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Informe de Tesis Final Final Final Matias
Informe de Tesis Final Final Final Matias
por
Matías SUAREZ
PAYSANDÚ,URUGUAY
INDICE
INDICE: ...........................................................................................................1
RESUMEN: .....................................................................................................3
ABSTRACT: ....................................................................................................5
1.INTRODUCCIÓN:. ..................................................................................... 11
1.2.1.Generalidades de α-amilasa.......................................................... 12
2.METODOLOGÍA APLICADA...................................................................... 14
3.MATERIALES ............................................................................................ 23
4.PROCEDIMIENTO..................................................................................... 25
5.RESULTADOS........................................................................................... 32
5.1.Estudio estadístico............................................................................... 32
6.DISCUSIÓN ............................................................................................... 44
1
7.CONCLUSIÓN ........................................................................................... 46
8.AUTOEVALUACIÓN .................................................................................. 46
9.GLOSARIO ................................................................................................ 48
10.BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................ 50
11.ANEXO ................................................................................................... 51
2
RESUMEN
3
condiciones que permiten mediante una lectura espectrofotométrica a 610
nanómetros la cuantificación de la α-amilasa, tener que inactivar la β-amilasa.
Para poder implementar este último método, se lo compara con el método de
valoración mediante un test de hipótesis, en donde se analizan los resultados
de cada muestra por los dos métodos y se concluye si existe o no existe
diferencia significativa entre ambos.
A partir de este test estadístico se puede realizar conclusiones que dan
respuesta a los objetivos planteados.
Los resultados del primer y segundo contraste aplicando el estadístico t
student, fueron los siguientes:
- t0=0,044 < t= 1,960 para el contraste de método vs método y,
- t0=0,068 < t= 2,035 para el segundo test estadístico.
Por otra parte se realizaron cálculos estadísticos, de la desviación estándar
de un conjunto de resultados del mosto EBC. Este mosto, proviene de una
malta estándar, denominada malta EBC, que presenta los valores de
referencia de cada parámetro a estudiar, los cuales pueden verse en anexo
1.
Los resultados obtenidos de este mosto mediante los dos métodos,
presentan:
Desviación estándar del método Skalar= 3,8142 y la desviación estándar del
método de valoración= 6,0483.
Estos procedimientos se llevan a cabo en el laboratorio de calidad de Ambev,
en Maltería Paysandú.
4
ABSTRACT
Beer is one of the most consumed beverages in the world, it has different
aromas and flavors that vary according to the type of beer. Its main raw
material is barley, although cereals such as wheat, corn, among others are
also used, which must have several characteristics to be used for the
production of this beverage. Currently, the consumer seeks, in its organoleptic
quality, characteristics that allow this drink to meet their expectations. To
comply with the requirements required by the customer and in turn with specific
rules of regulatory bodies, absolute control is required in the brewing process.
In order to control each of the points of the process, variables that are studied
in the laboratory are taken into account. The analysis carried out in the malting
process for beer, are very important color determination of cooking, turbidity,
viscosity, filtration time, proteins, as well as the quantification of beta glucans,
diastatic power, free amino acids and α-amylases. Within all the analyzes that
are carried out, the method of quantification of α-amylase is studied. This is an
enzyme of great importance, responsible for forming in the must of beer non-
fermentable sugars and dextrins, and to provide the final product with a denser
body, and more mouthfeel. For this reason, it is important to quantify α-
amylase, which is currently determined by an iodine titration method. To
perform this technique, a wort containing α and β amylase is used, but the
latter must be inactivated in order to perform the α-amylase determination
without any significant interference.
The Skalar method is another way of being able to determine the enzyme in
question through a segmented continuous flow equipment and it is necessary
to compare to conclude if it improves the quality of the results and therefore of
the elaborated product. In this technique, the same must is used, with the
difference that no previous process is necessary since other reagents and
conditions are used that allow the quantification of α-amylase by means of a
spectrophotometric reading at 610 nanometers, having to inactivate the β-
amylase.
5
In order to implement this last method, it is compared to the valuation method
by means of a hypothesis test, where the results of each sample are analyzed
by the two methods and it is concluded whether or not there is a significant
difference between the two.
From this statistical test, conclusions can be drawn that respond to the
objectives set.
The results of the first and second contrast using the student t statistic were
the following:
- t0 = 0.044 <t = 1.960 for the contrast of method vs method and,
- t0 = 0.068 <t = 2.035 for the second statistical test.
On the other hand, statistical calculations were made of the standard deviation
of a set of results of the EBC must. This must comes from a standard malt,
called EBC malt, which presents the reference values of each parameter to be
studied, which can be seen in appendix 1.
The results obtained from this must by the two methods, present:
Standard deviation of the Skalar method = 3.8142 and the standard deviation
of the valuation method = 6.0483.
These procedures are carried out in the quality laboratory of Ambev, in
Maltería Paysandú.
PRESENTACION DE LA EMPRESA
AmBev nació en 1999, su objetivo es impulsar el sector de bebidas con nuevos
sabores y siempre mucha calidad para su celebración.
Su filosofía es creer que, junto a la sociedad, se puede transformar el mundo
en un lugar mejor para vivir.
Sus principales productos son la producción de cerveza y malta, se encuentra
presente en 19 países, 32 cervezas y dos materias en Brasil, 30 marcas de
bebidas, 35mil colaboradores en Brasil y 100 centros de distribución directa y
6 de excelencia en Brasil.
