Estado Estacionario

Cinética enzimática avanzada Sem.
2014-2 Estado preestacionario
Material de apoyo para el módulo de CINÉTICA RÁPIDA.

Curso: Cinética Enzimática Avanzada
Modalidad: Intensiva
Coordinador: Dr. Ismaél Bustos Jaimes
Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
Profesor del módulo: Rogelio Rodríguez Sotres

Semestre: 2014-1 (Enero-mayo, 2014).
Abreviaturas
SS, Estado estacionario. ode, ecuación diferencia ordinaria. v0, rapidez inicial.
v, rapidez de reacción. vi, rapidez instantánea. t½, vida media.
1 Diferencias conceptuales entre las condiciones de estado

estacionario y las condiciones de estado pre-estacionario.
Los procesos biológicos ocurren a diferentes escalas de tiempo. Comúnmente consideramos que
numerosas reacciones químicas ocurren exclusivamente en los seres vivos, porque, en ausencia de
catalizadores, su ocurrencia es muy lenta, a veces casi impreceptible.
Por el contrario, in vivo, la ocurrencia de mucha reacciones enzimática es demasiado rápida, por lo que,
con el propósito de estudiarlas y conocer el efecto de diversas condiciones sobre la rapidez de la
reacción (reactantes, productos, cofactores, catalizador, pH, temperatura, etc.), se manipulan las
condiciones para que la reacción de interés pueda seguirse con instrumentos convencionales, tales
como un cronómetro (de fracciones de minuto a horas,) y un colorímetro. Además, para que la
medición sea posible, el régimen de flujo de la reacción catalizada se limita al rango en que la cantidad
del reactante consumido o producto acumulado cae dentro del rango de sensibilidad del método de
medición. El régimen de flujo más comúnmente empleado y que cumple con estas condiciones se
denomina estado estacionario (SS).
Sin embargo, muchos eventos que ocurren en fracciones de segundo y antes de que se establezca el
estado estacionario, pueden brindar información muy valiosa acerca de la enzima y la catálisis, si bien,
para detectarlos se requieren instrumentos especializados.
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Rogelio Rodríguez Sotres Ciencias Bioquímicas UNAM
Ejemplo 1.
Para ejemplificar lo anterior, consideremos un caso simple:
Suponga que tiene un material radiactivo cuya emisión se puede detectar con un contador Geiger. Si
todo lo que desea saber es la cantidad de radiactividad emitida usted registra las desintegraciones por
minuto (dpm, aunque la práctica, algunas no las detectamos y lo que tenemos son más bien cuentas por
minuto o CPM).
Lo anterior nos dice si el material es muy peligroso o no, porque mide la dosis de radiación que
recibiría un sujeto expuesto al material, pero no nos dice mucho acerca de la naturaleza de dicho
material.
Si ahora mido las variaciones en la radiactividad con el tiempo, es decir, hago esa misma determinación
hoy, mañana, la semana entrante, dentro de un mes y dentro de 150 días, tengo el resultado que se
ilustra en la figura 1.
La teoría de la desintegración radiactiva nos dice que los átomos radiactivos son inestables, pero se
descomponen de maneara aleatoria. En un número muy grande de átomos radiactivos la probabilidad
de observar una desintegración es proporcional a la cantidad de material radiactivo. es decir:
dpm=k C (Ecn. 1)
En donde C es la cantidad de átomos radiactivos y k una constante de proporcionalidad. Cada
desintegración significa que perdimos un átomo radiactivo, es decir, en un intervalo de tiempo
suficientemente pequeño (dt) el material radiactivo perdido (-dC) se reduce de manera proporcional a
su concentración:
dC
− =kC (Ecn. 2)
dt
La ecuación 2 es lo que se conoce como una ecuación diferencial ordinaria (ode), porque contiene la
variables y sus diferenciales. Resolver una ecuación diferencial requiere expresar la variable
dependiente (C) como una función de la variable independiente (t) que cumpla con lo que expresa la
ecuación. En este ejemplo, la variable t, sólo aparece como diferencial y se puede separar de la Variable
C que aparece en ambas formas. Entonces las diferenciales se pueden eliminar mediante la operación
inversa, es decir la integración.
C t
dC
−∫ =k ∫ dt
C0
C t =0
que da
lnC=C 0−k t (Ecn. 3)
podemos ajustar la curva de la figura 1 a la ecuación 3 y deducir que la vida media del material
ln2
(t 1/ 2= =17.17±0.23días) . Las vidas medias son invariantes características de cada material. De
k
aquí, podemos deducir de qué en este ejemplo el radionúclido era 32P y, también podemos estimar la
cantidad de átomos de 32P presentes al día cero (quizá antes de haber tenido acceso al material).
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Cinética enzimática avanzada Sem. 2014-2 Estado preestacionario
Figura 1. Cuentas radiactivas por minuto emitidas por un material en función del tiempo
transcurrido (días). La línea muestra el ajuste a una curva de decaimiento exponencial con
un valor inicial de 25017±53 y una constante de decaimiento 0.0403481±0.0003735 días-1.
Recapitulemos:
1. La medición de la cantidad de radiactividad es una medida de rapidez instantánea (vi) de
descomposición, ya que los segundos que toma hacer la medida son un instante, si se comparan
con la vida media del material que son días.
2. La vi sólo depende del isótopo que se tiene y de la cantidad del mismo presente en la muestra.
3. La vi a lo largo del tiempo sigue un comportamiento definido, determinado por una ecuación
diferencial, con la que puede determinar la vida media, que es una firma del material radiactivo.
4. Entre más corta la vida media, menos estable es el isótopo, lo que también se relaciona con la
cantidad de energía que se libera cuando se descompone en átomos más estables.
De modo análogo, si estudiamos la rapidez de una reacción química en SS, la concentración de los
diversos intermediarios de la enzima ya es constante. Podemos saber quizá que intermediario es al más
abundante y como esta situación varia con cambios en la temperatura, concentración de reactante, etc.
Pero las vidas medias de los intermediarios serán desconocidas y no sabremos nada de su estabilidad
relativa.
Por el contrario, si podemos saber la vida media de un intermediario, podremos inferir sobre su
estabilidad, su energía y podemos hacer propuestas acerca de su naturaleza.
La descomposición radiactiva es un mismo fenómeno si la medimos una vez o si la seguimos en el

tiempo. Del mismo modo, los principios que gobiernan el comportamiento de los sistemas en esta
condición no son distintos de los que gobiernan las situaciones en equilibrio, en estado estacionario o
en estado preestacionario, pero la complejidad del análisis aumenta en ese orden.
Así, lo que hace la diferencia entre estudiar un sistema en estado estacionario y estudiarlo en otros
regímenes de flujo es únicamente la manera en la que realizamos las medidas y la elección de las
condiciones experimentales. Por supuesto, tal elección determina también los instrumentos a usar y la
manera en que analizaremos nuestros datos.
2 Conceptos básicos: Equilibrio, estado estacionario, ciclos

límite y estados transitorios.
Fundamentalmente, los procesos químicos, al igual que los demás procesos naturales obedecen a las
leyes de la termodinámica. Al aplicarlas al caso especial de las transformaciones químicas se pueden
derivar ciertos principios básicos.
1. La energía se conserva. Por lo tanto, los valores de energía de las partes, mídanse como se
midan, suman siempre la energía del todo. Multiplicar energías equivaldría a crear energía y
dividir dos energías equivale a desaparecer energía.
2. En las transformaciones químicas, la masa también se conserva. Lo que quiere decir que la
suma de la masa de todas las especies presentes en el sistema no cambia con el tiempo.
3. Una consecuencia de la segunda ley de la termodinámica es que todos los sistemas tienden al
equilibrio. Tal tendencia, sin embargo, no nos dice cual es el camino que los sistemas siguen
para llegar a dicho equilibrio. En la mayoría de las transformaciones químicas, el proceso de
aproximación al equilibrio ocurre transitando por la formación de un cierto número de
intermediarios relativamente bien definidos. Cada intermediario que aparece en el sistema es
resultado de una transformación de un intermediario anterior y, por ende, el sistema sigue una
trayectoria secuencial y definida, aunque puede estar ramificada.
4. En el equilibrio, los sistemas obedecen a un principio termodinámico postulado por Le
Chatelier, (Henri-Louis Le Chatelier; 1850 - 1936) que al ser aplicado a sistemas químicos da
lugar a la llamada ley de acción de masas y se resume así:
“un proceso químico ocurre con un rapidez proporcional a la concentración
de las especies que participan en dicha transformación".
5. Sin embargo, este principio se aplica a un sistema en equilibrio y sólo puede aplicarse a las
transformaciones en su trayectoria hacia el equilibrio, conocemos cuales son las especies
individuales que participan en cada transformación parcial y el orden en que aparecen. A esta
secuencia se le conoce como el mecanismo cinético de la reacción.
Lo anterior significa que las trayectorias se pueden modelar si plantemos una propuesta de mecanismo
cinético, si además se mide la aparición y/o desaparición de uno o más intermediarios, entonces es
posible comparar los datos experimentales con el modelo propuesto. Al igual que en ejemplo de la
radiactividad, la coincidencia entre los datos experimentales y el modelo es evidencia indicativa de que
el mecanismo propuesto es correcto.
En un modelo de este tipo, la concentración de cada intermediario se representa como una función del
tiempo. En dicha función se incluye el que la aparición de un intermediario depende de la
concentración de los intermediarios inmediatos anteriores y posteriores.

Para un sistema genérico: R → n1 I 1 → n 2 I 2 ... → m P
La concentración de las diferentes especies podrá describirse como una función del tiempo:
C R = f 0 (t); C I i= f i (t)... ;C P = f p (t )
Es decir, para un sistema con 5 intermediarios habrá 5 funciones del tiempo, aunque sólo cuatro serán
independientes, ya que la concentración de cualquiera especie puede deducirse conociendo la
concentración de las 4 restantes y la estequiometría de la reacción, es decir:
1 1 1
M TOTAL=C R + C I + C I ...+ C P
n1 1
n2 m
2
Las trayectorias de un sistema que transita hacia el equilibrio pueden pasar por varios regímenes de
flujo con características que facilitan o dificultan su modelado. A saber:
a) Regímenes caóticos: Son aquellos en que la función que describe la concentración presenta
cambios que no siguen ningún patrón regular apreciable. Usualmente los sistemas químicos
bajo condiciones controladas no siguen este tipo de regímenes, pero los sistemas complejos de
múltiples reacciones pueden mostrar comportamientos que son cuasicaóticos.
b) Regímenes de ciclo límite o cuasiperiódicos: Son aquellos en que el sistema presenta
oscilaciones regulares y los intermediarios aumentan y disminuyen su concentración entre
valores definidos, con intervalos de tiempo (periodos) definidos. Generalmente, tardan
fracciones de segundo en establecerse y se agotan después de un tiempo. Mientras duran, es
posible observar que la aparición de las especies finales (productos) ocurre con una rapidez
constante (véase figura 2).
c) Regímenes de decaimiento o crecimiento exponencial, o cuasiexponencial: Ocurren cuando
el aumento o la disminución en la concentración de una especie es proporcional a la
concentración de dicha especie, o de alguna otra especie relacionada.
b) Regímenes de estado estacionario: Son aquellos en los que las especies intermediarias se
mantienen casi constantes en función del tiempo. Su duración es corta, ya que persisten
mientras la concentración de las especies iniciales no cambia de manera importante y los flujos
se mantienen razonablemente constantes (ver figuras 3 y 4).
Figura 2. Un ejemplo de un ciclo límite es el flujo glucolítico en la levadura S. cereviciae incubada con
concentraciones muy elevadas de glucosa y en presencia de cianuro, mismo que puede monitorearse
mediante la absorbencia de NADH en las células completas (Danø et al., 1999).

