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12 IDENTIFICACIN MICROBIANA

TEMA 12 IDENTIFICACIN MICROBIANA. Identificacin microbiana mediante mtodos basados en sistema de utilizacin de sustratos, inmunoensayos y deteccin molecular. OBJETIVOS ESPECIFICOS Al finalizar el estudiante podr: 1. Discutir la importancia de la identificacin microbiana dentro del campo del ejercicio profesional farmacutico. 2. Enumerar los mtodos utilizados para la identificacin microbiana. 3. Discutir la importancia y dar ejemplos de las pruebas de utilizacin de sustratos y diagramas de flujo utilizados en la identificacin de bacterias y hongos. 4. Utilizando el sistema anterior, citar algunos ejemplos de microorganismos indicadores de la calidad microbiolgica de productos farmacuticos y cosmticos. 5. Discutir la importancia y dar ejemplos de sistemas miniaturizados utilizados en la identificacin microbiana. 6. Discutir la aplicacin de los principales mtodos serolgicos utilizados en la identificacin microbiana. 7. Discutir el fundamento y aplicacin de mtodos de deteccin molecular utilizados en la identificacin microbiana. PCR. Sondas de ADN. 8. Citar ejemplos de microorganismos que pueden identificarse por los mtodos discutidos en los objetivos 6 y 7.

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Se entiende por identificacin microbiana al conjunto de tcnicas y procedimientos que se aplican para establecer la identidad de un microorganismo. Estas tcnicas se utilizan en diferentes reas, por ejemplo: En el rea clnica donde es de capital importancia conocer cul es el agente causal de la infeccin que presenta un paciente, de manera de poder tratarlo con agentes teraputicos. En la industria farmacutica, cosmtica y de alimentos donde las normas de control de calidad exigen la ausencia de ciertos microorganismos. En investigacin bsica donde se asla un determinado microorganismo que debe identificarse para comprobar si se trata de un microorganismo conocido o de uno nuevo para poder clasificarlo.

Durante su ejercicio profesional, es muy importante que el farmacutico conozca el fundamento de los mtodos existentes para la identificacin microbiana. En el caso del ejercicio comunitario, un farmacutico, por ejemplo puede estar asesorando a un paciente que tiene una infeccin bacteriana, y al cual el mdico le tom una muestra para ser enviada al laboratorio para identificar el agente causal, si el profesional conoce el fundamento y los mtodos de identificacin microbiana puede explicarle al paciente la razn por la cual los resultados de la identificacin del microorganismo y su antibiograma puede retrasarse algunos das. Si se desempea en el rea de produccin de medicamentos y cosmticos, la fabricacin de stos debe realizarse en reas controladas libres de microorganismos, para evitar la contaminacin del producto, y como consecuencia de ello, se produzca su deterioro, o lo que es ms grave que el producto contaminado le cause una infeccin a un paciente. En el caso que el profesional se desempee en la industria de medicamentos y/o cosmticos, debe conocer las normas que rigen la calidad microbiolgica del producto a ser elaborado, los microorganismos objetables y el fundamento de los mtodos oficiales para descartar la presencia de stos. Tambin en el caso de la industria alimentaria, los alimentos son sometidos a una serie de controles microbiolgicos para asegurar la ausencia de microorganismos que pueden causar enfermedades y/o descartar la presencia de toxinas capaces de causar intoxicaciones alimentarias. Por estas razones, es importante conocer los mtodos en los cuales se basa la identificacin microbiana. No todos los microorganismos se identifican por las mismas tcnicas. La mayor parte de los mtodos se realizan en un laboratorio y se busca utilizar el menor nmero de procedimientos y ensayos posibles. CLASIFICACIN DE LOS MTODOS DE IDENTIFICACIN MICROBIANA Los mtodos ms utilizados para la identificacin microbiana, los podemos clasificar en: 1. Mtodos basados en criterios morfolgicos 2. Mtodos basados en tincin diferencial 3. Mtodos basados en pruebas bioqumicas 4. Mtodos basados en tipificacin con fagos 5. Mtodos basados en pruebas serolgicas 6. Mtodos basados en deteccin molecular