6
Su misión es crear vínculos fuertes y duraderos con los consumidores y
clientes, brindándoles las mejores marcas, productos y servicios.
Por otra parte su visión es ser la mejor empresa de bebidas del mundo, en un
mundo mejor.
Maltería Paysandú, es una de las empresas que pertenece al grupo AmBev,
se encuentra en la ciudad de Paysandú y se dedica exclusivamente a la
producción de cebada malteada, a través del proceso de malteo.
En este organigrama se puede observar la ubicación exacta del lugar en
donde se realizan los análisis de la malta:
AmBev
(Bernardo Pinto paiva)
INDUSTRIA
(Flávio Torres)
Calidad
Gente y gestión Medio ambiente Seguridad Mantenimiento
(Belén Daneri)
Equipo Skalar
7
PROCESO PRODUCTIVO
En este proceso se realiza la germinación de cebada en condiciones
controladas de temperatura, humedad tiempo y adición de ácido giberélico.
Como consecuencia de este proceso se genera malta verde, que luego
mediante un proceso de secado es transformada en malta seca (anexo2).
Este proceso consta de tres etapas:
8
Tiene una duración de 96 horas en donde se realizan controles de proceso a
fin de monitorear el desempeño de malteo.
9
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECIFICOS
10
1.INTRODUCCIÓN
1.2.CALIDAD DE LA MALTA
Para evaluar la calidad de la malta se consideran ciertos análisis que abarcan
características subjetivas (color, olor), análisis físicos y químicos, cada uno de
estos parámetros presentan valores de referencia EBC. Para verificar que los
valores de la malta estándar se encuentren dentro de los valores establecidos
11
por la European Brewery Convention, se deben analizar las características
siguientes:
• Extracto seco
• Sacarificación
• Viscosidad
• Friabilidad
• Índice de Kolbach
• Nitrógeno amino libre (FAN)
• Betaglucanos
• Poder Diastásico
1.2.1.Generalidades de α-amilasa
Es una enzima que tiene la capacidad de dividir el almidón en sus diversos
componentes. Esta definición lleva al análisis de dos términos para
comprender con precisión qué es la amilasa: enzima y almidón.
Una enzima es una proteína que se encarga de catalizar de manera específica
las diferentes reacciones bioquímicas. En el caso de la amilasa, cataliza una
reacción de hidrólisis que, en la digestión del almidón, da lugar a azúcares
simples.
Por otra parte el almidón es un carbohidrato que se encuentra en el interior
del grano de cebada, por lo tanto cuando la enzima amilasa cataliza la
reacción de hidrolisis sobre el carbohidrato almidón, lo degrada convirtiéndolo
en azúcares fermentables y dextrinas no fermentables (dextrinización),que
luego en el proceso de elaboración de cerveza, producen la fermentación
alcohólica produciendo así el alcohol que contiene la cerveza. Estas enzimas,
obtenidas en el proceso de malteo, son denominadas enzimas α-amilasa y la
β -amilasa, las cuales trabajan de forma conjunta para degradar las cadenas
12
largas y complejas de almidón soluble. La α-amilasa rompe las moléculas de
almidón de forma aleatoria, obteniendo así moléculas más simples, para que
de esta forma la β-amilasa pueda trabajar sobre esas moléculas simplificadas.
Es importante entender que aunque las dos enzimas tienen una temperatura
óptima, las dos actúan en rangos relativamente amplios de temperatura, y
durante la mayor parte del tiempo la actividad de las enzimas se solapa. La β
amilasa tiene una temperatura óptima que se encuentra entre 60 y 65°C,
mientras que la α-amilasa tiene una temperatura óptima de 70°C, estas dos
enzimas trabajan en forma conjunta entre 63°C y 70°C. De esta forma se
puede decir que si se quiere una cerveza con menos cuerpo, más seca y
alcohólica se puede macerar en la zona baja del rango, y si se quiere una
cerveza con más cuerpo y mayor sensación en boca se debe macerar a la
temperatura óptima de la α-amilasa.
La α-amilasa y el poder diastásico son aplicaciones muy comunes usadas en
la industria maltera o una industria cervecera, y como se puede ver son
responsables de la calidad del producto terminado. Es por eso que esta
enzima, se estudia en el laboratorio mediante diferentes métodos, en donde
se determina la actividad principalmente dextrinizante. La estandarización α-
amilasa se basa en la actividad de un estándar de esta enzima disponible
comercialmente. La actividad en una solución de un peso específico de esta
enzima se mide y se expresa en una dimensión para la α -amilasa en unidades
dextrinizantes (DU). Esta unidad, está dada por la EBC en donde se puede
observar que, la concentración promedio de la enzima en la malta estándar
es de 38 DU.
2.METODOLOGIA APLICADA
Actualmente se utiliza el método de valoración con yodo para determinar la
cantidad de α-amilasa. En este momento, el método que se quiere poner a
punto es el método Skalar.
13
2.1 Método de valoración
La valoración o titulación es un método de análisis químico cuantitativo en el
laboratorio, que se utiliza para determinar la concentración desconocida de un
reactivo conocido. La concentración se expresa generalmente en unidades
de Normalidad (N), que expresa la cantidad de equivalentes gramos que
contiene 1L de su disolución.
