioqumicas que se presentan en la enfermedad de Von Gierke
7. Describa dos eventos bajo los cuales se puede activar la va de la glucogenolisis.

28

PRCTICA # 7
CUANTIFICACION DE COLESTEROL SERICO
OBJETIVO:
Determinar la concentracin de colesterol srico y analizar las implicaciones clnicas de niveles
anormales de colesterol.
PRE-REQUISITOS.
1.
2.
3.
4.

Estructura, funcin y tipos de colesterol

Relacin metablica entre el colesterol y las lipoprotenas
Anlisis de la digestin del colesterol esterificada y no esterificado
Relacin de las Lipoprotenas plasmticas con la Aterognesis.

INTRODUCCION.
El colesterol es uno de los lpidos que se encuentran en mayor concentracin en la sangre, se puede
afirmar que la fraccin lipdica del colesterol, es la segunda en cuanto a concentracin y sta se localiza
principalmente formando parte de las lipoprotenas. Qumicamente el colesterol es un compuesto
cclico con estructura bsica de perhidrofenantreno con un total de 27 carbones, un radical OH en el
carbono 3 y un doble enlace entre los carbonos 5 y 6.
El colesterol existe en dos formas: como colesterol libre en muy pequeas cantidades y como colesterol
esterificado mediante la unin de un cido graso no saturado de cadena media al carbono 3. Este tipo
de colesterol es el ms frecuente tanto en sangre como en tejidos.
La mayor parte de colesterol que existe en el organismo es sintetizado en el hgado, sto implica que el
colesterol exgeno tenga menor importancia metablica. La sntesis de colesterol endgeno es activada
en primera instancia ante el excedente de Acetil-S-CoA que haya en el hepatocito, ya que ste funciona
como metabolito precursor y en segunda instancia ante la presencia de efectores hipercolesterolmicos
que aumentan la sntesis de colesterol o bin disminuyen el catabolismo del colesterol ya formado. El
colesterol exgeno se reduce en el intestino por medio de enzimas bacterianas para dar lugar al
colestanol y as entra a la sangre en pequeas concentraciones, otra parte del colesterol exgeno se
convierte en un producto de excresin llamado coprostano que se libera con las heces.
El colesterol endgeno con frecuencia se cataboliza en el hgado y en otros rganos. El 7dihidrocolesterol se obtiene por oxidacin del colesterol; ste compuesto predomina en la piel y en
presencia de radiacin ultravioleta se convierte en colecalciferol que es una de las formas de vitamina D.
Otros productos del catabolismo del colesterol son los cidos biliares que en general se deben a una
carboxilacin de la cadena lateral del colesterol y sta reaccin sucede en el hgado. Entre los cidos
biliares ms comunes est el cido clico, el cido desoxiclico, cido quenodesoxiclico y el cido
litoclico. Por ltimo, otros metabolitos son la progesterona y los esteroides corticales, as como
hormonas andrognicas y estrognicas.
29

METODOLOGIA
Fundamento qumico : Esta tcnica se basa en utilizar los derivados polienos del colesterol como
elementos cromforos( que dan reaccin de color). En presencia de cido sulfrico concentrado y
anhdrido actico ( reactivo de colesterol) se producen diferentes tonalidades de color verde cuya
tonalidad es proporcional a la cantidad de colesterol presente en la muestra. Los polienos son
estructuras cclicas que resultan de la oxidacin del colesterol.
La cuantificacin de HDL colesterol se determina por mtodos de precipitacin en los cuales la
formacin de complejos insolubles se debe a interacciones entre los grupos cargados negativamente de
los polianiones y los grupos positivos de las subunidades proteicas de las lipoprotenas
TECNICA: preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro.
REACTIVOS
SUERO
SOL. PATRON
AGUA
SOBRENADANTE*
REACTIVO DE
COLESTEROL

Colesterol
0.05 ml.
---2.0 ml.

HDL
---0.05 ml
2.O ml

Patron o Estandar
-0.05 ml.
--2.0 ml.