A) Equilibrio Nivel de agua

Ejemplo físico: Dos tanques conectados por un tubo constante
Energía
Liberación de P=0
potencial Situación de
energía
P
acumulada equilibrio
El volumen de agua es diferente,

pero las presiones son iguales.
Ejemplo químico: Unión del oxígeno a la Mioglobina.
En el equilibrio el potencial químico se
iguala (es decir G=0).
Mb + O2 MbO2
[ MbO 2 ]eq
EL equilibrio puede describirse numéricamente K equilibrio=
mediante una constante de equilibrio. [ Mb ]eq⋅[O 2 ]eq
B) Estado estacionario.
Ejemplo físico: Imaginemos una orificio en la base del tanque pequeño del Nivel de agua
sistema anterior. aparentemente
constante
P1
P1
Estado
P2
estacionario
P2
(SS)
Inicio: el agua fluye rápidamente Más tarde, P1 se reduce y P2 aumenta, la
hacia el segundo tanque, pero sale fuga en el orificio iguala al flujo entre tanques.
lentamente por el orifício.
Ejemplo químico: Catálisis enzimática. La velocidad con la que E.S es formado, por la reacción
entre E y S, iguala a la velocidad con la que E..S se disocia
o cataliza la conversión de S a P.
KM kCAT [ E ]ss [ S ] ss
E + S E·S E + productos K M=
[ E.S ] ss
La constante KM no es una constante de equilibrio, se denomina constante de Michaelis
Figura 3. Comparación entre sistemas físicos y químicos en equilibrio (A), o en estado

estacionario (B).
La cinética de estado pre-estacionario considera los procesos que ocurren antes del establecimiento de
un estado estacionario. En el caso de las reacciones enzimáticas, los procesos suelen seguir regímenes
del tipo (c), aunque se han reportado algunos casos en los que se observan comportamientos del tipo
(b).
El modelado de los regímenes de tipo (c) es posible empleando métodos analíticos, en algunos casos, o
métodos numéricos en otros. Una vez establecido un modelo válido, este puede usarse para calcular el
valor de los parámetros ajustables que mejor describen el comportamiento observado.
KM
E + S E·S
kCAT
productos + E
Figura 4. Comportamiento clásico de un sistema enzimático simple en su aproximación al

régimen de estado estacionario que conocemos como rapidez inicial ( v0 ).
Dado que el modelo se refiere a las diferentes especies del sistema, dichos parámetros indican
propiedades de los intermediarios como estabilidad, cambios en la energía libre asociados a su
aparición, etc. Todos estos datos pueden proporcionar gran información acerca de los actores
participantes, particularmente, acerca de la enzima en estudio.
3 Ejemplos que ilustran el poder de esta estrategia.
Ejemplo 1: Un sistema en equilibrio no equivale a reposo absoluto.

Supongamos una proteína P se une a una substancia L y forma P L
k1
P +L PL (Esquema 1)
k2
Entonces, suponiendo que la reacción ocurre con un mecanismo sencillo, la rapidez con la que P se
transforma en PL estará dada por:
dP
− =k 1 [ P ] EQ [ L] EQ y, de igual manera, cuando se establece el equilibrio la cantidad de P L que
dt
dP
se estará convirtiendo de regreso en P será: − L =k 2 [ P L ]EQ .
dt

Para que el equilibrio ocurra, la rapidez de formación de P L tiene que igualar a la rapidez de
dP dP
disociación, es decir: − =− L y, por lo tanto: k 1 [ P ] EQ [ L] EQ=k 2 [ P L ]EQ
dt dt
[ P L ]EQ k
que, siempre que las concentraciones no sean cero, equivale a: = 1 =K F (Ecn. 4)
[ P ] EQ [ L] EQ k 2
El equilibrio es un proceso terminal, es el estado que alcanza cualquier sistema cuando su energía libre
ha sido consumida y el sistema puede permanecer ahí de manera indefinida (al menos en teoría), puesto
que la concentración de las especies ya no cambiará.
Pero, ¿Es el equilibrio un estado en el que las moléculas se encuentran en reposo?
!Claro que no¡ veamos:
Ejercicio resuelto 1. Tasa de conversión en el equilibrio.

Asumamos que el ejemplo anterior tenemos una concentración de 1×10−9 M total de la proteína y
−1 −1
1×10−5 M total del ligando, siendo k 1=100 M s y k 2=0.1 s−1 , en estas condiciones:
k 1 100 M s
−1 −1
3 −1
K F= = −1
=1×10 M y, cuando se alcanza el equilibrio, tenemos:
k2 0.1 s
Sea x EQ la concentración del complejo proeína-ligando en el equilibrio ( [ P L ]EQ ). Entonces, la
estequiometría de la reacción indica que
[ P]EQ =1×10−9 M − x eq  , [ L] EQ=1×10−5 M −x eq  y substituyendo en la Ecn. 4 tendremos:
xeq −1
K F= −9 −5
=1000 M es decir:
1×10 M −x eq 1×10 M −x eq 
1000 M −1 x 2eq −11×10−21×10−6  x eq 1×10−11 M =0 , de donde:
11×10−21×10−6 ± 11×10−21×10−62 −4×10−8

x EQ= M =9.9×10−12 M , por lo que:
2000
[ P] EQ =1×10−9−9.9×10−12  M =9.901×10−10 M y,
[ L]eq =1×10−5−9.9×10−12  M =9.999×10−6 M .
d [ PL ] −1 −12 −13
De lo anterior, se sigue =k 2 [ P L ] EQ =0.1 s 9.9×10 M =9.9×10 M / s .
dt
Si consideramos una cubeta de 1 ml y tomamos en cuenta el número de Avogadro tendremos:
d [ P L]
=(9.9×10−13 mmol ml−1 s−1 )(6.022×10 20 moléculas mmol−1)=5.962×10 9 moléculas / s
dt
Es decir, aún en el equilibrio y a concentraciones tan bajas como las que se suele manejar en los
laboratorios, la tasa de reacción es muy elevada, sólo que ocurre en ambos sentidos por igual.
Ejercicio no resuelto 1.
dP
Calcule la tasa de interconversión usando ahora la expresión equivalente − =k 1 [ P ] EQ [ L] EQ y
dt
compruebe que el flujo en ambas direcciones es el mismo.
Ejemplo 2: Tiempo en que se requiere para que se alcance el equilibrio en

el sistema del ejemplo anterior.
Para modelar la trayectoria de aproximación al equilibrio, requerimos considerar la velocidad con la
que ocurren ambas reacciones, tanto la de asociación como la de disociación. En el ejemplo anterior,
ambas tasas de reacción eran iguales, puesto que ya se había alcanzado el equilibrio. Pero mientras no
se establezca el equilibrio, la tasa neta de acumulación de P L dependerá de su taza de formación
menos la rapidez de descomposición. si “x” es la cantidad de P L formato a un tiempo t. tenemos:
dx k
=k 1 ( P 0−x )( L0−x)−k 2 x=k 1 P 0 L 0−k 1( P 0 + L0+ 2 ) x+k 1 x 2 (Ecn 5).
dt k1
Aún este caso sencillo nos da un ecuación diferencial no tan sencilla, ya que es de primer orden, pero
no homogénea y de segundo grado. Existen métodos para resolverla y casi todos los casos frecuentes
que tienen solución analítica ya han sido descritos. Lo más sencillo es consultar la tabla 2 de la
referencia: Kuby, SA. A study of Enzymes. Vol. I Chap. 10 pp. 377-415.
Pero antes de ello, aprovechemos este sistema para aprender como podemos simplificar problemas
relativamente complejos si manipulamos las condiciones experimentales para facilitar el manejo.
En nuestro caso, la concentración de proteína total es cuatro órdenes de magnitud inferior a la de
ligando. Por lo tanto, la cantidad de complejo formado x será muy pequeña en comparación con la
de ligando libre y es válido asumir que  x ≪ L0  ⇒  [ L ]= L 0 − x ≈ L 0  , por lo que, el mecanismo
anterior puede considerarse como:
APP
k1= k L
P 1
PL (Esquema 2)
k2
y la ecuación diferencial 5 se simplifica a:

dx
=k 1 ( P 0− x )[ L ]−k 2 x= APP k 1 P 0−( APP k 1+k 2 ) x (Ecn. 6)
dt
Resuelva la ecuación diferencial anterior por el método de separación de variables ilustrado en la
solución de la ecuación 2 (pag. 2, confronte su resultado con la solución indicada abajo, en la ecuación
7)
−( APPk 1+k 2 )t
k2
x=([ P]0−[ P] EQ )(1−e ) (Ecn. 7), siendo [ P ]EQ = APP [ P]0
k 1+k 2

Recapitulando:
a) Antes de atacar un sistema es necesario eliminar del modelado las complejidades innecesarias
(aquellas que no tienen efecto apreciable en el comportamiento del sistema bajo las condiciones de
estudio). Esto facilita el modelo y el identificar la información relevante en el sistema.
b) En la solución (Ecn. 7), x se aproxima a la concentración de equilibrio [ P ]0−[ P] EQ 
alcanzándola cuando la exponencial vale cero, es decir a tiempo infinito.
c) La tasa con la que el sistema se aproxima al equilibrio sigue una exponencial decreciente, lo que
quiere decir que se acerca muy rápido al inicio, pero se va frenando conforme más cerca está del
equilibrio.
Como consecuencia de los dos puntos anteriores, tendríamos que suponer que nada llega jamás al
equilibrio, si bien puede aproximarse mucho a él. Sin embargo, hay que recordar que la funciones
empleadas son funciones de variables continuas, pero los sistemas moleculares son discretos; i.e., las
soluciones presentadas aproximan bien el comportamiento del sistema mientras se extraigan
predicciones que dependan de muchas moléculas, de tal modo que un cambio de concentración no
implique fracciones de molécula.
Ejercicio resuelto 2. Tiempo necesario para que la concentración de P L