Consiste precisamente en una valoración con yodo, en donde se analiza el
mosto que contiene las enzimas diastásicas, α y β-amilasa. Mediante un
tratamiento con acetato de calcio y un posterior baño a 70°C, la enzima
βamilasa se inactiva, permaneciendo activa la enzima α-amilasa. Una vez
que esto sucede, el mosto inactivado entra en contacto con una solución de
almidón y buffer los cuales permiten que la α-amilasa reaccione. La reacción
finaliza con el agregado de Hidróxido de sodio. Los azúcares formados por la
acción amilolítica de la enzima se estiman iodométricamente, mediante una
valoración con Tiosulfato de Sodio en medio ácido en donde se mide el exceso
de yodo. La desaparición de color (punto final) ocurre porque la solución se
encuentra en el punto de equivalencia.
El gasto de tiosulfato se anota en unidades de mililitros (mL) y se utiliza la
fórmula siguiente:
100 ∗ (𝑉𝑃𝐵 − 𝑉𝐴 ) ∗ 𝑓𝑐 ∗ 𝐹 + 6
α − 𝑎𝑚𝑖𝑙𝑎𝑠𝑎 (𝐷𝑈) =
100 − 𝑈
(Ecuación 1)
En donde:
α-amilasa: α-amilasa de malta en la muestra excenta de agua, DU.
𝑽𝑷𝑩 : volumen de solución de Tiosulfato de Sodio 0,1 N gasto prueba en blanco
𝑽𝑨 : volumen de solución de Tiosulfato de Sodio 0,1 N gasto de la muestra.
𝒇𝒄: factor de corrección de la solución de Tiosulfato 0,1 N
𝑭: Factor de equivalencia de la solución de yodo 0,1 N para maltosa en 100g
de malta (F: 34,2)
14
Como se puede observar, la concentración debe estar expresada en unidades
de dextrinización (DU).
Para poder realizar todos estos pasos, además de seguir el procedimiento del
anexo 4, se utiliza un semititulador, el cual cuenta de dos partes importantes
(anexo 5): la primera, que inyecta yodo e hidróxido de sodio en la muestra de
forma automática mediante jeringas que tienen el volumen necesario de cada
sustancia y una segunda parte que realiza la titulación con tiosulfato, adiciona
el ácido sulfúrico y además realiza una agitación constante, y que deja de
titular cuando el pH-metro identifica el punto de equivalencia el cual coincide
con el cambio de color azul a incoloro. A partir del gasto obtenido, arroja un
resultado en mL.
15
a las mediciones, por esa razón se busca dejar de utilizar el método de
valoración para la determinación de α-amilasa y utilizar este método para
dicha cuantificación.
El sistema está diseñado para funcionar con una gama de detectores
específicos que son suministrados por Skalar, como un U.V. Detector,
densímetro, viscosímetro y fluorímetro.
Cuenta con un muestreador en el que precisamente son colocadas las
muestras a analizar. Cuenta con dos agujas, una para cada línea de
muestreo, en una línea se analizan Nitrógeno Amino libre (FAN) y beta
glucano mientras que en la otra se analizarán poder diastásico y la enzima en
cuestión. Estas agujas extraen una porción de la muestra a analizar,
haciéndolas pasar por la unidad química, que es donde se encuentran los
módulos correspondientes a cada parámetro, con todos los reactivos que se
prepararon previamente. La muestra y los reactivos se unen a través de
diferentes rutas (tubos), en un mismo módulo en donde se producen
reacciones. En el caso de la α-amilasa, se trata de una reacción colorimétrica,
en donde el sustrato y el yodo forman un complejo que luego en contacto con
la muestra, cambia de color, esta variación es por la acción de las alfa
amilasas que descompone las dextrinas, midiendo la velocidad de esta
descomposición a una longitud de onda de 610nm.
El módulo de α-amilasa (anexo7), debe estar a 35°C, condición dada por un
baño a dicha temperatura, y a su vez debe contar con reactivos como Yodo,
β-limit dextrin y buffer que van a reaccionar con el mosto, el cual será el mismo
que se utiliza para determinar el poder diastásico (cuantificación de α-amilasa
y β -amilasa).
Una vez que se realiza la lectura en la longitud de onda correspondiente, los
datos se traducen a un software denominado Flow Access, que controla el
analizador por completo. Este organiza de forma ordenada, cuantas muestras
se analizarán, en que línea de muestreo se van a colocar y en qué posición,
mostrando también las lecturas en forma de picos en tiempo real y también
los resultados.
16
El reactivo que se utiliza como estándar, al igual que para el método de
valoración, es un extracto de malta, denominado malta amilasa, en el que los
niveles de α-amilasa y β-amilasa han sido estandarizados. La preparación
está diseñada para ser usada como un estándar en la determinación de la α-
amilasa y el poder diastásico usando el equipo de analizador de flujo continuo
Skalar y megazyme β-limit dextrin.
La malta amilasa es muy importante para la estandarización de la curva de
calibración, porque a partir de este estándar se realizan diluciones de
diferentes concentraciones, las cuales corresponden a los puntos de dicha
curva. Para poner en marcha el método Skalar se debe determinar la
concentración, en DU, de cada una de la diluciones de los estándares por el
método de valoración.
