FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

INTRODUCCIÓN
La fermentación alcohólica es un proceso biológico de fermentación en plena ausencia de aire
(oxígeno - O2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos
de carbono (por regla general azúcares: como por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el
almidón, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya fórmula
química es: CH3-CH2-OH), dióxido de carbono (CO2) en forma de gas y unas moléculas de ATP
(Adenosín trifosfato) que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular
energético anaeróbico. El etanol resultante se emplea en la elaboración de algunas bebidas
alcohólicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, el cava, etc. Aunque en la actualidad se
empieza a sintetizar también etanol mediante la fermentación a nivel industrial a gran escala para
ser empleado como biocombustible.
La fermentación alcohólica tiene como finalidad biológica proporcionar energía anaeróbica a los
microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxígeno a partir de la glucosa. En el
proceso las levaduras obtienen energía disociando las moléculas de glucosa y generan como
desechos alcohol y dióxido de carbono CO2. Las levaduras y bacterias causantes de este fenómeno
son microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al
sabor de los productos fermentados. Una de las principales características de estos
microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de oxígeno (O2), máxime
durante la reacción química, por esta razón se dice que la fermentación alcohólica es un proceso
anaeróbico.

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA. CONCEPTO, PRINCIPIOS BIOQUÍMICOS.

La producción de bebidas alcohólicas ha sido una actividad ligada a la mayoría de las culturas
durante miles de años. Existen evidencias arqueológicas de más de 7000 años de antigüedad que
en forma empírica los humanos aprendimos a realizar fermentaciones alcohólicas de diversos
sustratos.
Probablemente las primeras bebidas se hicieron a partir de sustratos azucarados como los zumos
de frutas, ya que éstos solamente requieren poner en contacto el jugo con la levadura silvestre
presente en la superficie de la propia fruta.
Desde épocas remotas diferentes civilizaciones aprendieron a fermentar diversos sustratos a fin
de producir sus bebidas alcohólicas autóctonas, pero fue hasta el siglo XV cuando empieza a
popularizarse el arte de la destilación y de esta forma aparecen las bebidas con mayor contenido
alcohólico.
Debido a la gran importancia de estos productos la investigación científica y tecnológica generan
industrias las cuales son de mayor importancia económica en el mundo.
concepto y principios bioquímicos
Es un proceso bioquímico provocado por la acción de las levaduras y consiste en la formación de
los azúcares en etanol y dióxido de carbono que es un subproducto del proceso. Es la formación
de etanol producida por la fermentación anaerobia de la glucosa.
La fermentación alcohólica tiene como finalidad biológica proporcionar energía anaeróbica a los
microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxígeno para ello disocian las moléculas
de glucosa y obtienen la energía necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como
desechos consecuencia de la fermentación. Las levaduras y bacterias causantes de este fenómeno
son microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al
sabor de los productos fermentados.
Además de etanol y CO2, se forma también glicerina, ácido sucaníco, ácido subvolátiles,
butiliglicol, alcoholes superiores, acetaldehído, ácido láctico y esteres.

A modo resumido las reacciones de la fermentación alcohólica son las siguientes:

La fermentación alcohólica se realiza en dos etapas: el glucolisis y la fermentación propiamente

dicha.
La glucólisis es la primera etapa de la fermentación, lo mismo que en la respiración celular, y al
igual que ésta necesita de enzimas para su completo funcionamiento. Es una reacción exotérmica.
En ella una secuencia de reacciones convierte a la glucosa en piruvato con la producción de ATP
(Adenosín trifosfato, nucleótido fundamental en la obtención de energía).
C6H12O6 → 2 CH3COCOO− + 2 H2O + 2H++ ATP
La fermentación alcohólica es la segunda etapa de la fermentación, también se necesitan enzimas
para su realización, esta se produce en dos fases:
En la primera el piruvato se convierte en acetaldehído y dióxido de carbono, y en la segunda el
acetaldehído con la acción de la NADH (enzima deshidrogenasa) que se oxida (suministra
electrones) reduciendo el acetaldehído, y se convierte en alcohol etílico.

2 CH3COCOOH 2 CH3CHO + CO2

2 CH3CHO +NADH 2 C2H5OH

A modo de resumen se puede ver el esquema completo de la fermentación en la siguiente imagen.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FERMENTACIÓN.