remanente sea 99% de la concentración al equilibrio.
Llamemos t 99 al tiempo en el que x=0.99[ P L ] EQ =0.99 ( [ P]0 −[ P] EQ ) .
De la ecuación 7 x=[P ]0 −[ P ] EQ 1−e− k 1 Lk 2 t 99
 . Substituyendo los valores dados en el ejercicio
resuelto 1 tendremos:
0.99  [P ]0 −[ P ] EQ =[ P ]0 −[ P ] EQ 1−e−k
Lk 2 t 99
1
 , por lo que:
ln (0.01)
e− k 1 L k 2 t99
=1−0.99=0.01 y t 99=− =45.6 s
k 1 L+k 2
Para fines prácticos, aún es esta reacción, que podemos considerar lenta, ¡se requiere menos de un
minuto para que se establezca el equilibrio!
Note que si aumentamos la concentración de proteína, esto no tendrá un efecto apreciable en el tiempo
en el que se alcance el equilibrio, en tanto no se viole nuestra aproximación de que la concentración de
ligando inicial se mantenga casi constante durante la aproximación al equilibrio (es decir, mientras no
pongamos proteína a un nivel cercano al de ligando).
Una particularidad de este ejemplo, que suena bastante sorprendente, es que la concentración de
proteína es irrelevante para determinar el tiempo en el que se alcanza el equilibrio, pero además, la
concentración de ligando tampoco tienen un efecto apreciable, en tanto [L] no alcance valores
superiores a 10 mM, ya que 100 M −1 s−1 [ L]≪ k 2 (ver los datos en el ejemplo 1). Es decir, a pesar de
que numéricamente, la constante de rapidez de la disociación del complejo parece pequeña para ser
muy relevante - lo que determina la rapidez con la que se alcanza el equilibrio es la rapidez del proceso
de descomposición del complejo - ¡no la rapidez con la que se forma!
Esta es una situación común en muchos sistemas dinámicos, los pasos que determinan la dinámico del
proceso global son a menudo pasos que intervienen en el proceso que ocurre en la dirección opuesta a
aquella en la que se observa un flujo neto, es decir “ los frenos pueden ser más significativos que el
empuje”.
Note también que, en alícuota de 1 nl de la solución anterior, tendríamos:
−12 −1 14 −1 −1
0.99[ P L ] EQ =0.99×9.9×10 nmol nl ×(6.022×10 moléculas nmol )=5902.2 moléculas ml
Es decir aún con tan poco proteína y en un volumen muy pequeño tenemos muchas moléculas y la
diferencia entre 5902 y 5902.2 moléculas es despreciable.
Estime el tiempo adicional que tendré que esperar para pasar de 99% de la concentración de PL EQ
para llegar a 99.99% de su concentración de equilibrio.
Ejemplo 3. Aceleración de una reacción enzimática en su camino hacia el

estado estacionario.
En el sistema anterior, no había ninguna reacción química, tan sólo un proceso físico de asociación de
proteína y ligando. Curiosamente, las ecuaciones que empleamos para describir la cinética de estos
procesos no difieren de la cinética de transformaciones químicas. Consideremos la forma más sencilla
de reacción química catalizada enzimáticamente, un único reactante, un sólo producto y sólo dos
formas de la enzima (Esquema 3).
k1 S kCAT P
E E·S E·P E (Esquema 3)
k2
Este proceso no está ahora en equilibrio y es una trasformación química, pero para modelarlo
recurrimos a las mismas herramientas que antes, es decir, la rapidez de la reacción química se mide
como:
dP
=k CAT [ E.S ] (Ecn. 8) y la rapidez de formación y desaparición del complejo está dada
dt
d [ E⋅S ]
por: =k 1 [ E ][ S ]− k 2 k CAT [ E⋅S ]=k 1  E 0−[ E⋅S ][S ]−k 2k CAT [E⋅S ] ,
dt
d [ E⋅S ]
que se simplifica a: =k 1 E 0 [S ]−k 1 [S ]k 2k CAT [E⋅S ] (Ecn. 9)
dt
Si asumimos nuevamente que [S] >> [E] y que durante el tiempo del experimento la [P] << [S]. La
cantidad de S consumida en la formación de E·S y de P es despreciable y se puede considerar que
[S]≈[S]0 y permanece aproximadamente constante. Ahora, derivando la ecuación 8, obtenemos la Ecn.
10.
d 2[ P ] d [ E⋅S ]
2
=k CAT (Ecn. 10) por lo tanto, multiplicando la ecuación 9 por k CAT y
dt dt
obtenemos la Ecn. 11.

d [ E⋅S ]
k CAT =k CAT k 1 E 0 [S ]−k CAT k 1 [S ]k 2k CAT [E⋅S ] (Ecn. 11). Substituyendo 8 en 11
dt
y la expresión resultante en 10 tendremos:
d 2[ P ] dP
2
=k CAT k 1 E 0 [ S ]− k 1 [ S ]k 2k CAT  y que se ordena para dar:
dt dt
d 2[ P ] dP
2
k 1 [S ]k 2k CAT  −k CAT k 1 E 0 [S ]=0 (Ecn. 12).
dt dt
Esta ecuación diferencial ya no se puede resolver con los métodos que empleamos para resolver la
ecuación 3 (pag. 2), pero observemos que [P] sólo aparece como derivadas, por lo que para
simplificarla se recurre a un truco sencillo, substituir la variable:
d [P] d  d 2[ P ]
sea = , por lo tanto: = 2 de donde se tiene:
dt dt dt
d
k 1 [ S ]k 2 k CAT   −k CAT k 1 E 0 [ S ]=0 (Ecn. 13). Ahora si podemos separar las
dt
variables y ordenarla, es decir:
d
=dt
−k 1 [ S ]k 2 k CAT  k CAT k 1 E 0 [ S ]
d
=k 1 dt
k k (Ecn. 14).
−[S ][ 2 CAT ] k CAT E 0 [S ]
k1
si definimos:
k 2k CAT
KM= (Ecn. 15) y V MAX =k CAT [E 0 ] (Ecn. 16),
k1
substituyendo 15 y 16 en 14 y como a t =0 , [ E⋅S ]=0 y  0 =0 nos queda la siguiente integral
definida:
 t
d
∫ −[ S ]K  V [ S ] 1 ∫ dt , que se resuelve para dar:
=k
0 M MAX t =0
1
−  [ ln −[S ]K M  vV MAX [ S ]−ln V MAX [ S ] ] =k 1 t , o bien:
[S ]K M
ln
 V MAX [ S ]
V MAX [S ]−[S ]K M  
=k 1 [S ]K M t ,
que es la solución en su forma logarítmica, en su forma exponencial tendremos:

k  [S ] K t k [ S ]K  t
V MAX [ S ]=e 1
V MAX [ S ]−e
M 1 M
[S ]K M  , es decir:
d [P] V [S ]
== MAX  1−e−k [S ] K 1 M t
 (Ecn. 17).
dt [S ]K M
¡Sorpresa! El resultado es la ecuación de Michaelis y Menten multiplicada por un factor
exponencial. Ahora, si queremos determinar como varía la concentración de producto en función del
tiempo, ya sólo tenemos que integrar esa función. Suena a una integral complicada, pero no olvidemos
que [S] se consideró constante en el planteamiento inicial, de manera que en realidad no tenemos que
considerarla variable ahora, por tanto, podemos simplemente separar las variables para poder integrar,
considerando que la concentración inicial de producto es cero.
P t
[ S ]K M 
∫ V [ S ] d [ P ]=∫  1−e−k 1 [ S ]K M  t
 dt
0 MAX 0
V MAX [S ]
 e−k [ S ]K  t −1

1 M
[ P]= t (Ecn. 18), que equivale a:

[S ]K M  k 1 [S ]K M 
 
−k 1 [S ] K M t
V [S ] k 1 [S ]K M  te −1
[ P]= MAX
[ S ]K M  k 1 [S ]K M 
Para analizar el comportamiento de esta ecuación consideremos primero que la reacción se encuentra
en los primeros momentos; así, la función exponencial se puede simplificar considerando sólo los
x2 xn
primeros tres términos de la expansión de Taylor ( e x =1x !... ! ), es decir, el numerador
2 n
de la expresión anterior dentro del paréntesis se convierte en:
k 21 [S ]K M 2 t 2
−k 1 [S ]K M t  1−k 1 [ S ]K M  t1/2 k 21 [S ]K M 2 t 2 −1=
2
y toda la expresión se simplifica a:
V MAX [S ] k 1 k CAT E 0 [ S ] 2
[ P]=
2
 k1=
2
t (Ecn. 19).
Una gráfica de [P] vs. t 2 es aproximadamente lineal y tiene pendiente 1/2 k 1 k CAT E 0 S 0 .
Ahora, si k CAT y K M han sido determinadas de los datos de estado estacionario, E 0 es
conocida y aceptando la ecuación 15 como una definición correcta de K M , entonces es posible
calcular todas las constantes.
A tiempos largos, la ecuación 18 puede simplificarse considerando que el término de decaimiento
exponencial se hace despreciable, con lo que la ecuación se reduce a:
[ P]=
V MAX [S ]
[S ]K M  
t−
1
k 1 [S ]K M   (Ecn. 20).
En estas condiciones se alcanza el estado estacionario, el cual es ahora descrito por esta recta cuya
V MAX [S ]
pendiente es y cuya intercepción con la ordenada está del lado negativo del eje y
[S ]K M 
equivale a:

 −V MAX [S ]
k 1 [S ] K M 2  .
Si ahora extrapolamos la recta al las abscisas ([P]=0), nos da  k 1 [S ] K M t−1

k 1 [S ]K M 
2
 =0 . Despejando el
1
tiempo, al que llamaremos periodo de retardo (  ) o fase "lag", tenemos = . De
k 1 [S ]K M 
nuevo, si se conoce K M , o si la concentración de sustrato es saturante [S ] K M ≃[S ] , se puede
determinar el valor de k 1 .
Este caso puede no ser muy realista, porque se asume que la reacción es completamente irreversible y
que en el proceso catalítico sólo interviene un complejo ES (lo cual no siempre es una aproximación
válida). Sin embargo, ilustra el poder de la medición de la reacción en condiciones previas al
establecimiento del estado estacionario y muestra que la cinética de estado preestacionario nos puede
decir que tan rápido se asocian la enzima y el sustrato, que tan rápido se disocia el complejo y EL
VALOR VERDADERO DE LA CONSTANTE DE DISOCIACIÓN DEL COMPLEJO Enzima-
Sustrato.
Este enfoque fue empleado por Gutfreund para determinar las constantes de la reacción de hidrólisis de
esteres sintéticos de aminoácido catalizada por la quimitripsina. El siguiente ejemplo es una adaptación
de sus resultados.
La quimotripsina cataliza la hidrólisis de ésteres de aminoácido como la acetil-tirosina (AcY). lo
reacción puede seguirse por el cambio en la fluorescencia de TYR cuando se desacetila. Se realizaron
las siguientes mediciones con 0.3 μmol de enzima, en cubetas de 3 ml y variando la concentración del
sustrato, según se indica, bajo condiciones de estado estacionario.
[S] (μM) δP/δt (μmol min-1) ± SE.
3.5 1.14 0.10
6.0 1.69 0.02
11.0 2.34 0.08
20.0 2.97 0.14
35.0 3.42 0.33
60.0 3.91 0.23
Luego se siguió la reacción en el periodo pre-estacionario mezclando dos soluciones (par partes
iguales) una con 20 μM de enzima y otra con 100 μM de sustrato en un equipo de flujo detenido. Los
resultados obtenidos fueron los siguientes:
tiempo (ms) [P] (µM) tiempo (ms) [P](µM) tiempo (ms) [P] (µM)
0.0 0.000 6.2 0.362 14.1 1.200
0.9 0.012 6.5 0.387 14.6 1.261
1.0 0.014 6.7 0.406 15.0 1.312
1.2 0.021 7.0 0.432 15.5 1.364
1.5 0.030 7.3 0.459 16.0 1.427
1.8 0.040 7.5 0.487 16.6 1.490
2.0 0.051 7.8 0.509 17.0 1.543
2.3 0.063 8.1 0.538 17.5 1.607
2.5 0.078 8.3 0.561 18.0 1.661
2.8 0.091 8.5 0.584 18.5 1.725
3.0 0.105 8.7 0.607 19.0 1.779
3.2 0.121 9.0 0.640 19.5 1.834
3.5 0.141 9.3 0.664 20.0 1.900
3.8 0.156 9.5 0.689 21.0 2.021
4.0 0.175 9.7 0.714 22.1 2.142
4.2 0.192 10.0 0.748 23.1 2.264
4.5 0.214 10.5 0.800 23.9 2.365
4.8 0.232 11.0 0.854 25.0 2.499
5.0 0.252 11.5 0.909 26.1 2.622
5.2 0.272 12.0 0.965 27.0 2.735
5.5 0.293 12.5 1.023 28.1 2.858
5.7 0.315 13.0 1.081 29.1 2.982
6.1 0.344 13.5 1.140 30.0 3.091
Asumiendo que esta enzima sigue el modelo del Esquema 3 (Pag. 11) determine el valor de las
constantes k 1 , k 2 y k CAT .