Es importante destacar que en este método, el resultado dado por el Skalar
es en base húmeda, debiendo convertirlo a base seca para poder comparar:
17
Figura1.Configuración de software del método Skalar
18
Antes de comenzar con el análisis de las muestras en el Skalar se realiza una
base de línea, que es la línea de referencia formada por la lectura de los
reactivos, sin la muestra, a 610nm. Esta debe ser estable y encontrarse en
los valores de absorbancia más bajos de la gráfica cuando no lee la muestra
y aumentar su valor cuando dicha muestra se inyecta en el equipo,
manifestando ese aumento de absorbancia en forma de picos como se
muestra en la figura (anexo9).
2.3.CONTRASTES DE SIGNIFICACIÓN
Al obtener los valores de las muestras de cada uno de los métodos, se realizan
dos test de hipótesis, en donde se compara la media experimental con un
valor conocido y por otra parte una comparación entre los métodos, en este
caso método de valoración con yodo vs método Skalar.
Para decidir si la diferencia entre la cantidad medida y la cantidad conocida
se debe a errores aleatorios, se aplica una prueba estadística denominada
contraste de significación.
Un contraste de significación para una media experimental vs un valor
conocido, prueba la confianza de una hipótesis denominada hipótesis nula,
H0. La hipótesis nula es aquella mediante la cual un método analítico no está
sujeto a errores sistemáticos. El término nulo se utiliza para indicar que no
hay otra diferencia entre el valor observado y el conocido que el atribuible a la
variación aleatoria. Suponiendo la hipótesis nula como verdadera, la teoría
estadística se puede emplear para calcular la probabilidad de que la diferencia
observada entre la media muestral, , y el valor verdadero, µ, se debe
solamente a errores aleatorios. Cuanto más pequeña sea la probabilidad de
que la diferencia observada ocurra por azar, menos probable será que la
hipótesis nula sea verdadera.
Utilizando un nivel de significancia de 0,05 se rechaza, en promedio, la
hipótesis nula, aunque sea verdadera, 1 de cada 20 veces. Para estar
seguros de tomar una decisión más acertada, se pueden manejar valores de
significancia más pequeños.
19
Para decidir si la diferencia entre 𝑥𝑝𝑟𝑜𝑚 , y el valor verdadero, µ, es significativa,
es decir para contrastar H0: la media de la población = µ, se calcula el
estadístico t:
Si |t| (valor calculado sin tener en cuenta el signo) es mayor a un cierto valor
crítico entonces se rechaza la hipótesis nula. El valor crítico de t para un cierto
valor de significancia se extrae de la Tabla (anexo10).
Por otra parte se utiliza un contraste para la comparación de dos medias
experimentales. Los resultados de un nuevo método analítico se pueden
contrastar mediante comparación con los obtenidos utilizando un segundo
método (de referencia), en este caso el método de referencia utilizado es el
método de valoración.
En este estudio estadístico se tienen dos medias muestrales y . Tomando
como hipótesis nula que los dos métodos proporcionen el mismo resultado,
es decir H0: , se necesita probar si ( difiere significativamente de cero. Si las
dos muestras tienen desviaciones estándar que no son significativamente
diferentes (según otro test estadístico que se verá a continuación), se puede
calcular una estimación conjunta de la desviación estándar, s, a partir de las
dos desviaciones estándar individuales y .
(Ecuación 3)
20
Donde s se calcula a partir de
𝑠1 2
𝐹= 2
𝑠2
(Ecuación 5)
Donde 1 y 2 se disponen de modo que F sea siempre ≥ 1.
El contraste supone que las poblaciones de donde se extraen las muestras
son las normales.
El valor de F para un determinado grado de libertad se extrae de la tabla del
anexo 11.
21
• Reproducibilidad: dispersión de resultados utilizando el mismo método,
aplicado a la misma muestra, en diferentes laboratorios.
• Precisión intermedia: se utiliza el mismo método, la misma muestra, en
el mismo laboratorio, pero cambian algunas condiciones (día, operario,
o equipo)
2 2
(𝑥1 − 𝑥𝑝𝑟𝑜𝑚 ) + (𝑥2 − 𝑥𝑝𝑟𝑜𝑚 ) + ⋯ + (𝑥𝑛 − 𝑥𝑝𝑟𝑜𝑚 )2
𝑠=
𝑛−1
Donde:
s: es la desviación estándar muestral
𝑥: es un valor de los resultados de cualquiera de los dos métodos
𝑥𝑝𝑟𝑜𝑚 : es la media de los resultados de cualquiera de los dos métodos
𝑛 − 1: es la cantidad de muestras analizadas menos
22
3.MATERIALES
23
Método Skalar
Materiales
Reactivos
• Agua
• Malta EBC y muestras
• β-limit dextrin
• Yodo bi-sublimado
• Ioduro de potasio
• Acetato de Sodio
• Ácido acético
• Cloruro de Sodio
24
4.PROCEDIMIENTO
4.1.ESTANDARIZACIÓN DE LA CURVA
Para llevar a cabo la puesta a punto del método Skalar, se sabe de antemano
que los valores expresados en DU a través de la Ecuación 1, provienen de un
cierto gasto de tiosulfato tanto en la muestra como en el blanco, y que a su
vez está afectado por el factor de Tiosulfato de Sodio y de humedad. Los
resultados obtenidos por dicha fórmula tienen como referencia los valores de
diferentes diluciones de un estándar de malta amilasa, concentración
conocida, que representan los diferentes puntos de una curva de calibración.