Los factores que influyen en el crecimiento y desarrollo de las levaduras en la fermentación
alcohólica son muy complejos, ya que inciden al mismo tiempo una gran cantidad de parámetros,
que en ocasiones se potencian y en otras se anulan, siendo muy difícil predecir exactamente la
cinética de una fermentación alcohólica. Estos factores comprenden por una parte los de carácter
fisicoquímico, así como las necesidades nutritivas de las levaduras, que puede poseer
naturalmente el medio o que pueden ser añadidas para activar la fermentación, debiéndose tener
en cuenta, además, los mecanismos de inhibición de la fermentación y su posible paralización.
Factores fisicoquímicos
• Temperatura de fermentación. En las variedades tintas la Tª óptima de fermentación se da
entre los 20-30ºC, y en las blancas entre 10-15ºC, aunque en ambos casos se recomienda iniciar
la fermentación con una temperatura de 20ºC con el fin de estimular el arranque de crecimiento
de las levaduras. Estas pueden adaptarse a un amplio abanico de temperaturas con un máximo de
40ºC, a partir del cual se observa una caída de la viabilidad.
Si bien entre los 10ºC y 32ºC la velocidad de fermentación aumenta linealmente (duplicándose
cada 10ºC), eso no quiere decir que las temperaturas elevadas sean las más indicadas para llevar
a cabo la fermentación del mosto.
La toxicidad del etanol que se acumula durante la vinificación aumenta con la temperatura, y
además las temperaturas elevadas provocan la evaporación del etanol y la pérdida de compuestos
volátiles esenciales para las características organolépticas del vino.
Las temperaturas excesivamente bajas tampoco son recomendables, ya que se corre el riesgo de
parar la fermentación, al someter a las levaduras a un ambiente demasiado frío debido al efecto
que tiene la temperatura en la fluidez de la membrana.
La fermentación alcohólica es un proceso exotérmico, de manera que la temperatura tiende a
elevarse, afectada por factores como son:

• -La concentración de azúcar del mosto.

• -La temperatura inicial del mismo.
• -La velocidad de fermentación.
• -La temperatura y aireación de la bodega.
• -El diámetro y material del tanque de fermentación.
El calor se puede perder espontáneamente por difusión al medio exterior, por la evaporación del
etanol y el agua y por la liberación de CO2, por lo que es evidente que se requieren sistemas
adicionales de control de la temperatura para mantener una fermentación básicamente isotérmica.
Por estos motivos el control de la temperatura es un parámetro esencial en enología.
• Aireación. Saccharomyces es un fermentador facultativo, capaz de consumir azúcares en
ausencia de oxígeno mejor que otras levaduras no Saccharomyces. De hecho un exceso de
oxígeno puede inhibir la fermentación, esto se conoce como efecto Pasteur. No obstante, cierta
cantidad de aire es necesaria y beneficiosa para las levaduras vínicas, por la necesidad de oxígeno
para sintetizar esteroles y ácidos grasos insaturados.
En mostos con deficiencias en nitrógeno, un ambiente más oxigenado puede ser beneficioso por
permitir la metabolización del aminoácido prolina, que mejora las características del vino.
Cuando se añaden fuentes exógenas de nitrógeno se debe de hacer coincidiendo con la aireación
del mosto. Normalmente con el oxígeno captado por el mosto durante el prensado de la uva es
suficiente para la fermentación.
En vinos tintos el consumo de oxígeno como consecuencia de la oxidación de fenoles se ve
compensado con la aireación que supone el remontado. Este efecto es más beneficioso al final de
la fase exponencial del crecimiento.
Sin embargo una aireación excesiva puede llevar a una producción indeseable de acetaldehído y
ácido sulfhídrico, y a una menor producción de ésteres aromáticos, e incluso desaparecer el
alcohol y pasar a ser agua.
pH. El pH típico del mosto ronda entre 2,75 y 4,2. Estos valores no suponen ningún
problema para el crecimiento de las levaduras, y solo con valores inferiores a 2,8 pueden
existir problemas.
Los efectos positivos de este pH bajo son, el favorecimiento de la hidrólisis de disacáridos y por
tanto de la fermentación y prevención de la aparición de microorganismos alterantes. En
ocasiones se añade ácido tartárico para disminuir el pH.
Los efectos nocivos del pH bajo son que se incrementa el efecto tóxico del etanol y del sulfito y
se produce el efecto Pasteur. La tolerancia de pH ácido depende de la abundancia de iones de
potasio en el mosto.
Clarificación. La eliminación de partículas sólidas del mosto es una factor importante en
la producción del vino blanco, lo cual influye enormemente en su calidad aromática y
organoléptica.
Un exceso de partículas puede inhibir el crecimiento de Saccharomyces, ya que estas partículas
actúan como núcleos de formación de burbujas de CO2, favoreciendo la disipación del gas.
Aunque un exceso de clarificación también puede inhibir el crecimiento de la levadura debido a
la eliminación de nutrientes nitrogenados de las mismas.
Por lo tanto es necesario encontrar un punto medio en la clarificación que de un vino de más
calidad sin afectar a la fermentación.
• Presión osmótica. La presión osmótica ejercida sobre las levaduras en un medio
acuoso muy saturado, como por ejemplo un mosto concentrado, puede producir la muerte
de las células por plasmólisis o salida de agua citoplasmática a través de la membrana.
Existen algunas levaduras del género Torulopsis que soportan bien estas condiciones.
• Radiaciones luminosas. Pueden estimular la actividad de las levaduras,
aumentando la energía fermentativa ( luz roja), sin embargo las radiaciones ultravioletas
son letales para las levaduras en un corto tiempo, al igual que los ultrasonidos.
• Producción de CO2. Es uno de los productos de la fermentación alcohólica, la
liberación de este gas sirve para disipar parte del calor y producir corrientes dentro del
mosto que permiten la difusión de nutrientes, pero si se produce en exceso afecta la
viabilidad de las levaduras.
Necesidades nutritivas
El mosto contiene una cantidad suficiente de nutrientes para desarrollar la fermentación
alcohólica, pudiéndose encontrar a veces en mostos excesivamente desfangados algunas carencias
que pueden generar problemas en la misma. Los nutrientes más destacados son las sustancias
carbonadas, nitrogenadas y las minerales.
Compuestos carbonados. Los azúcares fermentables por las levaduras son la principal fuente de
alimentación carbonada, especialmente la glucosa y la fructosa como azúcares mayoritarios, estos
sirven de base para la síntesis de los compuestos que necesitan, además de proporcionar una
fuente de energía para sus funciones vitales.
Normalmente las vendimias contienen azúcares en concentraciones entre 170 y 220 g/l, que
corresponde a una producción de alcohol de 10 a 13%, pudiéndose llegar o bien de modo natural
o por sobre maduración de la uva a más de 360 g/l (ideal para vinos dulces). La cantidad de azúcar
de un mosto determina la velocidad de fermentación, así en medios pobres en azúcar, con menos
de 10 g/l la velocidad es muy lenta, aumentando progresivamente según aumenta el nivel de
azúcar hasta los 200 g/l, después de esta cantidad la velocidad decrece según aumenta la
concentración de azúcar, cesando totalmente a partir de los 600 g/l debido a la elevada presión
osmótica del medio.
Si se tiene que realizar una adición de azúcar, bien con sacarosa o mosto concentrado, se debe
realizar los primeros dos días de fermentación, cuando las levaduras se están multiplicando, para
encontrarnos a las levaduras en fase exponencial. Si se realiza una adición tardía en la fase
estacionaria o declive la fermentación no termina y el vino se queda dulce.
Compuestos nitrogenados. El mosto es muy rico en compuestos nitrogenados, repartiéndose de
la siguiente manera:

• Fracción mineral o amoniacal entre el 5 a 10 %.

• Nitrógeno aminado entre un 20 a 30 %.
• Polipéptidos entre un 30 a 40 %.
• Proteínas entre un 5 a 10 %.
La existencia de compuestos nitrogenados viene muy marcada por las condiciones agronómicas
de crecimiento de la vid, características edafológicas, fertilizaciones, podas, etc.
Las levaduras necesitan disponer de compuestos nitrogenados para sintetizar las proteínas que
precisan para su crecimiento, tomándolo de las sustancias más fácilmente asimilables como son
el ión amonio, los aminoácidos y los péptidos de bajo peso molecular.
• Compuestos minerales. Los mostos contienen cantidades suficientes de minerales para
asegurar el buen desarrollo de la fermentación alcohólica, Estos compuestos son importantes para
asegurar las funciones vitales de las levaduras.
Entre los compuestos más comunes están: P, K, Mg, Ca, S, Na, Fe, Si y Fe. Además de estos
compuestos existen otros oligoelementos que en muy pequeñas cantidades también son necesarios
para el crecimiento de las levaduras, entre ellos están, Al, Br, Cr, Ag, Mn, Sr, etc.
Activadores fermentativos
Son sustancias que se encuentran en pequeñas cantidades en el medio fermentativo, unas
procedentes de la vendimia y otras producidas por las levaduras, siendo imprescindibles en el
metabolismo de las levaduras y cuya carencia puede modificar o anular sus funciones vitales.
• Vitaminas. Las vitaminas más importantes que afectan a las levaduras son:
Biotina. También llamada vitamina H, interviene en reacciones importantes como son
descarboxilación, desaminación y síntesis nitrogenada. En caso de carencia puede disminuir la
glucolisis, el mayor consumo de esta vitamina se produce en la fase exponencial.
Piridoxina. Vitamina B6, no es una sustancia indispensable aunque su ausencia puede reducir la
glucólisis. Las levaduras como Kloeckera, Candida y Torulopsis la consumen íntegramente
durante la fermentación, la Saccharomyces no.
Tiamina. Vitamina B1, interviene en la conversión del pirúvico a acetaldehído.
Ácido pantoténico. Es uno de los factores de crecimiento más potentes, activando la glucólisis
y su carencia modifica los productos secundarios de la fermentación. Algunas levaduras del
género Saccharomyces son incapaces de sintetizar esta vitamina, por lo que el mosto deberá tener
un nivel suficiente de la misma.
Mesoinositol. Es un factor de crecimiento muy importante para algunas levaduras. Se encuentra
en cantidades suficientes en los mostos.
Nicotinamida. Vitamina PP, actúa en importantes reacciones bioquímicas. Todas las levaduras
la sintetizan
Ácido p-aminobenzoico. Es una vitamina no indispensable en la fermentación, aunque si en la
fermentación maleoláctica.
• Acetaldehído y ácido pirúvico
La adición al mosto de cantidades de estas sustancias intermedias de la fermentación, disminuye
el periodo de latencia, y aumenta considerablemente la población de las mismas acelerando el
proceso de fermentación.
• Esteroles y ácido grasos de cadena larga
Los esteroles, principalmente el ergosterol, es un elemento primordial en el crecimiento celular
Las condiciones anaerobias pueden provocar una paralización de la síntesis de esteroles, por lo
que es conveniente llevar a cabo una aireación para evitar este problema entre otros.

