Generalidades de Nutrición y

Metabolismo de los Protozoarios

Parásitos
 Nutrición
• Dependencia metabólica del hospedero
• Capacidad biosintética limitada
• Conocimiento derivado de cultivos y en pocas
especies
• Single omission tests: difícil sacar conclusiones
• Sustancias nutritivas universales: HC, aa,
vitaminas, minerales y oligoelementos. Se suman:
nucleósidos, AG, esteroles y porfirinas
 Nutrición - Mecanismos
• Difusión simple: moléculas apolares, liposolubles,
AG no disociados, drogas hidrofóbicas
• Transporte mediado: PM bajo, iones, H, Na, Cl,
aa, azúcares. No utiliza energía, cinética de
saturación y especificidad
• Transporte activo: sistemas de transporte contra
gradiente de concentración
• Endocitosis: pinocitosis y fagocitosis
 Glúcidos

• Transporte mediado en membranas celulares

• T. brucei: 2 sistemas, a) glucosa y manosa y b)
fructosa y glucosamina
• T. equiperdium: 1 sitio de hexosas y 1 de
glicerol
• E. histolytica: glucosa por 2 sitios, paso
limitante
• Plasmodium: modulación de la membrana de la
célula huésped (eritrocito) con poros.
 Caso: Metabolismo de Galactosa en
T. brucei.
• El metabolismo de la Gal es esencial
para la sobrevida de T. brucei.
• Gal está presente en cantidades
importantes en las VSG
• Los transportadores de hexosas de T.
brucei son incapaces de transportar
Gal que se obtiene por la
epimerización de la UDP-glucosa a
la UDP-galactosa por la UDP-
glucosa 4´epimerasa (galE).
 Generación de mutante condicional
para galE
• Línea celular knock-out condicional (cKO)
conteniendo una copia ectópica de galE inducible por
Tetraciclina y ambas copias alélicas del gen
reemplazadas con genes resistentes al antibiótico.
• En presencia de Tetraciclina (+Tet) las células cKO
expresan suficiente galE para crecer normalmente.
• En (–Tet) se detiene la división en 3-4 días seguida
de muerte celular.
 Efecto de la deprivación de Gal en el crecimiento
de T. brucei y contenido de nucleótidos

(A) Growth of galE-cKO with and

without Tet
(B) ratio of UDP-Gal/UDP-Glc in the
galE-cKO Tet
(C) Sugar nucleotide levels of the galE-
cKO Tet cells.

•Los niveles celulares de UDP-

galactosa caen rápidamente luego de la
deprivación de Gal llegando a niveles
indetectables a las 72 hs.
 Impacto de la deprivación de Gal
sobre las VSG

El análisis de las glicoproteínas extraídas por lectin blotting muestra que la Gal está
virtualmente ausente y que se reducen las estructuras de poli-N-acetillactosamina
 Mutante condicional null para galE
• Bajo condiciones no permisivas
que induce la deprivación de
Gal.

• Por medio de la adición de

Tetraciclina al medio se produce
la expresión de galE

• Después de 96h la división cesa

y la ME revela una morfología
alterada y aparición de vesículas
aberrantes cerca del bolsillo
flagelar.
Scanning electron microscopy of galE-cKO Tet.
Effects on cellular morphology after galactose starvation
for 0 h (A), 48 h (B), 96 h (C and D), and 144 h (E and F)
are shown. Scale bars, 2 m.
 Impacto de la deprivación de Gal
sobre las VSG

El análisis por MALDI-TOF de una

VSG (221) confirma la pérdida
completa de galactosa del ancla de
glicosilfosfatidylinositol
 Aminoácidos
• Translocación – mediada en su gran mayoría
• Endocitosis de proteínas.
• T. brucei: 4 sitios operativos
• T. cruzi: Arg altamente específico, con 3
sistemas; Thr es contra gradiente, se
intercambia con Ala
• Plasmodium: Hb es la mayor fuente de aa,
ingresa por endocitosis a través del citostoma
 Caso: la Arginina es un aa
esencial para Toxoplasma gondii
• En la mayoría de los eucariotes existen dos
genes de carbamoil fosfatasa sintetasa
(CPS), una es glutamina dependiente y se
requiere para sintetizar pirimidinas
(CPSII), la otra (CPSI) está dedicada a la
biosíntesis de Arg a partir de carbamoil
fosfato
• T. gondii carece del gen de la CPSI
• Deprivación de Arg bloquea multiplicación
en taquizoítos, lo rescata la citrulina.
Síntesis de la Arginina
Deprivación de Arg dispara transformación de
taquizoítos en bradizoítos