La estandarización de la curva se obtiene mediante el método actual, usado
para la cuantificación de α-amilasa, partiendo de la malta amilasa como
solución madre, los reactivos a preparar (anexo12) y tomando en cuenta 6
puntos para la curva de calibración.
La solución estándar tiene una concentración de α-amilasa: 950 U/mL y β-
amilasa: 5700 U/mL, para realizar las diluciones de α-amilasa, en la malta
amilasa se tiene en cuenta el valor de la enzima en cuestión, y no la β-amilasa
que no interfiere, por lo tanto al hacer la dilución de 2mL en 100mL de NaCl
nos queda una solución con la siguiente concentración:
𝛼 𝑎𝑚𝑖𝑙𝑎𝑠𝑎] = (950 𝑈/𝑚𝐿) ∗ 2𝑚𝐿/100𝑚𝐿 = 19 𝑈/𝑚𝐿
Las diluciones están expresadas en la siguiente tabla:
Tabla1.Diluciones realizadas para la curva de calibración
CONCENTRACIÓN (U/mL) DILUCIÓN
3,8 10mL/ 50mL de NaCl 0,5%
5,7 15mL/ 50mL de NaCl 0,5%
7,6 20mL/ 50mL de NaCl 0,5%
11,4 30mL/ 50mL de NaCl 0,5%
15,2 40mL/ 50mL de NaCl 0,5%
19,0 50 mL de Solución madre
25
A partir de estas diluciones, se aplica el método de valoración con yodo para
la obtención de la curva, en donde el valor de R2> 0,99. Los valores
experimentales para dichas diluciones fueron los siguientes:
Tabla2.Valores experimentales de los puntos de la curva de Calibración
Estándar Gasto Blanco α-amilasa
3,8 21,653 22,1 20,3
5,7 21,231 22,1 38,3
7,6 21 22,1 45,4
11,4 20,123 22,1 77,7
15,2 19,409 22,1 102,8
19 18,455 22,1 135,1
Curva de Calibración
160
100
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7
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4.2.PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Molienda
La molienda es el primer paso, donde las muestras de malta se reducen en
partículas muy pequeñas. El tipo de molienda utilizado se denomina molido
fino, en donde se coloca aproximadamente 20g de cebada malteada.
Figura3.Molienda fina
27
Baño de maceración
Luego de colocado el volumen correspondiente, se pone en un baño a 40°C
con agitación durante 1 hora para la activación de enzimas.
Figura5. Baño de maceración de 12 vasos
Filtración
El próximo paso es filtrar el mosto a través de un filtro, en donde los primeros
200mL se descartan y se usan los siguientes 50mL obtenidos en la probeta.
Figura6.Filtración del mosto
Por último se obtiene el mosto de trabajo, el cual se utiliza tanto para el método
de valoración con yodo como para el método Skalar.
28
Figura7.Mosto de malta utilizado para análisis
29
Previamente se debe tener los reactivos necesarios, aplicando los
procedimientos que se encuentran en el Anexo15.
Se colocan cada una de las mangas con sus reactivos correspondientes,
como muestra la figura:
30
Figura10.Valor en base húmeda del mosto EBC
31
5.RESULTADOS
32
32 46 46,20 50 90 77,33
51 60 50,52
33 38 33,21 52 68 57,56
34 24 28,82 53 105 93,21
35 35 34,09 54 118 90,57
36 82 74,27 55 61 83,21
37 64 56,75 56 39 32,32
38 61 55,77 57 39 39,75
39 71 57,45 58 39 34,80
40 71 55,64 59 42 35,74
41 38 32,97 60 46 41,75
42 56 62,32 61 42 36,73
43 38 40,98 62 38 37,81
44 35 38,24 63 39 36,03
45 56 69,05 64 68 70,98
46 49 48,72 65 57 65,64
47 49 61,71 66 53 55,08
48 49 82,76 67 57 57,84
49 89 60,61 68 71 79,23
69 39 29,47 80 42 31,86
70 39 32,92 81 53 80,19
71 39 46,67 82 57 50,99
72 31 40,32 83 39 35,25
73 32 30,06 84 39 36,94
74 38 36,05 85 61 43,60
75 38 36,93 86 39 50,28
76 38 38,21 87 42 35,63
77 38 35,66 88 42 38,69
78 38 36,81 89 42 33,38
79 38 35,70 90 42 38,50
33
91 42 33,83 122 61 47,42
92 38 32,25 123 53 58,01
93 61 68,53 124 50 77,61
94 57 78,54 125 53 48,05
95 50 62,01 126 53 56,54
96 82 74,67 127 42 58,67
97 68 74,05 128 42 32,57
98 42 55,64 129 38 34,98
99 42 62,10 130 38 36,58
100 39 70,19 131 42 37,17
101 38 41,81 132 42 34,57
102 38 36,60 133 38 33,38
103 38 37,77 134 39 27,29
104 38 35,86 135 49 87,57
105 46 50,56 136 35 56,78
106 57 50,03 137 72 20,58
107 35 50,39 138 79 56,90
108 57 33,80 139 71 97,71