LEVADURAS VÍNICAS
Desde la antigüedad diferentes culturas y civilizaciones de todo el mundo han usado sin saberlo
levaduras. Lo hicieron fermentando de forma natural sus panes y bebidas alcohólicas, por lo que
se pensaba que era algo misterioso y mágico. Esta idea comenzó a cambiar gracias a la ciencia
con la intervención de Louis Pasteur, quién a mediados del siglo XIX probó que la fermentación
alcohólica era hecha por levaduras y no por un catalizador químico que era lo que se había
pensado hasta entonces. El trabajo de la levadura en este proceso es consumir azúcares para
producir dos productos importantes: CO2, que es dióxido de carbono, y etanol. Además de esto,
produce otros productos químicos en pequeñas cantidades, que es lo que le da a las diferentes
bebidas sus diferentes sabores tan peculiares dependiendo de la levadura usada.
Tradicionalmente, la producción de vinos se ha realizado a partir de fermentaciones de los mostos,
llevadas a cabo por cepas de levaduras endémicas residentes en las superficies de las uvas y de
los equipos de las bodegas, aunque se ha demostrado también que viven en asociación con la vid,
hallándose usualmente sobre la corteza, las hojas, las flores y en la pruina de la baya. Y que su
crecimiento sobre la superficie de las bayas está determinado por diversos factores ambientales,
como la temperatura y la humedad, así como por el grado de madurez y el estado de salud. La
fermentación con estas levaduras endémicas se llama fermentación espontánea y son de gran
importancia ya que con ellas consiguen características organolépticas típicas de la zona, que no
estarían presentes si se utilizara un inóculo de cepas foráneas. Sin embargo la calidad del producto
puede ser muy variable .
La actividad metabólica de los diferentes géneros y especies de levaduras presentes en la
superficie de las uvas en el viñedo, y capaces de resistir las condiciones de vinificación,
influencian la calidad sensorial del vino obtenido.
En la tabla siguiente se muestran con más detalle cuáles son las levaduras relacionadas a la uva
y el vino.

Se ha comprobado que estas especies fermentativas están asociadas con el área de la bodega y
que son incorporadas dentro del mosto durante el tratamiento mecánico de la uva y el proceso de
fermentación. La acción secuencial de estos diferentes géneros y especies de levadura,
contribuyen al aroma y sabor de los vinos, determinando la calidad de estos. El aroma y el sabor
están dados por los compuestos volátiles formados durante la fermentación incluyendo alcoholes,
ésteres, ácidos orgánicos, fenoles, tioles, monoterpenos y norisoprenoides. Entre los compuestos
volátiles derivados del metabolismo de la levadura se encuentran los ésteres, alcoholes y acetatos,
que en diferentes combinaciones afectan la calidad del vino .
Estudios en los que se han investigado cultivos iniciadores y levaduras nativas han demostrado
que existen diferencias significativas en la composición química de los vinos resultantes. Las
levaduras del mosto de uva en el inicio de la fermentación del vino se pueden dividir a grandes
rasgos en dos grupos, es decir, las levaduras Saccharomyces cerevisiae y las levaduras
noSaccharomyces. Las levaduras de Saccharomyces se derivan principalmente de los equipos de
bodega y en muy bajo número en la uva. Las levaduras no-Saccharomyces, se encuentra
predominantemente en las uvas, pero también en menor número en el equipo de bodega. Por lo
que en la trituración de la uva, y las condiciones ambientales específicas en el mosto, es decir, la
presión osmótica alta, la presencia de SO2, la temperatura y la higiene bodega, todos juegan un
papel en la determinación de las especies que pueden sobrevivir y crecer en el mosto.
Saccharomyces cerevisiae La levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo ascomiceto que
ha sido ampliamente estudiado dada su importancia en la industria panadera y vitivinícola, así
como por su capacidad de producir etanol. Filogenéticamente de las cepas de Saccharomyces
cerevisiae se ha encontrado que la especie en su conjunto consta de dos poblaciones, domésticos
y salvaje. Algunas características de esta levadura que forman parte de su adaptación son el hecho
de que pueda metabolizar la glucosa y la fructosa tanto por vía respiratoria como por vía
fermentativa, y de crecer en condiciones aerobias o anaerobias. Siendo la fórmula simple de
fermentación la siguiente:

Saccharomyces cerevisiae es la especie de levadura más importante en microbiología del vino.

