Ensayo de inhibición del

crecimiento en Lemna spp

Kenny Guevara
Aura Rodríguez
Alexandra Jiménez
OECD Guideline
221
Lemna sp. Growth
Inhibition Test

2
 Sustrato Biológico
Sustrato
• Lemna minor
• Lemna gibba

Obtención
• Banco de cultivo
• Laboratorio
• Campo

Requisitos en la obtención.
• Se pondrá en el mismo medio que se usará para la pruebas un mínimo de 8 semanas
• Libre de fuentes obvias de contaminación

3
 Sustrato biológico
_________________________________
- La fuente del material vegetal,
Colonias Sanas las especies y
L. minor 2-5 frondas. clones deben especificarse.
______________________________
L. Gibba hasta 7 frondas. - Usar los cultivos que visiblemente se 
encuentran libres de contaminación 
por otros organismos como algas o p
rotozoos.

4

-Plantas Jóvenes sin lesiones
visibles o decoloración (clorosis)
-Buena Calidad: Colonias que
comprenden al menos dos frondas.
Sustrato biológico
Frondas individuales, indicativo de:
-Estrés ambiental
-Limitación de nutrientes

5
 Unidad Experimental

Preparación: Al menos 7 días antes de la prueba:

- Transfiere las colonias del sustrato biológico a un medio estéril
fresco.
- Cultivan de 7-10 días en las condiciones de la prueba
- Considerar cuidadosamente la inclusión de un Tampón de pH

6
 Unidad experimental

Lemna minor Lemna gibba

Tampón: MOPS NaHCO3
Ácido 4- Bicarbonato de Sodio
morfolinapropanosulfónico

7
 Unidad experimental

Se recomienda una Se recomienda el medio de

modificación del medio de crecimiento 20X-APP Para L.
crecimiento estándar de Suecia gibba.
(SIS) Swedish Standard para
Lemna minor
Anexo 4
Anexo 4 5 soluciones
7 Soluciones El pH se ajusta a 7.5 ± 0.1 con
Nutrientes, Buffer. HCL o NaOH 0.1 o 1 M
8
 Selección del grupo de control

GRUPO
CONTROL O
BLANCO

Debería haber al menos 5

concentraciones de pruebas
dispuestas en una serie
geométrica.

9
 Selección del grupo de control
Para establecer rango
de [ ] de prueba:
Valor de la ECx para
asegurar un nivel Número de
apropiado de frondas y
confianza colonias
Estimación del Condiciones
LOEC/NOEC ambientales

Sino requiere NOEC , el

diseño de la prueba
puede modificarse 10
 Selección del grupo de control
Para el uso de solventes o
dispersantes auxiliares:

Tratamiento de
control adicional

El N° de recipientes
En la misma [ ] en de control replicados
los recipientes y las debe ser al menos
sustancias igual, e idealmente
doble
11
 Exposición
N° de frondas y
colonias deben ser
Colonias de 2-4 él mismo en el Detectar diferencias
frondas se recipiente en el crecimiento 4 a
transfieren del 7% de la inhibición
cultivo al inoculo. Cada recipiente debe calculada
contener un total de
9-12 frondas
Se asignan 3 réplicas por
aleatoriamente a tratamiento,
los vasos de contenidos de 9-12
prueba frondas
12
 Vías de exposición
No se contempla el escenario
de exposición a través de una
Dos ocasiones aplicación foliar
durante la prueba
Diseño aleatorio (día 3 y 5)
para ubicación de A mayor frecuencia para
los vasos de prueba mantener mayor [] casi
en la incubadora constante de alta
inestabilidad o volátil
Se recomienda régimen de
prueba semiestatico La frecuencia de
Minimizar la influencia
de las diferencias exposición depende de
espaciales, en la luz o la la estabilidad de la
T° sustancia
13
 Condiciones de Incubación
3
1 Iluminacion El pH del medio de control no
fluorescente blanca debe aumentar más de 1,5
(Intensidad de luz: unidades
85-135 μE m−2 s−1)
Duracion: 7 días Se necesita cuidado
2 Método de especial en caso de
detección y probar sustancias
medición de luz inestables o metales
4
T° de los recipientes de
Sensores Sensores de prueba debe ser de 24 +/- 2 °C
esfericos “coseno”
14
 Biomarcador de toxicidad
Determinación de
cantidad de frondos Se debe tener en ● Tamaño de la fronda
cuenta: ● Apariencia
que aparecen normal ● Indicación de
y anormal necrosis, clorosis o
gibbosidad
▸ Cambios en ● Ruptura de colonias
● Pérdida de
planta: flotabilidad
Al comienzo de la ● Longitud y apariencia
prueba y cada 3 días ● Presencia
de la raíz
durante el periodo de material no ▸ Características
exposición disuelto de la prueba
● Crecimiento de
algas en el
recipiente

15
 Biomarcador de toxicidad
Variables de medicion:

Área Total de la Fronda Peso Seco Peso Fresco

Capturar una silueta del Se recogen todas las Las colonias se transfieren a
recipiente de prueba y colonias de cada uno de poliestireno previamente
las plantas usando los recipientes de pesado, tubos con pequeños
cámara, digitalizar la prueba y se enjuagan agujeros (1 mm) en los
imagen y por con agua destilada, se fondos redondeados. Los
calibración con formas secan para eliminar el tubos se centrifugan a 300
planas de áreas exceso de agua y se a rpm en 10 min a T° amb.
conocidas, se determina 60°C  a un peso
el área constante.