4 Métodos para cuantificar los tiempos de relajación. “Stopped

Flow”, “Quenched Flow” y “Equilibrium Jump”.
Los primeros experimentos de cinética rápida reportados son los realizados por Hartridge y Roghton en
1923, quienes se inspiraron en un instrumento diseñado por Reschig (1905), diseñado para estudiar
reacciones en fase gaseosa. Es esos experimentos, Hartridge y Roghton mezclaron una solución de
hemoglobina con otra de monóxido de carbono y la mezcla se hizo fluir por un tubo delgado que tenía
una serie de termopares (sensores) a los largo de tubo. Como la reacción de la hemoglobina con el
monóxido desprende calor, ellos fueron capaces de seguir la exención de la reacción por el calor
desprendido. Lo más interesante es que si la velocidad de flujo es constante, en cada punto del tubo la
solución tiene una edad diferente después del mezclado, el resultado es que cada termopar está
detectando el proceso de la reacción a diferentes tiempos después del mezclado. Este experimento es de
concepción simple y el equipo que requiere no es muy sofisticado en cuanto a la resolución y el tiempo
de respuesta, ya que en cada punto del tubo la solución es continuamente reemplazada por otra solución
igual. Sin embargo se requieren cantidades enormes de proteína, que difícilmente pueden obtenerse
cuando no se trata de la hemoglobina.
Figura 5. Diseño de un equipo clásico de flujo detenido. En el esquema se muestran los

componentes básicos, incluyendo dos diferentes diseños de celdas y un mezclador de 4
vías.
En 1940, Chance realizó un experimento semejante, pero detuvo el flujo intempestivamente en la celda
de un detector. Si el flujo se detiene cuando la solución ha envejecido apenas unos milisegundos, se
puede seguir el devenir de la reacción en la celda mediante el uso de algún espectroscopio
(espectrofotómetro o espectrofluorómetro, son los más comunes).
El diseño clásico de un equipo de flujo detenido se muestra en la figura 5, en ella se muestran la

jeringas de reactantes que contienen dos soluciones distintas, con los componentes de la reacción
separados de manera que la reacción no se inicia, hasta después del mezclado. La mezcla ocurre en un
dispositivo mezclador que provoca un régimen de flujo hidrodinámico turbulento en la conjunción de
las tuberías.
En un equipo de flujo rápido típico (Fig 5), la solución se conduce hacia una cámara de observación y
se recoge finalmente en una jeringa receptora. Las jeringas de reactantes son empujadas
simultáneamente, generalmente por un dispositivo automatizado. El émbolo de la jeringa receptora está
también acoplado a un transductor que enciende el registro cuando el empujado hasta su posición final.
Los detectores estaban inicialmente acoplados a un osciloscopio para permitir un registro de lo ocurrido
en la celda en los primeros 10 a 100 ms de la reacción. En los equipos modernos dispositivos
electrónicos computarizados colectan los datos en formato digital. Sin embargo, se trata de equipos
costosos debido a que los procesadores de la señal deber ser capaces de registrar y procesar los datos
con gran rapidez y la sincronía entre la mecánica y la electrónica debe ser precisa.
A B C
Figura 6. A) Diseño de un equipo clásico de flujo extinto (QUENCHED FLOW). En el

esquema se muestran los componentes esenciales, pero en este equipo el tiempo de reacción
está fijado por la longitud del trayecto ente los mezcladores y la velocidad del flujo. B) se
muestra una fotografía de un equipo comercial. C) Equipo básico de flujo extinto pulsado.
En este equipo luego de un pulso en el impulsor A, un sistema adicional de válvulas puede
retener el líquido en el tubo de incubación por el periodo deseado, en tanto que un pulso del
impulsor B desplaza el líquido de la incubadora al segundo mezclador para detener la
reacción.
Para algunas reacciones que no es posible seguir en los espectroscopios, se han diseñado equipos que
se conocen como de flujo extinto (“quenched flow”). un esquema básico de ellos se muestra en la figura
6. Los equipos de flujo extinto difieren de los de flujo detenido en que tienen un asegunda cámara de
mezclado que permite combinar la reacción con una solución que la detiene, generalmente con ácido o
alguna otra substancia que ejerza su efecto de manera casi inmediata, esto en comparación con la
rapidez con la que ocurre el proceso en estudio.
Aunque se requieren cantidades grandes de proteína y para seguir la reacción en el tiempo hay que
recurrir a trucos como pulsar o variar el flujo, lo que generalmente se realiza con un sistema de

válvulas controladas por computadora, pero esto generalmente se traduce en experimentos más largos,
con buen gasto de proteína y se obtiene una cantidad abundante de muestra por analizar.
El tiempo que transcurre para que el líquido llegue desde la cámara de mezclado a la celda se llama
“tiempo muerto” del equipo. Aunque puede reducirse acortando la longitud de la tubería, en la práctica
hay un límite a esta distancia, ya que los fenómenos de transporte en la soluciones durante el mezclado
impiden que los reactantes formen una mezcla homogénea en tiempos demasiado cortos.
A pesar de los enormes adelantos tecnológicos, los tiempos muertos de los equipos de flujo detenido no
han logrado reducirse gran cosa desde que se fabricaron los primeros equipos. Recientemente, equipos
que emplean los adelantos en la tecnología de materiales para fabricar tubería muy delgada, con muy
poca fricción y cámaras de mezclado óptimas, con diseños asistidos por computadora han logrado
reducir los tiempos muertos de 2 o 3 ms a tan sólo 0.5 ms. Como se ve, el avance no ha sido
espectacular.
Cuando se desea estudiar reacciones en tiempos aún más corto se ha recurrido a la técnica de
perturbación del equilibrio. Esta técnica tiene la ventaja de que no depende de la difusión para el
mezclado, porque la reacción se mezcla y se deja llegar a equilibrio dentro de la cámara de
observación. Entonces, se emplea un cambio en las condiciones del medio que modifique la posición
del equilibrio y se detecta como es que las especies se redistribuyen para satisfacer la condición de
equilibrio. Estos estudios reciben el nombre de “salto del equilibrio” (EQUILIBRIUM JUMP).
Dos tipos equipos han sido los más empleados:
I) los que modifican la temperatura, lo cual puede hacerse de manera muy eficiente en tiempos tan
cortos como 0.1 ms, sobretodo si el cambio es de unos pocos grados. Aunque su diseño puede
considerarse tan sencillo como el de un espectrofotómetro con control de temperatura por efecto
Peltier, la necesidad de transmitir el calor en tiempos muy cortos y permitir su flujo hacia el cuerpo de
la solución en periodos igualmente cortos, hace de este tipo de instrumentos equipos muy costosos.
Recientemente el uso de luz láser (Fig. 7) permite calentar específicamente el solvente (usando un láser
de Oxidos de Ytrio y Aluminio envenenados con Neodimio, conocido como Nd-YAG, que emite luz
infrarroja de 1064 nm) en tiempos aún más cortos. En teoría el límite inferior de resolución de esta
estrategia puede ser llevado al orden de 10 ps.
II) Los que modifican la presión, cuyos efectos en la solución se transmiten de manera casi instantánea,
especialmente en solvente poco compresibles como el agua. Sin embargo, para que se observen
cambios importantes en las constantes de equilibrio se requiere aplicar cambios de presión de varios
cientos o, incluso, miles de atmósferas, lo que no es resistido por cualquier equipo, especialmente en la
cámara de observación, que tiene que permitir el registro de los eventos que ocurren en su interior.
Frecuentemente en estos equipos la celda de observación es un conductímetro y el diseño general del
equipo se realiza en acero inoxidable, excepto por el disco o membrana de ruptura que es de Nylan u
otros materiales poliméricos resistentes a la deformación.
Finalmente, algunas reacciones pueden estudiarse mediante “saltos” del equilibrio que pueden
provocarse con luz o con electricidad mediante efectos fotoquímicos o electroquímicos. Aunque estas
estrategias están limitadas a reacciones en las que el proceso químico lo permite, su aplicación puede
ser muy informativa, dado que se puede tener un control muy estricto del inicio del proceso.
Un aspecto muy importante de esta estrategia es el tipo de registro espectroscópico que se ha de
realizar. Se han empleado muy comúnmente espectrofotómetros y fluorímetros en el rango UV/visible.
Pero más recientemente se ha introducido el uso de espectrofotometría infrarroja (IR), resonancia
paramagnética del electrón (EPR), fluorescencia de energía transmitida por resonancia (FRET) y
resonancia magnética nuclear (NMR). En algunos casos, ha sido posible el introducir marcaje isotópico
en sitios específicos del ligando o de la proteína. Esta técnica es de utilidad si se combina con la
espectrofotometría IR, ya que el espectro diferencial entre la mezcla sin y con el marcaje isotópico
proporciona la señal de aquellos átomos que están covalentemente unidos al isótopo.
A B
Figura 7. A) Diseño esquemático de un espectroscopio de salto de temperatura basado en

calentamiento por medio de luz láser. B) Emisión a 340 nm en respuesta a un salto de
temperatura de 5 a 25 oC de una solución con 20 μM de triosa fosfato isomerasa (TIM). (a) apo-
TIM; (b) TIM con 5 mM gliceraldehído-3-fosfato. La línea roja es el registro de la señal y la
verde el ajuste de los datos. La señal transitoria entre 14 y 50 ns no tiene aún explicación
satisfactoria (tomado de Callender y Dyer, 2002).
5 Escalas de tiempo, resolución de los espectroscopios y

límites de la técnica.
Para ilustrar la capacidad de resolución de esta técnica consideraremos lo siguiente.
1. Los diferentes métodos tienen diferente capacidad para mostrar información dependiendo de la
rapidez con la que es posible “disparar” el fenómeno. Las técnicas que implican mezclado
(stopped flow or quenched flow) tienen un límite técnico 0.1 ms, aunque en la práctica los
mejores equipos actuales usualmente llegan a los 0.5 ms. Las técnicas de salto del equilibrio son
mucho más eficientes y permiten registrar los fenómenos en tiempos de hasta 0.05 s. Aunque
los equipos modernos utilizan un láser "sintonizado" para calentar el solvente (agua) y permiten
llevar la resolución a límites 10 veces inferiores.