109 67 39,42 140 56 44,09
110 46 31,53 141 46 26,84
111 57 47,32 142 49 34,38
112 35 51,95 143 56 57,17
113 57 44,55 144 39 53,84
114 67 32,04 145 50 60,63
115 46 47,28 146 39 73,57
116 42 28,72 147 64 72,09
117 50 90,86 148 42 35,10
118 42 49,83 149 38 38,82
119 50 50,50 150 56 34,63
120 49 33,67 151 60 37,73
121 68 41,29 152 82 37,67
34
153 67 31,70 166 42 72,76
154 35 28,30 167 39 71,84
155 39 49,66 168 49 36,83
156 42 34,82 169 53 60,51
157 54 53,67 170 64 50,47
158 50 64,46 171 68 67,65
159 53 57,45 172 61 63,77
160 46 55,85 173 61 65,24
161 43 24,57 174 42 45,73
162 53 94,26 175 53 50,68
163 35 34,32 176 46 64,20
164 35 37,58 177 64 40,48
165 67 42,30 178 49 91,95
Ho u1 = u2
H1 u1 no es = u2
Sp 258,403
To 0,044 No puedo rechazar
Ho
t(0,025;161) 1,960
35
Test de hipótesis para desviaciones estándar iguales
Ho s1 = s2
H1 s1 no es = s2
36
30 60,17 52,99 46 33,37 43,78
47 32,85 39,82
31 72,88 66,66 48 31,95 40,83
32 71,73 76,80 49 36,36 40,83
33 35,17 30,44 50 33,03 34,97
34 38,90 34,98 51 33,37 43,50
35 34,70 35,97 52 32,85 36,01
36 37,81 38,89 53 31,95 36,89
37 37,75 34,42 54 36,36 35,97
38 31,77 33,83 55 34,20 38,05
39 37,66 39,06 56 29,60 33,13
40 32,18 48,08 57 28,19 41,46
41 37,75 43,92 58 34,00 35,42
42 36,38 39,95 59 35,70 37,30
43 37,34 43,25 60 35,93 39,55
44 32,06 41,19 61 40,10 37,24
45 33,03 38,38 62 34,94 38,31
A partir de los valores anteriores se hace otro test de hipótesis para contrastar
las lecturas con wash de por medio y sin wash:
Tabla6. Resultado del test de hipótesis método Skalar con wash vs sin wash
Descripción Media Desvío Grados de
Estándar(s) libertad
u1 α-amilasa DU 43 14,147 61
(SKALAR)C/WT
u2 α-amilasa DU 14,717 61
(SKALAR)S/WT 48
Ho u1 = u2
37
H1 u1 no es = u2
Sp 208,369
To 0,129 No puedo
rechazar Ho
t(0,025;54) 2,011
Ho s1 = s2
H1 s1 no es = s2
Test de hipótesis para desviaciones estándar iguales
F(0,025;54) No puedo
1,082 rechazar Ho
Fo 1,752
38
Los resultados que se obtienen en la tabla anterior, permiten realizar el test
de hipótesis mediante cálculos (anexo18):
Ho u = uo
H1 u no es = uo
39
Tabla10. Resultados del mosto EBC mediante los dos métodos
9 34,98 38 28 36,89 42
10 35,97 42 29 35,97 42
11 38,89 38 30 38,05 38
12 34,42 42 31 33,13 35
13 33,83 49 32 41,46 28
14 39,06 35 33 35,42 32
15 48,08 35 34 37,30 44
16 43,92 39 35 39,55 46
17 39,95 49 36 37,24 46
18 43,25 46 37 38,31 30
40
Figura11.Gráfico de dispersión de los métodos
60,00
Concentración de α- amilasa (DU)
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Cantidad de muestras
SKALAR VALORACIÓN
41
Tabla11. Gastos diarios de los reactivos del método Valoración
Gasto por
Reactivos Precio($) Duración(Días)
día($)
Acetato de Sodio 1530 1235 1,239
Ácido acético 1050 3750 0,280
Yodo bi-sublimado 3270 28 118,654
Ioduro de potasio 7800 37 212,829
Hidróxido de Sodio 630 525 1,200
Ácido Sulfúrico 900 3083 0,292
Tiosulfato de Sodio 900 160 5,625
Carbonato de Sodio 930 4000 0,233
Almidón 8400 33 252,000
Acetato de Calcio 3270 3787,9 0,863
TOTAL ($) 593
42
6.DISCUSIÓN
43
baño o bien la temperatura a la que se somete dicha muestra. También
puede deberse a una incorrecta preparación de los reactivos o por
realizar la lectura en condiciones que no son óptimas, por ejemplo: el
baño a 35°C no se encuentra a dicha temperatura, las mangas
correspondientes al módulo de α-amilasa no funcionan de forma
correcta ya sea por alguna entrada de aire, desconexión de esta en
algún punto de lectura o la manga utilizada ya tiene demasiado uso.
• Se determina mediante un balance de costos, que el método Skalar es
más económico que el método de valoración con yodo.
Como se observa en la Tabla11, el método Skalar es más caro en
cuanto a el costo de reactivos, pero el método de valoración es mucho
más caro por el tiempo que se le debe pagar al operario para el análisis
de la α-amilasa. Por este motivo resulta más barato el método Skalar.
