PRÁCTICA DE LABORATORIO 7:

INMUNODOTING

INTRODUCCIÓN

Los ensayos inmunoenzimáticos son habituales en los laboratorios por su

especificidad, sensibilidad y sencillez de manipulación. En estos ensayos podemos
visualizar la formación de los inmunocomplejos gracias al marcaje del Ag o el Ac con
una enzima.

Se denomina “inmunodot” a aquella técnica inmunoenzimática que se realiza sobre

una membrana (fase sólida) y está englobada dentro de las técnicas ELISA (Enzyme-
Linked InmunoSorbent Assay).

OBJETIVO

A través de esta práctica detectaréis la presencia o ausencia de IgGs bovinas en

varias muestras de ensayo mediante un ensayo de inmunodot.

PROTOCOLO DE TRABAJO (grupos de 5)

1. Preparación de la placa de análisis de nitrocelulosa:

a. Colocar la placa de análisis sobre una superficie no absorbente con
los pocillos hacia arriba.
b. Aplicar en el centro de cada pocillo 5 µL de las muestras y controles
(rotular bajo el pocillo lo que se ha añadido a cada uno). Dejar que se
seque al aire hasta que desaparezca la mancha.

|1
 c. Prepara la solución de bloqueo: Verter el
contenido de la bolsa de ovoalbúmina en 50 mL de tampón fosfato
salino. Agitar la mezcla hasta conseguir una disolución homogénea.
d. Introducir la placa de nitrocelulosa en la cubeta y cubrirla con la
disolución de bloqueo. Dejar incubando durante media hora como
mínimo.
e. Retirar la disolución y lavar con agua destilada. La placa ya está lista
para usarse. Una vez fijadas las muestras y controles, se debe
conservar en agua destilada o tampón fosfato.
2. Desarrollo de la prueba:
a. Lavar la placa y sacudirla. Secar el borde de plástico alrededor de cada
ventana con un poco de papel.
b. Añadir 20 µL del Ac conjugado con peroxidasa en cada pocillo. Incubar
10 minutos a temperatura ambiente.
c. Lavar cada pocillo con abundante agua destilada. Sacudir la placa e
introducirla en la cubeta de coloración.
d. Añadir a cada pocillo 50 µL de sustrato cromógeno. Mover la solución
durante unos minutos. Detener la reacción cuando las señales de los
controles positivos sean claras. Lavar con abundante agua y esperar
que la membrana se seque para ver mejor el contraste de las señales
positivas.

ACTIVIDADES

1. DURANTE LA PRÁCTICA
a. Elabora un esquema en que se represente el tipo de
inmunocomplejos que se forman.

|2
2. AL FINALIZAR LA PRÁCTICA
a. Haz una foto de los resultados e interprétalos.

|3