16
 Frecuencia de mediciones y
determinaciones analíticas
pH
• Estática: Se mide a
Temperatura
principio y final de la
prueba Se mide en un recipiente
• Semiestatica: Se mide sustituto mantenido bajo Concentración
en cada lote de las mismas condiciones
solución en el crecimiento Se realizan a intervalos
apropiados:
• Estática: Se mide al
principio y final de la prueba
• Semiestatica: Se miden
Intensidad de Luz todas las soluciones de
prueba recién preparadas
Se mide en la cámara de
crecimiento, incubadora o
habitación en puntos
iguales de distancia
17
 Prueba de limite
Cuando la prueba preliminar indica que la
sustancia de prueba no tiene efectos tóxicos
Prueba de limite que indica de al menos [ 100 mg/L] o hasta su limite de
una comparación de solubilidad en el medio de prueba
respuesta en un control.

El numero de replicas de
tratamiento debe
duplicarse

El crecimiento se analiza
con pruebas estadísticas T-Student

18
 Doblaje de tiempo

Tiempo de duplicación (Td) del

numero de fronda
 
𝐿𝑛 2
𝑇𝑑 =
Los datos se obtienen de los 𝜇
recipientes de control

µ = Tasa de crecimiento especifica

promedio determinada

19
 Variables de respuestas
Tasa de crecimiento específico promedio ErCx
µ = Tasa de crecimiento de i a j
Aumento logarítmico en las variables de   i= inicio de prueba
crecimiento, numero de fronda y las otras
variables (área total de la fronda, peso seco, µ i-j
j= final de la prueba
N= medición en el recipiente de
prueba o control
peso fresco) t=Periodo de tiempo

Se calcula para cada [ ] de El porcentaje de inhibición de la

prueba y de control, junto con tasa de crecimiento:
estimaciones de varianza

   %
Se evalúa la tasa de crecimiento % = valor medio para en el control
valor medio para en el tratamiento
sección por sección, para evaluar
efectos de la prueba
20
 Variables de respuestas
Rendimiento EyCx

Se calcula sobre la base de cambios en las

variables de crecimiento, numero de fronda y
 
las otras variables (área total de la fronda, %
peso seco, peso fresco)

La biomasa inicial se determina en %

base de una muestra de frondas
 Bc= biomasa final-biomasa inicial para grupo control
Br= biomasa final-biomasa inicial para grupo tratamiento
tomadas del mismo lote

El porcentaje de inhibición en el
rendimiento:
21
 Trazado de Curvas
Concentración/Respuesta

Curvas de concentración Crecimiento

• Grafica los porcentajes de los parámetros de

crecimiento Ir, Ib, Ia VS concentración de la
sustancia.
• Siendo:
-Ir= Inhibición porcentual de la tasa de crecimiento.
-Ib= Reducción porcentual de la biomasa.
-Ia= Inhibición porcentual de área bajo la curva.
22
 Determinación LOEC/NOEC
• ANOVA
- Calcular la tasa de crecimiento
específica promedio
- Área bajo la curva
- La biomasa final
- Desviación estándar residual
combinada entre las réplicas
para cada concentración de
prueba.
• Comparación con la media de
control (Todos los controles
agrupados)
• Métodos de comparación
múltiple
• Pruebas de Dunnett
• Williams entre otros.
• Prueba de normalidad de los
Datos.
23
 Estimación ECx

- Estimaciones de ECx - Se puede obtener mediante:

(EC50) deben basarse en - Análisis de regresión no lineal de la
el numero de frondas y curva de concentración respuesta
al menos otro parámetro utilizando una función matemática
de crecimiento (Peso apropiada*
seco final, peso fresco o
área total de la fronda) - Curva logística.
- La normal acumulativa modelo.
- Interpolación lineal con bootstrapping

24
Los modelos suponen que 0% de
inhibición corresponde con el
valor de una réplica igual a la
media de control. • Hormesis (Relación dosis
respuesta)

Incluir valores negativos puede

distorsionar los resultados para
los modelos. 

25
 Informes

Condiciones de prueba:
Sustancia de prueba: • Procedimiento utilizado
• Fecha de inicio de la prueba y duración
• Naturaleza física • Medio de prueba
• Identificación química • Descripción del diseño experimental
• [ ] de prueba y N° de repeticiones
• Método de preparación
• T° de la prueba
• Fuente de luz, intensidad y
homogeneidad
• Valores de pH de medios
Especie de prueba: • [ ] de sustancias de prueba
• Método para determinar en N° de frondas
• Nombre científico y otras variables
• Fuente • Desviaciones de la directriz

26
Artículo científico

27
 Introducción

0.03 a 2.1 μg / L 450 μg / L

OMS  1200 μg / L 4.5 × 109  años

5 μg / L 99.27%

Sustrato biológico

Planta vascular fácil de cultivar y manejar.