Se puede tener en cuenta también el costo anual de mantenimiento de
cada uno, en donde se puede observar que el método nuevo es más
caro que el método que se utiliza actualmente, pero aun así, el dinero
que se ahorra utilizando el método Skalar supera los gastos obtenidos
por dicho mantenimiento.
• Los valores de α-amilasa obtenidos en el Skalar que se midieron con
wash (WT) de por medio, permiten una lectura con la línea de base
uniforme. Si no se le coloca un wash por cada muestra, la línea de
base comienza en ascenso lo cual puede afectar a la medida de esta
enzima.
• Las lecturas en el equipo Skalar, reducen el tiempo sin cambiar
significativamente los resultados. De esta forma el método mas
conveniente en este equipo es realizar las lecturas sin wash de por
medio.
44
7.CONCLUSIÓN
8.AUTOEVALUACIÓN
En el desempeño de las actividades del laboratorio traté de dar al máximo los
conocimientos adquiridos en la carrera, así como también aprender sobre
temas que no tenía muy claro o que no conocía. Se presentaron varias
situaciones que podría haber resuelto con facilidad, pero la inexperiencia y
otros factores relacionados con la toma de decisiones fueron causantes de
errores. Otro factor importante que me afectó negativamente fue la falta de
organización u orden de las ideas, recolección de datos y planificación de
actividades. Destaco mi disponibilidad de querer aprender de todos los
integrantes del laboratorio y las ganas de sacar este proyecto adelante.
En cuanto a la capacidad de integración con el grupo humano creo que fue
muy buena por la muy buena relación con los compañeros de laboratorio,
siempre demostrando respeto, empatía y simpatía.
La capacidad de integración al ámbito laboral, fue buena porque sabía de
antemano la clase de empresa que es Ambev, también porque es un área en
la que me gusta desempeñarme y además sabía que era una linda
oportunidad de demostrar lo aprendido y de aprender.
45
La vinculación con contenidos y aprendizajes incorporados fue muy alta,
hubieron cosas nuevas pero también se pudieron aplicar conocimientos que
sumaron mucho a este proyecto.
46
9.GLOSARIO
47
Desv.estándar: es un promedio de las desviaciones individuales de cada
observación con respecto a la media de una distribución.
Punto final: Es el momento de una valoración en que la solución que se está
titulando realiza un cambio de color.
Punto de equivalencia: Este es el punto que coincide justamente con el
punto final.
Wash: es un líquido de enjuague (agua), que actúa como un factor de
corrección llevando el punto más bajo de los picos hacia la altura de la base
de línea.
48
10.BIBLIOGRAFÍA
49
11.ANEXO
Anexo1. Tabla de referencia EBC
Anexo2.Proceso de malteo
50
Anexo3. Partes del grano de cebada
1-Plúmula
2-Acróspira primaria
3-Plúmula
4-Escútelo
5-Capa epitelial
6-Endospérma
7-Células vacías
8-Capa de aleurona
9-Testa
10-Pericarpio
11-Cáscaras
51
7. Eliminar restos de molienda en las paredes y mantener en el baño con
agitación durante 60 ± 3 minutos. Enfriar durante 15 minutos.
8. Quitar del baño, y enjuagar las astas de agitación con agua destilada;
9. Secar el exterior del vaso de maceración, colocar en balanza y llevar a
520g con agua destilada;
10. Homogeneizar la suspensión con una varilla de vidrio y filtrar
11. Descartar los primeros 200mL del filtrado;
Recoger los próximos 50mL en una probeta de 100mL
52
Anexo7.Módulo de α-amilasa
53
Anexo9.Linea de base y lectura de estándares
Tracer Drift
Estándares
Wash
54
Anexo11.Tabla de distribución F para contraste de desviaciones estándar
55
Anexo12.Preparación de reactivos para α-amilasa utilizando método de
Valoración
1- Tiosulfato de Sodio 0,1 N
• Disolver en un litro de agua destilada 25g de Tiosulfato de Sodio y 0,1g
de Carbonato de Sodio.
• Homogeneizar
2- Yodo 0,1 N
• Disolver en 800mL de agua destilada 12,7g de yodo y 19,1g de Yoduro
de potasio.
• Agitar hasta disolver
• Enrasar en matraz aforado de 1L.
• Homogeneizar
4- Ácido Sulfúrico
• Medir en la balanza 50,5g de ácido sulfúrico ppa.
• Agregar 800mL de agua destilada
• Enrasar a 1L y homogeneizar
5- Timolftaleína
• Disolver 0,1g de Timolftaleína en 80mL de alcohol al 50%
• Completar 100mL y homogeneizar
56
Anexo13.Procedimiento del método de valoración con yodo
1. Separar tubos de ensayos suficientes para la cantidad de muestras,
más otro tubo para la prueba en blanco.