Blanco
--0.05 mL
-2.0 ml

*NOTA: Para adquirir sobrenadante: A 0.5 ml de suero, agregar 0.05 ml de Reactivo precipitante de
HDL-COLESTEROL, mezclar, reposar 5 minutos y centrifugar 5 min a 3000 rpm.
Mezclar y dejar que se lleve a cabo la reaccin durante 20 minutos a temperatura ambiente y aadir
en forma directa sobre la superficie del lquido 0.20 ml. de Acido sulfrico concentrado.
Colocar los tubos por separado inmediatamente despues de la adicin del cido sulfrico en un bao de
agua a temperatura ambiente y agitar suavemente. Se deben mantener los tubos en bao de agua
mnimo 5.0 minutos.
Leer la absorbancia del problema y el patrn ajustando a cero con el tubo blanco a una longitud de onda
de 640nm.
CALCULOS:
[Colesterol Total] = Abs. problema / Abs. del Patrn X [ conc. patrn mg/dl ]
[ HDL-COLESTEROL ] = Abs problema / abs patrn x [ conc. Patrn]

30

PRCTICA # 8
METABOLISMO ANAEROBIO: REACCIN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA
OBJETIVO:
Analizar la actividad de una enzima clave del metabolismo anaerobio y su dependencia de la presencia
de nicotinamida adenin dinucletido (NAD).
PRERREQUISITOS:
1.- Identificar las reacciones metablicas del metabolismo aerobio y anaerobio de los carbohidratos.
2.-Identificar el papel del NAD en ambas rutas.

INTRODUCCION:
La mayora de las manifestaciones metablicas de un organismo, se relacionan con cambios de energa,
la cual se obtiene por la oxidacin sistemtica de los nutrientes y esto es debido a que en los procesos
de oxidorreduccin hay transferencias de energa generadas por diferencias en el potencial
elecroqumico. Un sistema de potencial elevado, oxida al de ms bajo potencial con la consiguiente
liberacin de energa para las necesidades vitales.
En todas las reacciones de oxidorreduccin, existe transferencia de electrones. La oxidacin se define
como: la prdida de electrones por parte de un compuesto, mientras que la reduccin es la ganancia de
dichos electrones por otro compuesto. Por lo tanto, la oxidacin y la reduccin son fenmenos que se
realizan en forma simultnea.
La oxidacin biolgica implica transferencia de hidrgenos y electrones a travs de una serie de sistemas
enzimticos que actan como intermediarios, para llegar al aceptor final que es el oxgeno. El proceso
oxidativo se inicia por la oxidacin de una deshidrogenasa especfica que no reacciona directamente con
el oxgeno, sino que requiere intermediarios como el NAD, las flavoprotenas y los citocrmos.

Piruvato

Lactato

En el presente experimento, se pretende realizar un estudio cualitativo, donde se utilizar la

deshidrogenasa lctica de msculo de rata; que slo es activa en estado de anaerobiosis y requiere NAD
como intermediario para completar su actividad, la cual se manifiesta en la siguiente reaccin:
Con este experimento se pretende demostrar que: Si la LDH es una enzima que funciona normalmente,
en base a la concentracin de NAD y anerobiosis promoviendo la reduccin del piruvato en presencia de
31

NADH + H+; entonces, aumentando la concentracin de NAD+ podemos revertir la reaccin para oxidar
al lactato y generar NADH + H+ el cual reccionar con el azul de metileno y provocar su decoloracin. Si
esta premisa se cumple se habr demostrado que la concentracin de la coenzima puede regular la
direccin de la actividad de una enzima reversible.
MATERIAL :
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.

4 tubos de ensayo de 20 x 150 mm.