Relativamente sensible a diferentes tóxicos.

CE50 de 7,0 ± 0,4 mg / L 

28
 Materiales y métodos

Cultivo de plantas

University College Cork, Irlanda

Se cultivaron
Se subcultivarón
● Asépticamente en erlenmeyers de vidrio de 250
● Cada 10-12 días
ml
● Transfiriendo tres plantas a
● Medio Hütner de resistencia media
100 ml de medio de
● Bajo luz continua
crecimiento fresco.
● 24 ± 0,5 ° C.

29
 Materiales y métodos

Diferentes medios de cultivo utilizados

en la prueba de inhibición de siete días.

● Maximiza crecimiento L . menor ,

limitando la precipitación de U
● Favoreciendo la presencia de posibles
especies clave de U como el uranilo

30
 Materiales y métodos

Modelado de especiación de uranio

Para todos los cálculos, la temperatura se fijó a 25 ° C y se habilitaron las

simulaciones redox, mientras que la precipitación se deshabilitó.

31
 Materiales y métodos

Las plantas se eligieron al azar Tres plantas (9 a 12 frondas) se

de una mezcla de al menos transfirieron a macetas de
cuatro macetas de plantas pre- policarbonato con 100 ml de
cultivadas. medio

Se agregó una regla flotante Se cubrieron con una placa de

esterilizada en superficie de 1 Petri de plástico de 9 cm y los
cm para la calibración de las experimentos se realizaron
imágenes. durante 7 días.

Se prepararon al menos 6 macetas replicadas para cada condición 32

 Materiales y métodos
Crecimiento de la planta

El tiempo de duplicación promedio, Td , se determinó  

La tasa de crecimiento relativa promedio se estimó 

Donde: 
μ i - j : tasa de crecimiento específico promedio desde el punto de tiempo i a Donde:
j; 
μ 7 - 0 es la media de crecimiento específico durante todo el
N i y N j : el número de frondas, área de frondas, FW o DW observadas en el
período de prueba en una prueba de 7 días.
recipiente de prueba o control en el momento i o j, respectivamente 
t i y t j : el punto de tiempo del inicio (i) o el final del periodo (j).

Según OCDE, Td debe ser inferior a 2.5 días (60 h)

para que la prueba sea válida.
33
 Materiales y métodos
Prueba de toxicidad de uranio

Prueba piloto: 100 mL y tres plantas (9-12 frondas)

La toxicidad de diferentes concentraciones de U (0.5–50 μM) se evaluó como inhibición

del crecimiento basada en un punto final (área fronda) en algunos medios.

● SFW a un nivel de fosfato de 0.07 mg / L - pH 6.5

● mSIS a 3.35 mg / L PO 4 - pH 6.5 y una concentración de CO 3 de 20 mg / L
● K a 0.5 mg / L PO 4 - pH 5 con o sin 5 mM de ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico
(MES).

34
 Materiales y métodos
Prueba de toxicidad de uranio

La toxicidad de uranio se evaluó más detalladamente estableciendo una curva de respuesta a la

dosis completa para la toxicidad de U en medio K con una baja concentración de fosfato (0.5
mg / L) y a pH 5

No influye en la
MES​​ 5,5 a 6,7 absorción de U

El uranio se administró UO2(NO3 )2 6H2O 0 a 150 μM U

35
 Materiales y métodos
Prueba de toxicidad de uranio

El porcentaje de inhibición del crecimiento se calculó para cada concentración de prueba

Donde
% Ir es el porcentaje de inhibición en la tasa de crecimiento específica promedio
μc y μt son los valores medios para la tasa de crecimiento específica promedio para
muestras de control y tratadas, respectivamente.

36
 Resultados

Crecimiento de L. minor en diferentes

medios nutrientes seleccionados

37
 Resultados
Solubilidad de uranio y especiación de uranio modelado en diferentes medios nutrientes .

38
Resultados

39
 Resultados

Toxicidad de uranio medida en

diferentes puntos finales
relacionados con el
crecimiento

40
 Resultados
Toxicidad de uranio medida en diferentes puntos finales
relacionados con el crecimiento

41
¡Gracias!
 Referencias

● Horemans, N., Van Hees, M., Saenen, E., Van Hoeck, A., Smolders, V.,
Blust, R., & Vandenhove, H. (2016). Influence of nutrient medium
composition on uranium toxicity and choice of the most sensitive
growth related endpoint in Lemna minor. Journal of environmental
radioactivity, 151, 427-437.
● Merc (Sf) Recuperado
de https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/mops209261132
61211?lang=en&region=CO
● OECD GUIDELINES FOR THE TESTING OF CHEMICALS (2002) recuperado
de: http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/1948054.pdf

43