Es mejor modelo industrial conocido por su miembro, la levadura S. cerevisiae, pero comprende
además ocho especies estrechamente relacionadas. La opinión común coincide en que esta especie
es un producto de la domesticación.
Tiene gran capacidad de crecer en el zumo de uva, que se caracteriza por un alto contenido de
azúcares y bajo contenido de sustancias de nitrógeno. La especie produce altas cantidades de
etanol a la vez que consume el contenido de azúcares y baja el pH que inhiben el crecimiento de
cepas no- Saccharomyces. Además de poseer el fenómeno killer, que implica la secreción, por
parte de ciertas cepas, de una proteína tóxica de baja masa molecular, llamada toxina killer, a la
cual ellas son inmunes, que mata a células sensibles, las cuales pueden ser del mismo o diferentes
géneros. Este tipo de interacciones pueden determinar la evolución de las distintas poblaciones
de levaduras durante la fermentación. En algunas ocasiones una cepa killer de Saccharomyces
cerevisiae predomina al final del proceso fermentativo, sugiriendo que la expresión de la toxina
le permitió conducir parte de la vinificación. Este fenómeno killer pueden ser un método
alternativo para el control de levaduras no deseadas.
Estas levaduras también están presentes en el envejecimiento de vinos formando una película
llamada velo de flor, por lo que se llaman levaduras flor, Su crecimiento en la superficie produce
cambios importantes en las características del vino debido a su metabolismo oxidativo.
Al seleccionar levaduras comerciales se deben tener en cuenta las propiedades de estas y las
características del vino que se quiere producir, tales como la concentración de metabolitos que
toleran o se precisan para iniciar con éxito la fermentación, o la temperatura óptima de
desarrollo: la mayoría lo hace entre 12 y 36º C; si la temperatura óptima es menor de 30º se
denominan criófilas, si se encuentra entre 25 y 35º son mesófilas, y si la temperatura a la que se
desarrolla preferentemente es mayor de 35º C se denominan termófilas.
A pesar de esto, es más efectivo el uso de cultivos puros de levaduras que procedan de la zona
vitivinícola donde se van a utilizar, lo que se conoce como levaduras locales seleccionadas, ya
que se cree que las levaduras que se encuentran en una microzona son:

• Específicas del área.

• Totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona.
• Totalmente adaptadas a la materia prima, es decir al mosto a fermentar.
• Responsables, al menos parcialmente, de las características únicas de los vinos
obtenidos.
En la siguiente tabla se observan algunas características que deben tener estas levaduras.

No- Saccharomyces
Las levaduras no- Saccharomyces en la producción de vino se han considerado principalmente
como organismos de descomposición. Los metabolitos de descomposición más importantes
producidos por estas levaduras son el ácido acético, acetaldehído, acetoína y acetato de etilo,
junto con malos olores, tales como el vinilo y etilfenoles, que están relacionados con el desarrollo
de Brettanomyces / Dekkera spp . Afirmando además, que murieron durante las etapas iniciales
de la fermentación debido a la toxicidad de la concentración de alcohol al aumentar el
metabolismo de Saccharomyces. Aunque se ha demostrado que algunas sobreviven durante la
fermentación, y que además los metabolitos formados por algunas especies no- Saccharomyces
pueden contribuir a la calidad del vino, por ejemplo la producción de glicerol por Candida stellata
y la producción de éster por Candida pulcherrima que, en algunos vinos pueden tener una
influencia positiva en la calidad del vino. Otras especies, tales como Kloeckera apiculata, se
asocian con la producción de ácido acético que puede ser perjudicial para la calidad del vino.
Algunas especies no-Saccharomyces también poseen actividad ß-Glucosidasa que pueden
hidrolizar los precursores del aroma. Por lo que la actividad inicial de las levaduras no-
Saccharomyces en el mosto de fermentación se considera importante para el perfil final de
compuestos aromáticos de los vinos, debido a que estas levaduras son responsables de diferentes
reacciones enzimáticas en el desarrollo de una amplia gama de los productos finales volátiles y
no volátiles. La producción de exo y endonucleasas por estas levaduras juega un papel muy
importante, como lo son las pectinasas que tiene algunas aplicaciones de clarificación, filtración
y también la extracción de color del vino. El uso de enzimas pectolíticas para la maceración
también puede aumentar el contenido en jugo de terpenol. Otras enzimas son las esterasas
formadoras de compuestos del aroma del vino y las lipasas que degradan los lípidos procedentes
de la uva.
La fermentación mixta se realiza usando cultivos de Saccharomyces cerevisiae y levaduras no
Saccharomyces y representa una forma viable hacia la mejora de la complejidad y la mejora de
las características particulares y específicas de los vinos. Las posibles interacciones sinérgicas
entre diferentes levaduras pueden proporcionar una herramienta para la aplicación de las nuevas
tecnologías de fermentación. Por lo tanto, el conocimiento de la interacción de estas levaduras
durante la fermentación del vino necesita ser mejorado. Se ha demostrado que cuando algunas
levaduras se desarrollan juntas en condiciones de fermentación, no lo hacen pasivamente, sino
más bien interactúan.
En la siguiente tabla se muestran algunas interacciones de las levaduras Saccharomyces y
noSaccharomyces.