2. Adicionar 0,022g de acetato de calcio en cada tubo de ensayo
3. Adicionar 10 mL del mosto preparado en anexo2;
4. Agitar vigorosamente los tubos y dejar reposar por 30 minutos a
temperatura ambiente;
5. Colocar los tubos en baño a 70°C por 15 minutos y luego enfriar a
temperatura ambiente;
6. Utilizar matraces de 200mL e identificar un balón volumétrico como
prueba en blanco y los demás enumerarlos según la cantidad de
muestras;
7. Colocar 100mL de la solución de almidón 2% en cada tubo;
8. Adicionar 5mL de buffer pH:4,3 en los balones identificados como
muestras
9. Adicionar 2,4 mL de la solución Hidróxido de Sodio 1N a balón
identificado como blanco;
10. Acondicionar los balones durante 20 minutos, y adicionar 5mL de
muestra a los balones identificados como muestra;
11. Agitar vigorosamente y retornar los balones al baño;
12. Después de 30 minutos, adicionar 5mL del mosto al blanco y agitar,
colocarlo nuevamente en el baño;
13. Aguardar 30 minutos ± 10 segundos, para cada balón. El tiempo de
reacción comienza cuando se agrega el extracto de malta inactivado;
14. Adicionar 4mL de Soda a los balones identificados como muestra y
homogeneizar.
15. Agregar a todos los balones indicador Timolftaleína 0,1%, adicionar
unas gotas de alcohol si es necesario para quitar espuma y enrasar con
agua destilada.
16. Pipetear 50mL de la solución del balón y llevarlo a un matraz
Erlenmeyer de 250mL;
57
17. Adicionar 3,0 ± 0,5mL de hidróxido de sodio 1N y homogeneizar;
18. Adicionar 25mL de la solución de yodo 0,1N y homogeneizar;
19. Aguardar no menos de 15 minutos para la reacción;
20. Adicionar 4,5 ± 0,5 mL de ácido sulfúrico y homogeneizar;
21. Titular el yodo restante con Tiosulfato de Sodio 0,1N hasta
desaparición de color azul.
22. Anotar gasto de titulación de la muestra y el blanco.
58
Anexo15.Preparación de reactivos para α-amilasa utilizando método
Solución de cloruro de Sodio 0.5%
1- Pesar 5g de cloruro de sodio (NaCl) en vaso de precipitados
2- Transferir el cloruro de sodio a un recipiente de 1 litro
3- Agregar agua destilada y disolver, completar hasta 1 litro y mezclar
59
D. Solución sustrato β- Limit dextrin Preparación: Disolver β- Limit
Sustancias requeridas: dextrin en 500 mL de la solución
• β- Limit dextrin ……………………..2,00 g buffer diluida y mezclar.
• Solución A (Solución buffer)….500 mL Nota: Solución estable por 1 día.
∑ 𝑥𝑛
𝑥𝑝𝑟𝑜𝑚 =
𝑛
Donde:
• 𝑥𝑝𝑟𝑜𝑚 : es la media muestral
• ∑ 𝑥𝑛 : es la sumatoria de los resultados obtenidos mediante el método
Skalar o método de valoración
• 𝑛: es el numero de muestras analizadas mediante el método Skalar o
método de valoración.
60
Por otra parte la desviación estándar se calcula utilizando la Ecuación 6,
dando estos resultados:
61
Anexo18.Cálculos para test de hipótesis del valor medio teórico de EBC vs
valor experimental medio de EBC
Para realizar estos cálculos se utilizó la misma fórmula para hallar la media y
desviación estándar muestral que en el anexo16, dando lo siguiente:
𝑥𝑝𝑟𝑜𝑚 = 38,043
𝑠 = 3,8142
Una vez que se hallaron estos valores, sabiendo que la media teórica µ=38 y
que los grados de libertad=36, se obtuvo mediante la ecuación 2 un valor de
𝑡0 =0,068, mientras que a través de la tabla del anexo para 36 grados de
libertad y una significancia de 0,025 𝑡 = 2,028.
Por lo tanto no existe diferencia significativa que indique que el valor medio
teórico de la EBC difiera significativamente de el valor medio experimental de
la EBC.
Anexo19.Cálculos de precisión
𝑠𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =6,0483
62
Anexo20.Cálculos de costos
Los precios de cada uno de los reactivos fueron extraídos de y la duración se
calculó de la siguiente forma:
Para saber el gasto en pesos uruguayos de cada reactivo por día se usa esta
fórmula:
𝑃𝑟𝑒𝑐𝑖𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜
𝐺𝑎𝑠𝑡𝑜 ($) =
𝐷𝑢𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛
Para determinar el gasto total de reactivos por día se realizó la sumatoria
de gastos individuales de reactivos, dando lo siguiente:
• Método Skalar
𝐺𝑎𝑠𝑡𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑑í𝑎($) = 623
• Método de valoración
𝐺𝑎𝑠𝑡𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑑í𝑎($) = 593
63
𝐺𝑎𝑠𝑡𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑝𝑜𝑟 𝑑í𝑎($) = 𝐺𝑎𝑠𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑑í𝑎 + 𝐶𝑜𝑠𝑡𝑜 𝑀𝑂 ($)
Para Skalar el gasto total por día es:
𝐺𝑎𝑠𝑡𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑝𝑜𝑟 𝑑í𝑎($) = 927
Para el método de valoración:
𝐺𝑎𝑠𝑡𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑝𝑜𝑟 𝑑í𝑎($) = 1809
Por la siguiente formula se puede calcular el ahorro por día:
𝐴ℎ𝑜𝑟𝑟𝑜($) = 𝐺𝑎𝑠𝑡𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑝𝑜𝑟 𝑑í𝑎𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 + 𝐺𝑎𝑠𝑡𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑝𝑜𝑟 𝑑í𝑎𝑆𝑘𝑎𝑙𝑎𝑟
𝐴ℎ𝑜𝑟𝑟𝑜($) = 882
64