2. A 3. B 4. C
5. Figura 8. Diseño clásico de un equipo de salto de presión A) esquema general B)

diagrama de la bomba de presión para detección con conductividad. C) diagrama
de la celda de conductividad y su montaje (tomado de Takahashi y Alberti)
6. Sin embargo, para que muchos de estos equipos puedan controlarse con precisión, la tecnología
moderna se apoya principalmente en los dispositivos electrónicos. Tales dispositivos dependen
en general de un circuito básico llamado oscilador, que puede generar señales sinusoidales de
corriente alterna de diversas frecuencias. Las frecuencias determinan en gran medida el tamaño
de los fenómenos que se pueden codificar o inspeccionar con tal señal. En general, aquellos
fenómenos cuya frecuencia es mucho menor que la frecuencia de la onda de sondeo se pierden,
simplemente porque el sondeo se basa en la perturbación de la onda por la señal que se está
observando. Nuestros dispositivos actuales trabajan en frecuencias que se mueven en el orden
de los 0.1 a 100 MHz (millones de oscilaciones por segundo). Esto quiere decir que se puede
sondear bien cosas que ocurren en rangos de micosegundos o menos, pero también quiere decir
que las señales son capaces de viajar por el aire y generar un importante nivel de ruido en los
equipos. Por lo mismo, las señales observadas deben tener una intensidad apreciable para que
puedan separarse del ruido. Este problema ha sido obviado en parte gracias a la conversión
digital. Los mejores circuitos disponibles en la actualidad manejan conversiones en el orden de
96 MHz. Lo que significa que para analizar una curva con una duración de 1 µs podemos
procesar unos 96 puntos de la señal. Si vemos la curva de la figura 9, observaremos que para
analizar una curva de este tipo se requiere de un mínimo de 3 o 4 puntos para definir la región
lineal, pero podríamos requerir 10 o más puntos para definir bien la parte curva, lo cual depende
mucho también de la dispersión debida al ruido.
Figura 9. Datos del problema 4 ( pag. 15) en forma gráfica. La línea

verde es resultado del ajuste por regresión no lineal a la parte final
de la curva, la línea azul es una parábola de la forma y=x 2
ajustada al inicio de la curva. Ambas líneas fueron extendidas más
allá de la región en que fueron ajustadas.
7. Por último, en la reacciones químicas catalizada por enzimas los fenómenos generalmente
ocurren en soluciones acuosas. Ello significa que la rapidez con la que un fenómeno de segundo
orden ocurre no superan un valor de 4×109 M −1 s−1 , pero los fenómenos que no dependen
del choque entro dos moléculas, como podría ser la transferencia de un protón en el sitio activo
de la enzima, si pueden presentar constantes mayores. En el primer caso, para determinar el
valor de una constante de segundo orden de 1×10 9 M −1 s−1 , si el menor valor de  que
podemos medir es de digamos 1 ms, necesitamos una concentración de sustrato de 1 μM, pero
con una concentración de sustrato de ese nivel, la cantidad de producto acumulado sería 50
veces menor a la que se muestra en la figura 3, lo que significaría que aún por fluorescencia
sería casi imposible detectar la señal del producto acumulado. Con la fluorescencia se genera un
problema adicional, ya que la excitación lumínica decae por fluorescencia en tiempos que
pueden exceder un milisegundo, por lo que es posible que las medidas no se presenten en estado
estacionario y entonces habría que resolver también los tiempos de relajación debidos a la
acumulación o pérdida de la forma excitada del fluoróforo.
8. Con las constantes de primer orden el problema es que no dependen de la concentración, lo que
significa que son inversamente proporcionales a los tiempos de relajación y, por lo tanto,
valores superiores a 1×10 4 s−1 escapan a auscultación directa por técnicas de flujo detenido,
o bien 1×106 s−1 para las técnicas de salto del equilibrio.
9. Por último, cuando un intermediario sufre dos isomerizaciones consecutivas, sus tiempos de

relajación aparecen sumados en las ecuaciones, es decir, lo que veremos es la suma de ambos
tiempos de relajación, si uno de ellos es muy lento con respecto al otro, su valor dominará en el
proceso y sólo podremos ver uno de ambos intermediarios.
6 Solución analítica de mecanismos cinéticos comunes y sus

implicaciones.
En la primera parte de este escrito tratamos de un caso relativamente sencillo, que seguramente no
puede ser aplicado más que a unos pocos casos, ya que supone que la formación de producto se da en
un sólo paso y la liberación del producto ocurre sin la presencia de formas intermediarias del complejo
enzima producto. Si se asume que la concentración de sustrato no es limitante y que permanece
constante en los experimentos, es posible obtener una solución analítica para el sistema completo
considerando la reacción reversible y varias formas intermediarias, por ejemplo:
k1 S i
k2 f
kCAT k6
i
k4
E E·S E*S E·P E*P E (Esquema 4)
k2
i
k4 r
kCAT k8
i
k3 P
Por supuesto, no es difícil imaginar que la concentración de producto en función del tiempo tendrá una
forma compleja.
Para empezar podemos ver que se trata de un sistema que generará 4 ecuaciones diferenciales
independientes, una por cada especie enzimática menos una, más la ecuación de balance de masa para
la enzima. La formación de producto en función del tiempo dependerá de la conversión de ES en EP, la
cual puede además revertirse, es decir:
d [P ] f
− = k CAT [E∗S ]− r k CAT [ E∗P] (Ecn 21)
dt
Pero para resolver la ecuación 21 en términos de la concentración de sustrato, producto, enzima total y
los valores de las constantes de rapidez, necesitamos saber como varía la concentración de E*S y E*P
en función del tiempo, lo que implica conocer también las demás formas, ya que todas ellas están
interconectadas por los eventos químicos.
Matemáticamente se puede demostrar que un sistema de ecuaciones diferenciales lineales de primer
orden con 5 ecuaciones independientes (incluyendo el balance de masa de la enzima) y 5 funciones
desconocidas (una describiendo la variación en la concentración de cada especie como función del
tiempo) tiene al menos una solución completa.
La manera más evidente de obtener tales soluciones es usar las funciones exponenciales, ya que esta
función, al ser derivada da lugar a si misma, lo que significa que puede eliminarse de las ecuaciones
igualadas a cero (por factorización) y se resuelve entonces una ecuación algebraica con los
coeficientes, que permite determinar los valores de todos los coeficientes, el resultados será de la
forma:
[ P]t= A0 f t A1 e t /   A2 et /  A3 et /  A4 e t /  A5 e t /
1 2 2 4 5
en donde f t es usualmente una función algebraica de t, A0 , A1 , etc. son las amplitudes de
los componentes exponenciales y 1 ,  2 , etc. son los llamados tiempos de relajación de los
componentes exponenciales., que son funciones de las constantes de rapidez. Los tiempos de relajación
son funciones algebraicas racionales de las constates de velocidad, la concentración de sustrato y la
concentración de enzima total.
En la actualidad, es incluso posible ajustar las curvas experimentales a los datos directamente a las
ecuaciones diferenciales, ya que hay programas capaces de resolver el sistema en forma numérica y
luego aproximar los valores de las constantes mediante ajuste por iteraciones sucesivas. Si bien, tales
algoritmos son complejos, requieren numerosos controles para solventar las complicaciones numéricas
de hacer cálculos repetidamente y son, por ello, costosos en tiempo de cálculo. Afortunadamente, la
aproximación puede realizarse en la computadoras de escritorio modernas en tiempo bastante
razonables, pero uno tiene que realizar experimentos con diversas condiciones iniciales contrastantes,
con el fin de asegurar que el modelo es consistente con los datos en todas ellas. Además, existen
programas que manejan las ecuaciones en forma simbólica y pueden ayudar a obtener la solución de un
sistema en forma completa.
En cualquier caso, como se podría esperar, hay un pelo en la sopa, ya que las sumas de funciones
exponenciales tienen formas que siguen pareciéndose a una función exponencial y para determinar el
número de componentes exponenciales que explican un sistema se requiere que los valores de los
tiempos de relajación ( τ ) y las amplitudes se encuentren bien separadas (es decir, serán de
magnitudes razonablemente distintas). En la práctica, resulta casi imposible separar razonablemente
más de 3 componentes a partir de un sólo conjunto de datos experimentales.
Un análisis completo de un sistema como el mostrado en el esquema 4 es posible si se asume que las
concentraciones de los ligandos S y P, así como otros ligandos intermedios que puedan aparecer en el
mecanismo, se pueden mantener en niveles cuasiconstantes. Es decir, que existen valores promedio
L̄i promedio que describen el comportamiento del sistema de manera razonable, bajo las condiciones
experimentales en estudio. Tal análisis ha sido descrito en detalle por Hammes y Schimmel (1966;
1967).
Estos esquemas ilustran que se pueden analizar secuencias de reacciones consecutivas y resolver la
aparición y desaparición de los intermediarios, para determinar las constantes del sistema.
Ejemplos de la aplicación de este análisis hay muchos, por ejemplo la emisión de luz por la aequorina
reportada por Hastings et al., (1969). Un caso interesante fue reportado por Halford, Johnson &
Grinsted (1979), usando la enzima de Resitricción EcoRI. En dicho trabajo, se aprovecha que la enzima
realiza el corte en cada hebra en momentos distintos y usando un plásmido superenrrollado se pueden
separa el DNA superenrrollado (sustrato) del DNA circular relajado (cortado en una hebra, pero no
abierto) y el DNA abierto (cortado en ambas hebras).
En estos dos casos, los mecanismos pueden ajustarse al esquema 5.
k12 k23 (Esquema 5)

A B C
Cuya solución estaría dada por las Ecn. 22y 23.
−k 12 t
C A (t)=C A (0)e (Ecn. 22)

k 12 −k t k t
C B (t)=C A (0) (e −e ) (Ecn. 23)
12 23
k 12 +k 23
Un ejemplo reciente de la aplicación este tipo de análisis para el estudio de la enzima piranosa-2-
oxidasa se puede consultar en el trabajo de Prongjit y colaboradores (2009). En dicho estudio los
autores aseguran haber resuelto hasta 5 componentes exponenciales independientes, lo cual es muy
poco común.
7 Manipulación de la condiciones para reducir la complejidad