Verde: proteína expresada

por taquizoítos
Rojo: proteína expresada
por bradizoítos
Azul: núcleos teñidos con
DAPI

A: 48hs medio normal

B: 48hs medio sin Arg
C: 7 d sin Arg
D: 14 d sin Arg
E: Contraste de fase de D
F: Cepa PLK 4 d sin Arg
La deprivación de Arg produce
una detención del crecimiento
en taquizoítos de T. gondii que
es rescatada por citrulina pero
no por ornitina
Caso: Degradación de la Hb en
Plasmodium
 Hemoglobina
 95% de las proteínas totales de GR
 Abundante (>300 mg/ml o aprox 5
mM)
 60-80% es degradada durante el
estadio eritrocitario
 110 g (en un total de 750) se consume
en 48 hs con una parasitemia del 20%
Erythrocytic Shizogonic Cycle

• Los merozoítos interactúan con la membrana del GR e invaden

activamente la célula formando una vaculoa parasitófora

Merozoíto entrando un GR

Trofozoíto en GR
 Endocitosis del citoplasma
eritrocitario

cytostome

food vacuole

pinocytosis
(rings)
 Vacuola Digestiva
Un lisosoma especializado
ATP
Digestión de
H+
Hb (pH 5-5.4)
ADP

Camino Proteases de la vacuola citoplasma

endocítico • plasmepsinas I & II parasitario
(acid)
• falcipainas I - III (tiol)
• falcilysinas (metallo)
El clivaje inicial de las plasmepsina es
específico y desestabiliza la Hb
• Hb es clivada entre Phe-33 y
Leu-34 (cadena α)
– ‘región bisagra’
– conservada
F33/L34 – Importante para la estabilidad del
 tetrámero
• Se disocian grandes fragmentos
de globina
– Se libera el grupo Hem
• Los fragmentos de globina son
susceptibles de posterior
hidrólisis
 La digestion de Hb es un
proceso ordenado
hemoglobina
plasmepsina
• exopeptidasas
fragmentos
grandes de + heme • aa libres?
globinas
falcipaina
plasmepsina

Fragmentos medianos Fragmentos

(20 aa) falcilysina pequeños
(6-8 aa)
 El Heme libre es tóxico
• Destabiliza and lisa
membranas
• Hidrolasas liberadas al
citoplasma del parásito que
muere

Posibles Mecanismos de Detoxificación

heme  hemozoína (pigmento malárico)
• Degradación mediada por H2O2
• Degradación mediada por GSH
• heme oxygenasa (P.b. and P.k.)
Hemozoína = -Hematina

heme -hematin
-hematina forma cristales insolubles

'biocristalización' o 'biomineralización'
 Nucleótidos
• No pueden sintetizar nucleótidos de purinas (A G) de
novo
• Purinas y pirimidinas deben adquirirse en forma de
bases o nucleósidos. No tienen transportadores de
nucleótidos
• En kinetoplástidos Adenosina es fuente más
importante de síntesis de nucleótidos de purina
• Locus para transporte de nucleósidos
• Ribonucleasas y nucleotidasas de superficie
• Plasmodium: hipoxantina es fuente de purina
Vías de salvataje de purinas en
parásitos
 Lípidos
• Transportadores para AG
• Difusión pasiva para AG no disociados
• Apicomplexa: transporte a través de vacuola
parasitófora
• Apicoplasto: plástido no fotosintético encontrado
en apicomplexa adquirido por endosimbiosis
secundaria
• Síntesis de AG e isoprenoides en apicoplasto
Metabolismo del colesterol en
Toxoplasma gondii
 METABOLISMO ENERGÉTICO
EN PROTOZOARIOS PARÁSITOS
Generalidades
Objetivos del metabolismo energético

• a)   Catabolizar sustancias orgánicas y

acoplar el proceso a la conservación de
energía
• b)   Formar y degradar biomoléculas
requeridas en funciones específicas
 KINETOPLASTIDOS
• Trypanosoma brucei como modelo:
• a)     Depende únicamente de glicólisis para producir
ATP. Prefiere Glu, pero también Fru, Man y Glicerol
• b)    Mitocondria escasamente desarrollada sin Krebs
ni CR
• c)     Abundantes enzimas glicolíticas: 90% del
glicosoma
• d)    Flujo glicolítico es relativamente alto
• e)     Enzimas glicosómicas no glicolíticas deprimidas
 Glicólisis
• Glicosomas: Característicos de Tripanosomatidos. 0.3um, 4% del volumen celular. T.
brucei=200.