La importancia de las levaduras es su acción sobre la composición y también ejercen un efecto

sobre el perfil aromático del vino. Es importante considerar también que durante la fermentación
alcohólica, la levadura produce aromas fermentativos, lo mismo que sucede cuando puede actuar
sobre el color, la textura y el perfil aromático de los vinos. Por lo que su elección en
fermentaciones inoculadas debe ser teniendo en cuenta el perfil de producto que se desea obtener.
Y en el caso de las fermentaciones espontáneas es de suma importancia conocer la diversidad de
la población de levaduras nativas en el entorno para el monitoreo de la fermentación.
Reproducción de las levaduras
Las levaduras verdaderas pueden reproducirse por esporulación, gemación o fisión.

• Gemación. Proceso asexual, en el cual la célula progenitora reparte sus

constituyentes celulares con una célula hija (sin división del núcleo); las dos células son
iguales en su madurez.

• Esporulación. Proceso de reproducción sexual; en el ciclo sexual, una célula

diploide normal (una célula con dos conjuntos de cromosomas y por consiguiente con dos
dotaciones de genes) da lugar por meiosis a dos ascas o células esporogéneas , que
contienen cuatro ascosporas haploides (más fácil: células con una sola dotación
cromosómica y de genes). Las ascosporas son de dos tipos sexuales: a y alpha. Cada tipo
puede desarrollar células haploides por gemación. La unión de una célula haploide “a”
con otra “alpha” da lugar a una célula normal diploide a/alpha. Las células haploides del
mismo sexo pueden también unirse ocasionalmente, formando células diploides
anormales (a/a o alpha/alpha) que sólo pueden reproducirse asexualmente por gemación.

Condiciones de desarrollo de las levaduras

Como todos los seres vivos, las levaduras tienen necesidades precisas en cuanto al medio en que
viven y a su nutrición. Son muy sensibles a la temperatura, necesitan oxigeno, una alimentación
apropiada en azúcares, en elementos minerales, en sustancias nitrogenadas y en factores de
crecimiento.
• Temperatura. La temperatura afecta la capacidad de desdoblar los azucares, la
reproducción y el crecimiento celular.
T. mínimas de 0.3 y 0.5°C T. máximas entre 34 y 47ºC.
• PH. Cambios en el pH son causantes de la desnaturalización de enzimas y de
problemas en el intercambio de iones en la membrana celular. En la fermentación de
levaduras los valores de pH entre 3 y 6 generalmente favorecen el crecimiento y la
actividad fermentativa.
• Aireación. Las levaduras requieren O2 para su multiplicación ya que interviene
en la síntesis de ácidos grasos y esteroles, constituyentes de la membrana celular y
responsables de su permeabilidad.
La parte más importante de la levadura es la membrana, a través de la cual se producen los
intercambios de manera activa. Las levaduras sintetizan dos sustancias: esteroles (ergosterol) y
ácidos grasos insaturados, son los llamados factores de supervivencia. Para ello es esencial la
permeabilidad de la membrana y la integridad celular, pudiendo morir por un mal funcionamiento.
Estos factores de supervivencia lo tienen de manera limitada, disminuyendo a medida que
aumenta la población. Las levaduras son capaces de fabricarlo pero para ello es imprescindible el
oxígeno
Las levaduras pueden ser:

• Aerobias ,levaduras que se desarrollan en presencia de oxigeno libre.

• Anaerobias, levaduras que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre.
• Anaerobias facultativas, levaduras que se desarrollan tanto en ausencia como en
presencia de oxigeno libre.
• Nutrición. Las levaduras fermentativas necesitan los azúcares para su catabolismo, es decir
para obtener la energía necesaria para sus procesos vitales, pero además necesitan otros substratos
para su anabolismo como son nitrógeno, fósforo, carbono, azufre, potasio, magnesio, calcio y
vitaminas, especialmente tiamina (vitamina B1). Por ello es de vital importancia que el medio
disponga de una base nutricional adecuada para poder llevar a cabo la fermentación alcohólica en
la producción de vinos.
Curva de crecimiento microbiano
El concepto asociado al crecimiento microbiano, corresponde al aumento poblacional de una
especie microbiana en un medio de cultivo provisto de todas las necesidades del microorganismo
(Cantidad de Nutrientes, Temperatura, Grado de Humedad, Gases y pH).
Las curvas de crecimiento microbiano constan de 4 etapas bien definidas, aunque el tiempo de
duración de cada una de estas etapas, puede variar según el tipo de levadura y la familia a la cual
este pertenece, entre otras características.
• Fase de Latencia. Corresponde a un período de transición para los
microorganismos cuando son transferidos a una nueva condición. En esta fase no hay
incremento en el número de células, aunque sí una gran actividad en el metabolismo.
• Fase de Crecimiento Exponencial: Período en que el crecimiento del
microorganismo ocurre de forma exponencial, es decir, cada vez que pasa un determinado
tiempo la población se duplica.
• Fase Estacionaria: Período en que ocurren las limitaciones del crecimiento, ya
sea por agotamiento de algún nutriente esencial, por acumulación de productos tóxicos o
por una combinación de las causas anteriores.