3 pipetas de 5.0 ml.
1 pipeta de 2.0 ml.
1 pipeta de 1.0 ml.
2 vasos de precipitado de 150 ml.
1 matraz erlenmeyer de 125 ml.
1 mortero con pistilo.
1 bao Mara ajustado a 37C.
Arena lavada. (agente triturante).
NaCl al 0.9% (solucin isotnica para suspender clulas)
KCN al 0.5% (inhibidor de las deshirogenasas mitocondriales).
Lactato de sodio al 1.0%.(substrato de la LDH).
Azul de metileno 0.002 M.(indicador redox que reacciona con NAD).
Aceite mineral. (compuesto que al sellar los tubos promueve la anaerobiosis).

METODOLOGIA :
Preparacin de la enzima LDH:
1. Colocar 5 gr de msculo de res en un mortero previamente sumergido en hielo y aadir NaCl al
0.9% (10 ml. por gramo de tejido) y agregar un poco de arena. Triturar perfectamente.
2. Dejar reposar la mezcla en el mortero por 15 minutos.
3. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos y recuperar el sobrenadante etiquetndolo como LDH.
Preparacin de la coenzima NAD:
1. Obtener otros 3 gr. de tejido muscular.
2. Cortar el msculo en fragmentos ms pequeos y ponerlo en agua a ebullicin por 5 minutos en
un matraz Erlenmeyer de 125 ml. en una proporcin de 8 ml. de agua por gramo de msculo.
3. Pasar la preparacin a un mortero con un poco de arena y triturar perfectamente.
4. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como NAD.
Preparacin de la enzima DSC a partir de msculo cardico
1. Tomar de 2 a 3 g de msculo de corazn cortarlo en fragmentos pequeos.
2. Colocar el tejido en un mortero previamente sumergido en hielo y aadir NaCl al 0.9% en
una proporcin de 10 ml. por gramo de msculo, agregar un poco de arena lavada y triturar
perfectamente.
3. Dejar reposar la mezcla en el mortero por 15 min.
4. Centrifugar el homogeneizado a 3000 rpm por 15 min. Recuperar el sobrenadante y
etiquetarlo como DSC.

Deteccin de la actividad enzimtica de LDH:

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Preparar una serie de cuatro tubos de ensayo como se indica a continuacin:

NOTA: se debe tener precaucin al utilizar el KCN ya que es altamente txico. utilice bureta.
TUBO

KCN 0.5%

1.0 ml

1.0 ml

1.0 ml

1.0 ml

Lactato de Sodio al
1.0%

1.0 ml

1.0 ml

---------

1.0 ml

Azul de metileno
0.002 M

0.3 ml

0.3 ml

0.3 ml

0.3 ml

Agua destilada

1.0 ml

----------

1.0 ml

1.0 ml

Coenzima ( NAD )

--------

1.0 ml

1.0 ml

1.0 ml

Enzima ( LDH )

1.0 ml

1.0 ml

1.0 ml

---------

Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar 1.0 ml. de aceite mineral, evitando mezclarlos.
Incubar en bao de agua a 37C los tubos MANTENIENDOLOS INMOVILES y observar los grados de
decoloracin de cada solucin. Hacer estas observaciones en intervalos de 15 minutos durante 45
minutos.

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RESULTADOS :
TUBO

15 min
30 min
45 min

DISCUSION:
1.- Relacione el efecto de cada reactivo con los resultados obtenidos.
2.- Determine si los resultados que obtiene son acordes con los esperados.
3.- Explique el fundamento qumico de la reaccin entre el azul de metileno y el NAD.
4.- Mencione los errores, si es el caso, en el planteamiento o en el manejo del experimento que
pudieran modificar los resultados.
CUESTIONARIO:
1.- Mencione las diferencias entre una enzima y un cofactor.
2.- Explique cual es el efecto del oxgeno en la actividad de las oxidasas.
3.- Mencione cinco coenzimas que acten con transferasas.
4.- Explique la relacin que existe entre algunas coenzimas y las vitaminas del complejo B.
5.- Describa la funcin del fosfato de piridoxal en la reaccin que cataliza la enzima transaminasa
glutmico oxaloactica (GOT).

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