• Glicólisis: De Glu a 3fosfoglicerato en glicosomas.

Citoplasma: de 3GP a 3PEP – Piruvato. Termina en Piruvato (98%) y trazas de CO2 y
Glicerol- Fermentación G3P pasa los equivalentes reductores a través de una oxidasa al O 2
dentro de la mitocondria

• Alta eficiencia. Sobrevive aún en condiciones anaeróbicas a razón de 1ATP por 1Glucosa.
• Enzimas: sectores de carga + para ingresar al glicosoma.

• Formas procíclicas en vector: Cambio a metabolismo más mitocondrial, aumenta volumen

mitocondrial, cristas desarrolladas. CR respiratoria convencional. PRO: metabolizada en
CO2, ALA y ASP
 
 Glicólisis y glicosomas

•
 Amebas Intestinales y Giardia
• Glicólisis via Embden-Meyerhof pero sin lactato
deshidrogenasa. Piruvato se convierte en etanol y
CO2 en anaerobiosis, en aerobiosis acetato y etanol
• Amitocondriados, por tanto sin Ciclo de Krebs ni
fosforilación oxidativa
• Sin citocromos
• Almacenan glucógeno
• Toleran bajas concentraciones de oxígeno
Figure 2   Nucleoside phosphate and pyrophosphate metabolism in the glycolytic pathway of the eukaryotic
anaerobic amoeba, Entamoeba histolytica. (A) The glycolytic pathway of E. histolytica. (B) PPDK uses PEP and PPi to
catalyze the conversion of AMP to ATP (i.e., the production of two high-energy phosphoanhydride bonds equals two
"ATP equivalents"). (C) The ATP and PPi "balance sheet" for E. histolytica glycolysis. Abbreviations are as follows: 1,3-
DPGA, 1,3-diphosphoglycerate; Fru-1,6-P2, fructose-1,6-bisphosphate; Fru-6-P, fructose-6-phosphate; Glu-6-P; glucose-
6-phosphate; 3-PGA, 3-phosphoglycerate; PEP, phosphoenolpyruvate; PPDK, pyruvate orthophosphate dikinase; and PPi-
PFK, PPi-dependent phosphofructokinase
Enzimas glicolíticas de Entamoeba
histolytica
 Trichomonas
• Glicólisis clásica hasta piruvato que se convierte
en lactato y éste en acetato, CO2 y H2O
• La oxidación del piruvato se cataliza por
decarboxilación oxidatica en reacciones ligadas a
Ferredoxina, proteina sulfurada con Fe como
transportador de electrones
• La reacción se produce en los hidrogenosomas
donde el H+ es el aceptor final de los electrones
 Hidrogenosoma

• Generación de ATP por compartimentalización del metabolismo

fermentativo del piruvato con producción de Hidrógeno molecular
• 1. Piruvato (de la glicólisis o por conversión del malato) es
descarboxilado por la piruvato:ferredoxina oxidorreductasa para
formar AcetilCoA
• 2. Los e- son transferidos desde la oxidorreductasa hasta la
ferredoxina (Fe-S) y luego a protones para formar H2 catalizdo
por la hidrogenasa.
• 3. Acetil-CoA es convertida a acetato con la conversión
concomitante de succinato a Succinil-CoA por la succinil-CoA
sintetasa.
• 4. La generación de succinyl-CoA está acoplada a la producción
de ATP via fosforilación a nivel de substrato
 CO2
hsp70
ME Protein
Pyruvate Malate cpn60 import
Transit
NAD(P)H NAD(P)+ peptides AAC
ATP
N ADP
NAD(P)-FO
[Fe]Hyd
H2
2Fd
2Fd-
2H+
ASCT
Acetyl-CoA Acetate
PFO

Succinate Succinyl-CoA
CO2
CoASH Double
STK
membrane
Fungi and Trichomonas
ATP ADP + Pi
Enzyme found also in mitochondria
Alpha-proteobacterial ancestry
Schematic Map of Hydrogenosomes
Unknown ancestry (after Muller 1993)