• Fase de Muerte: Luego que culmine la fase estacionaria, comienza una

progresiva disminución en el número de células viables, cuando esto ocurre se dice que
la población ha entrado en fase de muerte.
IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE LEVADURA DE INTERÉS ENOLÓGICO
Actualmente existen varios métodos de identificación de levaduras de interés enológico para
técnicas de biología molecular con resultados rápidos, fiables y económicos. Estos métodos se
basan esencialmente en el análisis directo del DNA de la levadura; las diferencias entre las
propiedades de este DNA se denominan polimorfismo.
El mayor reto al identificar cepas de levadura recae en la necesidad de diferenciar grupos y
especies que taxonómicamente están muy cerca, pero que tienen propiedades muy diferentes en
lo que respecta a sus aptitudes fermentativas y organolépticas. Además, durante las primeras fases
de la fermentación aparecen en el mosto levaduras de los géneros Kloeckera, Candida,
Rhodotorula, Pichia, Kluyveromyces o Hansenula, entre otros. La presencia de estas especies
puede dar lugar a metabolitos secundarios que modifiquen las propiedades organolépticas del
producto final, y, por tanto, es importante disponer de buenos métodos de detección para su
control. Finalmente, también es posible utilizar las técnicas de identificación molecular para el
análisis y comprobación de la estabilidad genética de las cepas de levadura, un aspecto importante
cuando se manejan grandes volúmenes de cultivo, como es el caso de los tirajes de las grandes
firmas del cava.
Determinación de especie
Taxonómicamente, las levaduras que se añaden a la harina para que «suba» (de ahí el término
levadura, del latín levare, levantar), al maltear para que dé cerveza (de aquí cerevisiae, de la
cerveza) y las que convierten el mosto en vino, pertenecen a una misma especie, Saccharomyces
cerevisiae. Asimismo, las levaduras que añadimos juntamente con el azúcar al vino para dar cava
y las que forman el velo que origina el jerez y vinos similares son de la misma especie. Lo que
ahora conocemos como género Saccharomyces ha sido subdividido y reagrupado en diversas
ocasiones desde que se definió en 1870. Hoy en día, se considera que este género tiene 10
especies, las más importante de las cuales es precisamente S. cerevisiae. A pesar de ello, dentro
de esta especie existe una gran diversidad, que obliga a subdividirla en seis grupos, sin valor
taxonómico, aunque con relevancia práctica. Estos grupos (llamados cerevisiae, ellipsoideus,
oviformis, cheresanus, diastaticus y logos) más o menos coinciden con los diferentes usos de
estas variedades. Por ahora, el sistema más fiable de clasificar las levaduras se basa en
comparaciones directas de las composiciones de los DNA de la cepa problema con una cepa
patrón, por hibridación. Se considera que dos variedades pertenecen a la misma especie cuando
sus DNA difieren en menos del 20%. Como comparación podemos pensar que diferentes
secuencias de DNA entre Homo sapiens (en humanos) y Pan troglodytes (chimpancé) son sólo
del 3 al 5%. De todas maneras, este método es muy complicado y sólo está al alcance de
laboratorios muy especializados.
Otro sistema para diferenciar entre géneros y especies distintas dentro de las levaduras del vino
es el análisis de los polimorfismos en el DNA ribosomal. Como todos los eucariotas, las levaduras
tienen un subcompartimiento del núcleo, dedicado a la síntesis y ensamblaje de los ribosomas,
que son la maquinaria transcripcional de la célula. La producción de ribosomas, que contienen un
total de 77 proteínas diferentes además de los cuatro RNA ribosomales (rRNA), ocurre en la
levadura a velocidades realmente vertiginosas: se calcula que una cepa de Saccharomyces
cerevisiae de laboratorio fabrica un máximo de cuatro ribosomas por segundo.
Identificación de subespecies y cepas
El genoma de la levadura, recientemente secuenciado en su totalidad, tiene un total de 14 Mb
(millones de pares de bases) en su dotación haploide, repartidas entre 16 cromosomas, de una
medida que oscila entre 150 y 2000 kb. La visualización de los cromosomas de una especie, que
a menudo se hace por electroforesis de campo pulsante, recibe el nombre de cariotipo (figura 2).
El cariotipo permite distinguir entre diferentes especies del género Saccharomyces y entre éste y
otros géneros. Además, y según nuestros datos, los cariotipos de poblaciones naturales de S.
cerevisiae del mosto son sorprendentemente elevados, lo que sugiere que sólo cepas muy