del problema.
Los ejemplos anteriores y la sección previa nos hacen ver que la elección de las condiciones
experimentales es crucial para reducir la complejidad del problema.
Por ejemplo, consideremos el esquema 4 (Pag. 22). Si la concentración de sustrato no sólo es constante,
sino además saturante, podemos considerar que la formación de complejo ES es muy rápida y su
disociación en E + S prácticamente no ocurre. Esto puede hacer que el paso de ES a E*S y los
posteriores sean mucho más lentos y determinen la cinética, por lo que la contribución de ese primer
paso se puede “esconder” a los ojos del espectroscopio.
Usualmente además, la presencia de producto es muy baja y los pasos de reversión de la reacción
(determinado por k 3 P ) no es observable, lo que ciertamente simplifica bastante la forma de las
ecuaciones y, por lo tanto, su análisis.
Pero uno podría añadir una cierta cantidad de producto, provisto que no sea tanto que enmascare la
medida del que se está formando, o bien, si existe alguna señal espectroscópica de la proteína que sea
característica de alguna de las formas intermediarias, como pasa en aquellas enzimas que dan señales
fluorescentes con la unión de algún ligando. En este caso, enlentecemos mucho el paso de conversión
de sustrato a producto y podemos hacer que este paso domine las curvas, por lo que nuestro proceso
podría darnos señales más fáciles de analizar.
También es posible modificar la rapidez de los cambios conformacionales de la proteína alterando la
temperatura, el pH, la viscosidad del medio o la presión. Con lo cual, si logramos que alguno de los
pasos sea afectado de manera particular, podemos hacerlo suficientemente lento para estudiarlo sin
interferencia apreciable de los demás eventos.
Desde luego no existe una receta única, cada sistema tiene sus peculiaridades propias y es necesario
conocerlas bien, a fin de explotarlas cabalmente. Es decir, cada sistema requiere una buena cantidad de
trabajo de caracterización previa para que su análisis pueda realizarse con éxito.
Veamos un caso más, reconsideremos el ejemplo 3, pero ahora hagamos que la cantidad de enzima y
sustrato sean tales que la formación de producto casi se agote luego de un ciclo catalítico. Sensu
estricto deberíamos resolver nuevamente el modelo, porque en él se asume que la concentración de
sustrato será una constante, lo cual ya no ocurre en esta nueva situación. Sin embargo, en aras de la
simplicidad consideremos que existe una “concentración de sustrato promedio ( [ S ] )” tal que los
valores de las constantes serán también promedio y que las desviaciones causadas por las variaciones
de [S ] afectan el valor de las constantes, dentro de la incertidumbre del error experimental, pero no
la forma de las curvas.
Consideremos que: i) la cantidad de enzima es igual o superior a la de sustrato, por lo que la formación
del complejo E⋅S será bimolecular y mucho más rápida que otros eventos; ii) la enzima es de tal
forma que complejo E⋅S se convierte en un intermediario I que da una señal espectroscópica
semejante a la del producto (si estuviésemos hablando de una deshidrogenasa, equivale a decir que el
NADH pegado a la enzima absorbe casi igual al NADH soluble); ii) la reacción no se revierte con las
cantidades de producto que se generan durante el experimento, es decir la termodinámica de la reacción
dificulta su reversibilidad. El modelo puede escribirse a hora como sigue:
kf S kL P
E I E (Esquema 6)
kr
Para simplificar el esquema y la solución haremos un truco introducido originalmente por Cleland y
usado de manera amplia por Fersht, que consiste en abreviar el mecanismo escribiendo constantes de
velocidad aparentes que reemplazan a las verdaderas (net rate constants), pero que reducen cada paso a
un sólo evento pseudoirreversible. como se muestra en el esquema 7.
a b
E I E (Esquema 7)
P
Para estas constantes a y b , consideramos que el tránsito de E a EP pasando por I
es igual a la probabilidad de que E pase a I ( k f [ S ] ) multiplicada por la probabilidad de que
kL
I pase a EP en lugar de romperse de nuevo ( ) , es decir:
k L k r
kL
a= k [ S ]= k CAT / K M [ S ] (Ecn. 24),
k L k r f
APP
en tanto que el paso de I a EP estará determinado únicamente por b=k L= k CAT (Ecn.
25), entonces, la formación de intermediario I estará determinada por:
d[I] d[P]
=a [E ]−b [I ] , la liberación de producto por =b[ I ] y [ E]0=[E ][ I ] .
dt dt
Substituyendo [E] en la primera expresión tenemos:
d[I]
=a [ E ]0−(a+b)[ I ] (Ecn. 26),
dt
Que de nuevo puede resolverse por separación de variables, ya que [ E] 0 es constante.
Usemos esta ecuación para usar la herramienta maxima, que nos permite obtener soluciones simbólicas.
La figura 10 presenta el trabajo de obtención de la solución en este software y la solución se puede
simplificar a:

a
[ I ]t =[ E ]0  1−e− ab t  (Ecn. 27), ahora, como:
ab
d [P] ab 
=b[ I ]=[E ]0 1−e− a b  t  , obtenemos una ecuación diferencial integrable
dt ab
fácilmente para obtener [ P]t .
ab ab
[ P]t=[E ] 0 t−[ E ]0  1−e− ab t  (Ecn. 28).
ab ab
2
La ecuación 28 es de hecho equivalente a la ecuación 18 (Pag. 13), lo que se puede ver reemplazando
a y b por sus valores originales. Recordando que el intermediario y la señal espectroscópica del
producto no son distinguibles, tendremos que la señal total F(t) = [I](t) + [P](t) (de Ecn. 27+ Ecn. 28) :
(%i1) assume(nra>0,nrb>0,E0>0); (%o1) [nra > 0, nrb > 0, E0 > 0]

(%i2) declare(E0,constant); declare(nra,constant);declare(nrb, constant);
(%o2) done |||(%o3) done |||(%o4) done
(%i5) mmodeq: 'diff(In, t)= nra*E0 - (nra+nrb)*In;
dIn
(%o5) ─── = nra E0 - (nrb + nra) In
dt
(%i6) gsolmmodeq: ode2(mmodeq, In, t);
- (- nrb - nra) t
nra E0 %e (- nrb - nra) t
(%o6)In = (────────────────────────── + %c) %e
nrb + nra
(%i9) icsolmmodeq: expand(ic1(gsolmmodeq, t=0, In=0));
(- nrb t - nra t)
nra E0 nra E0 %e
(%o9) In = ──────── ─ ────────────────────────────
nrb + nra nrb + nra
(%i10) velmmodeq: 'diff(P,t)= nrb*rhs(icsolmmodeq);
- nrb t - nra t
dP nra E0 nra E0 %e
(%o10) ── = nrb (───────── ─ ────────────────────────)
dt nrb + nra nrb + nra
(%i11) solvelmmodeq: ode2(velmmodeq, P,t);
(- nrb - nra) t
nra nrb E0 %e
nra nrb E0 t - ─────────────────────────────
- nrb - nra
(%o11) P = ──────────────────────────────────────────── + %c
nrb + nra
(%i12) icsolvelmmodeq: expand(ic1(solvelmmodeq, t=0, P=0));
- nrb t - nra t 2
nra nrb E0 %e nra nrb E0 t
(%o12) P = ──────────────────────────── + ───────────────────────
2 2 2 2
nrb + 2 nra nrb + nra nrb + 2 nra nrb + nra
2
nra nrb E0 t nra nrb E0
+ ─────────────────────────────────────────────────
2 2 2 2
nrb + 2 nra nrb + nra nrb + 2 nra nrb + nra
Figura 10. Solución de la Ecn. 26 en el programa máxima. El resultado (%o9) es equivalente a la Ecn.
27, en tanto (%o12) es equivalente a la Ecn. 28.
ab ab
[ P]t[I ]t =[ E ]0 t−[ E ]0  1−e− ab t  [ E ]0 a  1−e− ab t  , o bien,
ab ab
2
ab

[ F ]t =[ E ]0
ab
ab
t [ E ]0
a
ab 
 1−e−ab t  1− b
ab 
2
ab a  1−e− ab t 
[ F ] t=[E ] 0 t[ E ]0 2 (Ecn. 29)
ab ab
Esta expresión tiene un término lineal en t y un término exponencial decreciente. A tiempos muy
cercanos a cero, el término exponencial se acerca a cero. Por lo tanto, esta expresión describe un
comportamiento inicial de una recta que parte del origen y representa la acumulación inicial del
ab
complejo [I], es decir [ F ]t=[E ] 0 t . La recta adquiere curvatura conforme el término
ab
exponencial alcanza un valor detectable y, cuando t es grande y el término exponencial se aproxima a
2
ab a
cero (ver figura 11, pag 29), nos queda ahora una recta dada por [ F ]t =[E ] 0 t [ E ]0
ab ab2
a2
i
.El valor del corte con el eje “Y” de esta segunda fase es Y =[ E ]0 2 , que como se puede ver,
ab
es proporcional a [ E] 0 .
Aquí podemos tener dos situaciones:
(k CAT [ S̄ ]/ K M )
2
[ ̄S ]
2
a2
i) [ S ] es relativamente saturante, = = ≈1 ,
(a+b) (k CAT [ ̄S ]/ K M +k CAT ) ([ S̄ ]+ K M )
2 2 2
lo que significa i Y =[ E ]0 . En este caso deben usarse [E] muy elevadas, ya que [ S ]≈[ E 0 ] .
ii) si [ 
S ] no es saturante, la gráfica i Y vs. [ 
S ] sigue una curva de tipo sigmoidal, pero que
puede convertirse a una recta tomando  i Y como función de [ S ] .
Derive la forma de la función  i Y vs. [  S ] , demuestre que es una línea recta y determine la forma
algebraica de su pendiente y su intersección con las ordenadas en dicho regráfico.
Figura 11. Resultado de un experimento de cinética de la explosión, que permite ver la

variación en el intercepto a la ordenada (respecto de la enzima total) con la concentración
de sustrato empleada. Note que a concentraciones elevadas de sustrato este valor se
aproxima a 1. La presente estrategia se ha empleado en numerosos artículos para titular el
total de sitios activos realmente funcionales de una enzima.
Un aspecto interesante que surge de la comparación entre el análisis presentado en el ejemplo del
apartado 3 (pag 11) y este último es el hecho de que la constantes respectivas k 2 y k r no son
necesariamente equivalentes. Ello debido a que en un caso se está midiendo la liberación neta del
producto del sitio activo de la enzima, en tanto que en el segundo la medición monitorea tanto al
producto liberado como aquel que se encuentra atrapado en los complejos intermediarios EP (que
pueden ser uno o más, pero que se ven juntos). Es decir, nuestro análisis parte de una simplificación, al
aplicarla los valores de algunas constantes son aparentes y pueden incluir pasos adicionales. Dadas la
condiciones experimentales y la estrategia de monitoreo de la reacción, dichos pasos no pueden
resolverse y quedan ocultos.
Un mecanismo que contiene en realidad los pasos mínimos para la catálisis por una hidrolasa como la
mayoría de las proteasas, carbohidrolasas, fosfatasas y lipasas, asumiendo que la hidrólisis es
esencialmente irreversible en medio acuoso diluido, debería ser:
k1 S kCAT k4 k6
E E·S E·PQ E.Q E (Esquema 8)
k2 k3 P k5 Q
En el que se asume que los productos se liberan ordenadamente (lo cual es cierto para las serina
proteasas y las lipasas, pero no necesariamente para otras hidrolasas). Note entonces que en este último