próximas presentan el mismo cariotipo. Hay que decir que no es un fenómeno universal: las cepas
de levadura flor, utilizadas para elaborar el vino de jerez, presentan cariotipos muy constantes. Si
nos limitamos a la levadura de la fermentación del mosto, este método permite reconocer el grado
de parentesco entre cepas procedentes de diferentes instalaciones, independientemente de su
morfología o de su comportamiento metabólico. De todas formas, el análisis cariotípico por
campo pulsante es caro, complicado y lento, difícil de adaptarse a las necesidades cotidianas de
una bodega. Sea como sea, se trata de una herramienta valiosísima, a la que volveremos a
referirnos mas adelante, cuando tratemos el tema de la inestabilidad genética.
La técnica posiblemente más sencilla y eficaz para distinguir diferentes cepas de levadura no se
basa en el análisis del DNA cromosómico, sino del DNA mitocondrial (mtDNA). La mitocondria,
la fábrica energética de los eucariotas, contiene como un relicto de su origen procariótico una
molécula de DNA circular, que en la levadura tiene unos 75 kb. Esta molécula presenta una gran
variabilidad de secuencia, lo que la convierte en un instrumento valioso para la identificación de
cepas de levadura. Además, y debido a la diferente composición en pares de bases entre el mtDNA
y el DNA genómico, es posible hacer digestiones enzimáticas que corten completamente este
último, a pesar de producir bandas de medidas discretas provinentes exclusivamente del mtDNA
(RFLP de mtDNA). Las medidas de estos fragmentos de restricción varían entre los diferentes
géneros de levaduras, entre las diferentes especies y grupos de Saccharomyces, y entre diferentes
clones de S. cerevisiae
Otras técnicas
Con el tiempo, se ha ido desarrollando una serie de técnicas de identificación de cepas de
levaduras, que o bien no se utilizan tanto como las anteriores, o todavía resultan muy complicadas
para su utilización sistemática. Aquí citaremos algunas:
Análisis de proteínas
El análisis de las proteínas de la levadura es un método mucho más sencillo que los métodos de
identificación basados en la extracción del DNA. En cambio, es mucho menos sensible a
variaciones genéticas entre cepas de levadura relativamente próximas. De todas formas, los
avances de la proteómica y la electrofóresis de dos dimensiones podría volver a poner de moda
este sistema en unos años.
Cromatografía de gases
Aunque se trate de una técnica complicada, el cromatógrafo de gases ya se ha convertido en un
instrumento relativamente habitual en los laboratorios de enología. Por eso, los intentos de
caracterizar cepas de levaduras por su perfil de ácidos grasos prometen ser muy interesantes,
aunque la estandarización de los medios de cultivo y otros parámetros son críticos a la hora de
asegurar la fiabilidad de los resultados.
RAPD
Esta PAPD (siglas que corresponden a Random Amplified Polymorphic DNA), o DNA
polimórfico de amplificación aleatoria, es una técnica de análisis del DNA genómico por medio
de PCR usando cebadores aleatorios. Tuvo una muy amplia aceptación hace algunos años, pero
es difícilmente traspasable de un laboratorio a otro, dada su baja reproducibilidad.
Análisis de elementos de DNA repetitivo
A partir de los genes de los rRNA y del mitocondrial, el genoma de levadura tiene una serie de
secuencias variables DNA (los loci ADH, MAL i SUC, las secuencias delta, o los elementos Ty
o Y’ entre otros) que presentan cambios entre diferentes cepas, ya sea dentro de la propia
secuencia, ya sea por su posición en el genoma. La posición de estas secuencias es muy variable,
y en principio sería un buen método de identificación de cepas. Los métodos de detección de estas
variaciones se basan normalmente en técnicas relativamente lentas y complicadas como la
hibridación de DNA o de nested PCR (PCR anidado), que es un técnica mucho más reproducible
que el RAPD, pero todavía relativamente complicada.
Análisis genómico
Las técnicas de biología molecular permiten observar la disposición de diversos elementos
génicos con mucha precisión. De entrada, estas técnicas son lentas, complicadas y caras, por lo
que no parecen ser las adecuadas para las necesidades industriales. No obstante, es previsible que
la situación cambie radicalmente en unos (pocos) años: el análisis genómico (los famosos chips de
DNA) pasarán a ser un protocolo rutinario en el ámbito clínico en pocos años, o quizá meses, y
el sector agroalimentario le seguirá en poco tiempo. Preparar al sector para esta revolución es un
reto que todos deberíamos proponer y compartir