análisis, la concentración de intermediario que se mide es [E.PQ]. En cambio, [E] + [E.Q] , son vistas
como “enzima libre” y [E.S] es una especie “invisible” cuyo impacto en la cinética queda oculto, dadas
las condiciones experimentales y cuya influencia está enmascarada en los valores de algunas
constantes. Es decir algunos parámentros estimados son valores aparentes, que dependen de otras
variables y que serán afectados por un cambio en las condiciones del experimento.
En cambio, en el primer análisis (ejemplo 3, apartado 3, pag 11)) los valores de k 1 y k 2 deben ser
reales, pero obs k CAT es un valor aparente que involucra tanto a k CAT , k 4 y k 6 , quizá con alguna
influencia menor de k 3 [ P ] y k 5 [Q] , en la medida en que su acumulación no resulta tan
despreciable como usualmente se asume.
Nuevamente, para conocer en detalle un mecanismo cinético es necesario recurrir a una variedad de
condiciones experimentales que permitan realizar un análisis completo de los diversos pasos de la
reacción.
En el siguiente experimento se midió la actividad de la quimotripsina con p-nitrofenilacetato, cuya
señal se detecta desde la ruptura del enlace ester en el sitio activo de la enzima, antes de la liberación
del segundo producto (que permanece unido covalentemente a la proteína), misma que es el paso lento
de la reacción y determina la rapidez neta de la catálisis.
Asuma que los parámetros cinéticos ( K M y V MAX ) determinados en el ejercicio 4 (Pag. 15) son
válidos para este sustrato (lo que no implica que las constantes de velocidad también los sean). Para
estas medidas, la cantidad de sustrato empleada fue cercana a la concentración de proteína (1:1 o 3:1),
variando entre 10 y 90 µM (0.21 a 1.89 mg/ml). Otras condiciones experimentales fueron iguales a las
del problema 1. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
[S ]0 [S ]0
=1 =3
[ E ]0 [ E ]0
[S ]0 =10 30 (µM) 50 (µM) 90 (µM) 30 (µM) 60 (µM) 150 (µM) 270 (µM)
t ΔA/ε t ΔA/ε t ΔA/ε t ΔA/ε t ΔA/ε t ΔA/ε t ΔA/ε t ΔA/ε
(ms) (µM) (ms) (µM) (ms) (µM) (ms) (µM) (ms) (µM) (ms) (µM) (ms) (µM) (ms) (µM)
2.6 0.89 1.7 4.68 1.3 9.38 1.9 34.29 2 1.93 1.1 8.65 1.1 21.44 1.1 55.23
4.4 1.44 3 7.70 2.4 15.70 2.9 43.95 3.5 3.14 2.2 14.60 2.4 34.31 1.9 71.09
6 1.86 4.3 9.86 3.6 20.12 3.9 50.68 4.9 4.03 3.3 18.60 3.1 38.31 2.9 79.89
7.3 2.19 5.5 11.55 4.7 23.38 4.8 55.65 6.1 4.72 4.4 21.42 4.6 43.43 3.9 84.55
8.6 2.48 6.6 12.89 5.7 25.94 5.8 59.46 7.3 5.29 5.4 23.46 5.4 45.11 5 87.14
9.8 2.73 7.7 14.02 6.7 27.99 6.8 62.50 8.4 5.77 6.5 25.02 6.1 46.39 6.1 88.86
10.9 2.96 8.7 14.97 7.8 29.69 7.8 65.04 9.5 6.18 7.6 26.22 7.7 48.29 7.2 90.11
12 3.16 9.7 15.81 8.7 31.13 8.8 67.19 10.6 6.55 8.6 27.18 8.5 48.99 8.4 91.32
13 3.35 10.7 16.55 9.7 32.41 9.8 68.99 11.6 6.87 9.7 27.97 9.2 49.63 9.5 92.52
14.1 3.52 11.7 17.21 10.7 33.51 10.8 70.60 12.6 7.16 10.8 28.67 10 50.23 10.6 93.73
15 3.68 12.7 17.82 11.7 34.50 11.7 72.04 13.6 7.43 11.9 29.26 11.6 51.33 11.8 94.96
16 3.82 13.7 18.36 12.7 35.39 12.7 73.30 14.6 7.67 13 29.83 12.4 51.83 12.9 96.27
17 3.96 14.6 18.86 13.6 36.20 13.7 74.45 15.6 7.90 14 30.33 13.2 52.38 14.1 97.51
17.9 4.10 15.6 19.34 14.6 36.94 14.7 75.54 16.6 8.11 15.1 30.82 14 52.87 15.2 98.87
18.8 4.22 16.5 19.77 15.5 37.63 15.7 76.53 17.5 8.31 16.2 31.27 15.6 53.85 16.3 100.2
19.7 4.34 17.5 20.18 16.5 38.27 16.7 77.43 18.5 8.49 17.3 31.71 16.4 54.37 17.5 101.5
20.6 4.46 18.4 20.56 17.5 38.87 17.7 78.28 19.4 8.67 18.4 32.15 17.2 54.86 18.6 102.9
21.5 4.57 19.3 20.91 18.4 39.43 18.7 79.08 20.4 8.84 19.5 32.58 18 55.40 19.7 104.2
22.4 4.67 20.3 21.27 19.4 39.96 19.7 79.78 21.3 9.00 20.6 32.99 19.6 56.41 20.9 105.6
23.2 4.77 21.2 21.60 20.4 40.44 20.8 80.49 22.3 9.15 21.7 33.41 20.4 56.94 22 107.0
24.1 4.87 22.1 21.91 21.3 40.92 21.8 81.16 23.2 9.30 22.8 33.81 21.2 57.43 23.1 108.4
25 4.96 23.1 22.21 22.3 41.39 22.9 81.77 24.1 9.44 23.9 34.24 22 57.95 24.3 109.7
25.8 5.05 24 22.49 23.3 41.79 23.9 82.31 25.1 9.58 24.9 34.65 23.6 59.02 25.4 111.1
26.6 5.14 24.9 22.76 24.3 42.21 25 82.89 26 9.72 26 35.07 24.4 59.53 26.5 112.4
27.5 5.22 25.9 23.03 25.3 42.59 26.1 83.41 26.9 9.85 27.1 35.48 25.2 60.06 27.7 113.8
28.3 5.31 26.8 23.28 26.3 42.97 27.1 83.84 27.9 9.98 28.2 35.90 26 60.57 28.8 115.2
29.2 5.39 28.7 23.75 28.3 43.66 28.2 84.32 28.8 10.10 29.3 36.31 28.4 62.13 30 116.5
30 5.47 30 24.06 30 44.20 30 84.95 30 10.26 30 36.57 30 63.19 30 116.6
¿cuántos sitios activos hay por molécula de quimotripsina?
¿Cuánto vale la constante de liberación de producto i.e. la tasa de catálisis neta?
¿cómo se compara este valor con la k CAT obtenida en el primer experimento?

8 El problema del mezclado.

Como se puede deducir de la discusión anterior, a pesar de que se ha realizado buena dosis de
investigación en el tema (véase por ejemplo el artículo Wong et al., 2004, Sensors and Actuators B
100:359–379), uno de las limitaciones a las que no se les ha logrado superar es la reducción de los
tiempos de mezclado. Los mejores resultados se aproximan a los 0.1 ms, pero esto depende mucho de
aspectos como la viscosidad de medio, que, en el caso de las proteínas, se eleva de manera importante.
Sin embargo, en lo que se ha avanzado substancialmente es en lo referente al volumen de la muestra
requerido para cada lectura y en el filtrado electrónico de los datos que permite mejorar la sensibilidad
a través de elevar la relación señal/ruido. Se ha logrado también avances importantes en lo referente a
la versatilidad de los equipos de “quench-flow”, ya que el control computarizado de la instrumentación
permite la manipulación de los tiempos de incubación de las mezclas previas a la extinción, ya sea
variando la rapidez del flujo, o bien recurriendo a flujos pulsados con un control muy preciso de la
demora entre el mezclado de la enzima con el sustrato y su posterior mezclado con la solución de
extinción.
Por otro lado, la reducción en el volumen de la muestra también trae asociado una limitante que, de
nuevo, tiene que ver con el mezclado. El mezclado es más eficiente cuando el flujo se vuelve
turbulento, pero la turbulencia del flujo es directamente proporcional a la velocidad, inversamente
proporcional a la viscosidad y directamente proporcional a los que se conoce como la longitud
característica del flujo, la cual es una función directa del diámetro de la tubería (para tuberías de
sección circular).
Esto significa que al disminuir el volumen de muestra es necesario reducir el diámetro de las tuberías y
esto lleva a aumentar los flujos. En consecuencia, los experimentos requieren presión, pero la presión
genera cambios en los valores de las constantes de rapidez, lo que también puede complicar el análisis
de los experimentos.
Una alternativa a estas complicaciones es el uso de los métodos de relajación. En estos métodos la
limitante es que la reacción debe ser susceptible de alcanzar una situación de equilibrio, lo cual no
siempre es posible, pero en muchos casos si lo es.
Consideremos la reacción:
k1
P +L PL (Esquema 9)
k2
El sistema parte de un condición de equilibrio hacia la condición final nueva en la que [ P] EQi = p ' ,
[ P L ] EQ =c ' y [ L] EQi =l ' . Después de un intervalo de tiempo t después del cambio de condiciones
el c ' se encuentra a una distancia del equilibrio que llamaremos x .
Así [ P]= p= p ' x , [ L]=l =l '  x y [ P L ]=c=c ' −x .
El cambio en el sistema puede describirse como:
d c '−x 
=k 1  p ' xl ' x −k 2 c '−x 
dt
que puede reordenarse en:

dc ' dx
− =k 1 p ' l ' − k 2 c ' +k 1 ( p ' +l ' ) x+k 2 x+ k 1 x 2
dt dt
Pero cuando se alcance la nueva situación de equilibrio tendrá que verificarse que:
dc '
=k 1 p ' l ' −k 2 c ' =0 , por lo que la ecuación de arriba se reduce a:
dt
−dx
= k 1 ( p ' +l ' ) x+k 2 x+k 1 x2
dt
Dado que la diferencia entre ambos equilibrios no es usualmente muy grande x , es usualmente lo
bastante pequeña para despreciar el término de segundo grado x2 .
La ecuación anterior se integra entonces para dar:
k 1 ( p ' +l ' )+k 2
x=( p− p ' )e
Podemos entonces ver que la relajación del sistema hacia el nuevo equilibrio es un decaimiento
exponencial simple con un tiempo de relajación:
1 .
τ =k 1 ( p ' +l ' )+k 2
Una gráfica del tiempo de relajación ( τ ) obtenido a diferentes concentraciones de ligando y proteína
contra la concentración de ligando más proteína libre al equilibrio ( p ' +l ' ) dará una recta cuya
pendiente es igual a la constante de segundo orden y cuyo intercepto a la ordenada es el valor de la
constante de primer orden.
Evidentemente los mecanismos en los que hay más de dos especies de proteína en equilibrio involucran
múltiples tiempos de relajación, lo cuales están usualmente acoplados. Por ejemplo en un esquema
como el que sigue:
k1 S k2
i
E E·S i
k4
E*S (Esquema 10)
k2
El análisis del experimento rinde el valor de los dos tiempos de relajación que se recuperan acoplados y
que pueden resolverse ajustando la señal a sumas de exponenciales (Naraghi, 1997), de la forma:
n
τ k −t / τ
k =1
(
S OBS (t )=∑ a k 1+ τ−τ
k
τ e−t / τ
e − τ−τ
k
k
)
en la que τ es el tiempo de relajación del equipo y del detector combinados (convolucionados).
El producto y como la suma de los tiempos de relajación estarían dados por las expresiones siguientes:

1 1 i i
τ1 + τ2 =k 2+k 1 (e EQ +s EQ )+ k 2+ k 4
1 1
( τ )( τ )=k 2 i k 4+k 1 ( i k 2+k 2 )(e EQ +s EQ )
1 2
en las que las e EQ y s EQ son las concentraciones de enzima y sustrato libres al equilibrio (final).
De estos valores el posible recalcular los valores de las constantes, en la mayoría de los casos.
Un ejemplo de este tipo de análisis se muestra en la figura 7 (pag. 19).
9 Información susceptible y refractaria a la auscultación

mediante estas metodologías.
Después de toda este análisis, cabe aún preguntarse que es lo que puedo averiguar con estas
metodología sobre una enzima (u otro catalizador) y que es lo que está fuera del alcance de estos
métodos.
Para contestar a esta pregunta consideremos lo siguiente:
En estos métodos las determinaciones consisten en cuantificar la presencia de alguna especie química
detectable. Sin embargo, hay especies químicas cuya vida media es muy corta y no presentan señales
espectroscópicas únicas que permitan diferenciarlas de otros componentes en la mezcla. En muchos
casos, puede tratarse de estados de transición o confórmeros desconocidos por no haberse aislado, i.e.
sus propiedades no nos son familiares y, por ello, no siempre es posible asociarlos a alguna señal
detectable.
A pesar de que la electrónica y la espectroscopia se han sofisticado substancialmente, las especies de
vida media muy corta suelen encontrarse en cantidades muy pequeñas, por lo que su baja concentración
puede impedir el alcanzar certidumbre cuando se intenta medirla, aún si conocemos alguna propiedad
que nos permita su detección.
Los métodos aquí estudiados muestran fenómenos en función del tiempo, pero en términos generales,
nuestros modelos asumen que los diferentes estados son en sí especies químicas definidas. En
formulaciones alternativas (como la teoría de la fluctuaciones y la teoría de las tasas de reacción) se
plantea que cada especie química es en si un conjunto confórmeros semejantes (ensambles), pero no
idénticos; o bien, que un confórmero puede atravesar por una infinidad de microestados siguiendo un
paisaje de casi infinitas trayectorias, algunas de los cuales son de menor energía por un estrecho
margen (figura 12). Así, las “barreras energéticas” que parecen existir y que representamos como
constantes de velocidad dependientes de la temperatura y la presión, son en sí una consecuencia de un
ensamble en el que sólo algunos de los individuos pueden llegar “al otro lado del camino” y todos los
demás estados deben esperar a que el azar los lleve a esos estados “privilegiados” capaces de transitar
hacia el siguiente intermediario (que a su vez es otro ensamble), o alternativamente, sólo algunos
confórmeros “aciertan” a seguir la trayectoria que finalmente conduce al siguiente intermediario, sin
desviarse en el camino. Estas formulaciones son difíciles de concebir con moléculas pequeñas, dadas
los escasos grados de libertad que se presentan cuando existes sólo unos cuantos átomos, pero son
particularmente atractivas con macromoléculas, especialmente, dado lo que hemos aprendido de la
macromoléculas con el análisis conformacional que permite la espectroscopia de resonancia magnética
nuclear.
El comportamiento predicho de las macromoléculas en tales modelos no es tan diferente al propuesto

por la teoría clásica, excepto por detalles sutiles de difícil auscultación, lo que explica que no exista
todavía un consenso en la literatura acerca del modelo que mejor describe a la naturaleza.
Dado que las metodología estudiadas en este apartado se basan en la inspección de los intermediarios a
través de técnicas que tienen a promediar las propiedades de los posibles confórmeros, estas
metodologías no permiten establecer cual de estos modelos es más cercano a la realidad ya que todos
ellos pueden ajustarse para explicar las observaciones experimentales de la cinética de estado pre-
estacionario.
estado de
alta energía
múltiples estados
de energía
intermedia
Multiples veredas
Un camino definido con tiempos de tránsito Multiples trajectorias,
de un estado a otro pero sólo una efectiva
diversos
Figura 12. Dos tipos de modelos para explicar el impedimento para que una especie
química se convierta en otra. El modelo clásico de Eyring propone un intermediario con
configuración poco favorable requiere de elevada energía en forma transitoria. En otros, la
teoría de las tasas de reacción y las teorías de las fluctuaciones proponen que las moléculas
no atraviesan por estado realmente, pero si pueden quedar temporalmente “atrapadas” en
confórmeros que no pueden convertirse directamente en productos, o bien transitar por
tiempos largos entre estados de energía intermedia sin “encontrar la ruta” hacia los
productos. En ambos casos, de la población de moléculas presente, sólo una fracción está
en posibilidad real de completar la reacción, ya sea por que tiene la energía suficiente, o
porque alcanzó el confórmero o trayectoria efectiva.
A pesar de lo anterior, la combinación de las técnicas fisicoquímicas y analíticas modernas puede

darnos información sobre la termodinámica, la química y los fenómenos cuánticos asociados a los

fenómenos químicos observados. Toda esta información en conjunto podría en el futuro ayudarnos a
resolver estas interrogantes.
Adicionalmente, el análisis de la cinética de estado pre-estacionarios es excelente para detectar
intermediarios y medir el curso temporal de reacciones fisiológicas en las que las respuestas de la
célula depende de respuestas transitorias controladas por la rapidez relativa de reacciones alternativas
que compiten por la misma posa de reactantes.
A pesar del poder de estas técnicas existen consideraciones importantes que uno debe hacer para
planear un experimento informativo:
a) ¿Las condiciones experimentales son posibles?
c) ¿El modelo matemático de la situación a inspeccionar tiene soluciones expresas? o bien, ¿Contamos
con métodos numéricos que integren el modelo de manera confiable?
b) Los métodos numéricos y el poder de las computadoras disponibles permiten extraer la información
buscada en forma fidedigna.
10 Ejemplos de la literatura que ilustran el poder de esta

estrategia.
Shore & Gutfreund (1970) Estudiaron la reacción catalizada por la alcohol deshidrogeneas hepática
(LDH). En este estudio existe la ventaja de que tanto la proteína como el nucleótido poseen señales
fluorescentes características que varían a lo largo de la reacción. Además, es posible seguir la liberación
de protones mediante el uso de indicadores de pH y se puede usar alcohol deuterado para determinar la
relevancia de la transferencia del hidruro en la reacción general.
Ellos observaron que el alcohol deuterado era oxidado con una tasa de reacción mucho más lenta y que
la liberación de protones precedía ligeramente a la reducción del nucléotido en el sitio activo de la
enzima, por lo que propusieron un mecanismo como el que sigue:
NAD+ NADH NADH
EH+ E EH + EH+ (Esquema 11)

etOH etO
Travers et al. (1979) encontraron que por debajo de 4 oC hay un cambio dramático en la energía de
activación de la reacción catalizada por la Creatina cinasa (CK).
Trabajando a estas temperaturas pudieron subdividir el transcurso inicial de la reacción catañlizada por
la CK en una fase lag, una explosión y un estado estacionario. En esta enzima el complejo ternario
(E.ATP.Creatina) está en equilibrio rápido con las especies libres y aparece un intermediario que no
contiene cretina fosfato, pero es diferente al complejo ternario.
ATP ATP ADP

k1 k3 k5
E E E EX E E (Esquema 12)
k2 k4
Cr CrP
Un éxito notable de este trabajo fue el haber podido determinar el valor de las cinco constantes de
rapidez involucradas en los pasos entre el complejo ternario y la regeneración de la enzima libre.
Otra enzima estudiada extensamente con estas técnicas es la miosin-ATPsa. Numerosos trabajos
realizados con esta enzima allanaron el camino de la interpretación de la información estructural de
esta proteína en relación con su función en la contracción muscular, todo ello, apesar de que en esa
época (70s y 80s) no se contaba con suficiente información cristalográfica de esa proteína (Greeves,
1991).
Estos métodos has sido empleados también para analizar el comportamiento de reacciones acopladas
del tipo R −Eb→ I −Ea→ P. Cuyo entendimiento facilita la interpretación de diversas vía metabólicas en
la célula, pero también es importante en el diseño de ensayos enzimáticas acoplados, procesos
industriales y otras situaciones de índole práctico.
11 Referencias:
Ballew R M, Sabelko J, Reiner C, y Gruebele M, (1996) Rev. Sci. Instrum. 67(10):3694-3699
Callender R, Dyer R B (2002) 12(5):628-633.
Danø S, Sørensen PG, & Hynne F (1999) Nature 402(6759):320-2.
Greeves (1991) Biochem. J. 274:1-14.
Halford S E, Johnson N P, and Grinstead J (1969). Biochem. J. 179: 353-365
Hammes G G, Schimmel R P (1966) J. Phys. Chem. 70(7):2319-2324
Hammes G G, Schimmel R P (1967) J. Phys. Chem 71(4):917-923
Hastings J W Mitchell G, Mattingly P H, Blinks J R van Leeuwen M (1969) Nature 222:1047-1050.
Naraghi M (1997) Cell Calcium 22(4), 255-268
Prongjit M, Sucharitakul J, Wongnate T, Haltrich D, Chaiyen P (2009) Biochemistry 48(19):4170-4180
Sadqi M,Lapidus L J, Muñoz V (2003) Proc Natl Acad Sci U S A. 14 100(21):12117-12122.
Shore & Gutfreund (1970) Biochem. 9, 4655-4659
Travers, Barman y Bertrnad (1979) Eur. J. of Biochem. 100:149-155

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Cinética enzimática avanzada Sem.

2014-2 Estado preestacionario

Material de apoyo para el módulo de CINÉTICA RÁPIDA.

Profesor del módulo: Rogelio Rodríguez Sotres

1 Diferencias conceptuales entre las condiciones de estado

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO pg. 1/37

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO pg. 3/37

2 Conceptos básicos: Equilibrio, estado estacionario, ciclos

concentración de los intermediarios inmediatos anteriores y posteriores.

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO pg. 5/37

A) Equilibrio Nivel de agua

El volumen de agua es diferente,

Figura 3. Comparación entre sistemas físicos y químicos en equilibrio (A), o en estado

Figura 4. Comportamiento clásico de un sistema enzimático simple en su aproximación al

3 Ejemplos que ilustran el poder de esta estrategia.

Ejemplo 1: Un sistema en equilibrio no equivale a reposo absoluto.

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO pg. 7/37

Ejercicio resuelto 1. Tasa de conversión en el equilibrio.

11×10−21×10−6 ± 11×10−21×10−62 −4×10−8

Ejemplo 2: Tiempo en que se requiere para que se alcance el equilibrio en

y la ecuación diferencial 5 se simplifica a:

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO pg. 9/37

Ejercicio resuelto 2. Tiempo necesario para que la concentración de P L

para llegar a 99.99% de su concentración de equilibrio.

Ejemplo 3. Aceleración de una reacción enzimática en su camino hacia el

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO pg. 11/37

que es la solución en su forma logarítmica, en su forma exponencial tendremos:

[ P]= t (Ecn. 18), que equivale a:

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO pg. 13/37

Si ahora extrapolamos la recta al las abscisas ([P]=0), nos da  k 1 [S ] K M t−1

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO pg. 15/37

4 Métodos para cuantificar los tiempos de relajación. “Stopped

Figura 5. Diseño de un equipo clásico de flujo detenido. En el esquema se muestran los

El diseño clásico de un equipo de flujo detenido se muestra en la figura 5, en ella se muestran la

Figura 6. A) Diseño de un equipo clásico de flujo extinto (QUENCHED FLOW). En el

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO pg. 17/37

Figura 7. A) Diseño esquemático de un espectroscopio de salto de temperatura basado en

5 Escalas de tiempo, resolución de los espectroscopios y

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO pg. 19/37

5. Figura 8. Diseño clásico de un equipo de salto de presión A) esquema general B)

Figura 9. Datos del problema 4 ( pag. 15) en forma gráfica. La línea

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6 Solución analítica de mecanismos cinéticos comunes y sus

k12 k23 (Esquema 5)

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7 Manipulación de la condiciones para reducir la complejidad

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(%i1) assume(nra>0,nrb>0,E0>0); (%o1) [nra > 0, nrb > 0, E0 > 0]

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO pg. 27/37

Figura 11. Resultado de un experimento de cinética de la explosión, que permite ver la

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO pg. 31/37

8 El problema del mezclado.

que puede reordenarse en:

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9 Información susceptible y refractaria a la auscultación

El comportamiento predicho de las macromoléculas en tales modelos no es tan diferente al propuesto

A pesar de lo anterior, la combinación de las técnicas fisicoquímicas y analíticas modernas puede

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO pg. 35/37

10 Ejemplos de la literatura que ilustran el poder de esta

NAD+ NADH NADH

EH+ E EH + EH+ (Esquema 11)

ATP ATP ADP

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