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En la mayora de los casos la identificacin no se realiza con base a un solo mtodo, sino a la combinacin de ms de uno. Ejemplo: identificacin de bacterias con base a criterios morfolgicos, tincin diferencial, pruebas bioqumicas y serolgicas. Antes de proceder a discutir los mtodos que se han enumerado, es importante hacer nfasis que para cada uno de ellos se requiere disponer de una muestra. Cuando se requiere identificar un agente que est causando una determinada patologa, la muestra debe proceder del sitio donde el microorganismo est causando el dao, o donde se multiplica. Algunos ejemplos de muestras que se utilizan en microbiologa clnica tenemos: heces, orina, hisopado farngeo, lquido cefalorraqudeo, sangre, lgrimas, semen, fluido vaginal, etc. Tambin pueden utilizarse tejidos. Para aplicar algunos mtodos se requiere aislar en forma pura el microorganismo de la muestra, pero para otros no se requiere realizar dicho aislamiento. Con fines de control de calidad de medicamentos, cosmticos y alimentos, la muestra a ser analizada, puede ser un producto en proceso o terminado. 1. Mtodos basados en criterios morfolgicos Los rasgos morfolgicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas por muchos aos a clasificar organismos. Los organismos superiores tienen rasgos anatmicos tan diferentes que pueden ser fcilmente utilizados en su clasificacin, pero con respecto a los microorganismos, stos lucen bajo el microcoscopio tan similares que se dificulta su clasificacin. Es decir, que estos microorganismos que se ven tan parecidos bajo un microscopio, pueden diferir en propiedades bioqumicas, fisiolgicas y/o serolgicas. Sin embargo, aun cuando la morfologa celular dice poco sobre las relaciones filogenticas, sigue siendo til para la identificacin bacteriana. Por ejemplo: la presencia de endosporas y su localizacin resulta de mucha utilidad en la identificacin de bacilos esporulados. 2. Mtodos basados en tincin diferencial Es posible sacar conclusiones en relacin con la morfologa de una bacteria, examinando una lmina que fue sometida a un proceso de tincin diferencial. Estos criterios morfolgicos encabezan las primeras etapas del proceso de identificacin bacteriana. La mayor parte de las bacterias, teidas con Gram, las podemos clasificar como gram positivas o gram negativas, otras tinciones diferenciales, como la cido resistente, se aplican a otro tipo de bacterias, como por ejemplo micobacterias. Un examen microscpico de una lmina teida por medio de gram o de una tincin diferencial es til para obtener una informacin rpida sobre la calidad de un ambiente clnico. Por otro lado, un mdico tambin puede obtener suficiente informacin de un reporte tcnico de laboratorio para comenzar el tratamiento apropiado de un paciente.

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3. 4. Mtodos basados en pruebas bioqumicas Las pruebas bioqumicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azcares, la presencia de enzimas, la degradacin de compuestos, la produccin de compuestos coloreados, etc. Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden separarse en dos especies diferentes con base a pruebas bioqumicas. Por ejemplo, las bacterias entricas gram negativas, forman un grupo muy grande y heterogneo cuyo hbitat natural es el tracto gastrointestinal de humanos y otros animales. Esta familia, Enterobacteriaceae, incluye a varios patgenos que causan sndromes diarreicos. Un gran nmero de ensayos han sido desarrollados de manera de identificar rpidamente al patgeno, para que posteriormente el mdico, con base al reporte, indique el tratamiento adecuado, o para que los epidemilogos puedan localizar la fuente de la infeccin. Existen flujogramas, como el que se describe a continuacin para la identificacin bacteriana, mediante pruebas bioqumicas de microorganismos. Por ejemplo, la presencia de un coco bacilo gram negativo, facultativo, fermentador de glucosa, oxidasa negativo, nos indica la presencia de una enterobacteria, para determinar su gnero podemos seguir el siguiente esquema.
Fermenta la Lactosa? No Si

Pueden utilizar cido ctrico como nica fuente de carbono?

Pueden utilizar cido ctrico como nica fuente de carbono?

No

Si

No

Si

Shigella: produce lisina Decarboxilasa

Salmonella: Generalmente produce H2S

Escherichia

Produce acetona?

No Citrobacter

Si Enterobacter

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Los gneros clnicamente ms importantes de la familia Enterobacteriaceae son: Escherichia, Salmonella, Shigella, Citrobacter y Enterobacter. El gnero Escherichia, Enterobacter y Citrobacter fermentan la lactosa con produccin de cido y gas, a diferencia de los gneros Salmonella y Shigella que no fermentan la lactosa. Por otra parte, los medicamentos no estriles y/o productos cosmticos deben estar exentos de microorganismos patgenos tales como: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella spp. Staphylococcus aureus. Estos productos deben ser controlados para verificar la ausencia de estos microorganismos. En la USP se describen los procedimientos a seguir para la identificacin de estas bacterias, que se resumen en procedimientos de enriquecimiento, aislamiento y pruebas bioqumicas para su identificacin final. El tiempo necesario para la identificacin de bacterias puede reducirse considerablemente con el uso de sistemas miniaturizados basados en pruebas bioqumicas. Estas herramientas que permiten reducir el tiempo del reporte, en primer lugar fueron elaborados para bacterias de importancia mdica, tales como las enterobacterias. Estos sistemas han sido diseados para realizar varias pruebas bioqumicas simultneamente y permitir la identificacin en un tiempo ms corto. Cada uno de los ensayos, consta de tubos miniaturizados que contienen el medio de cultivo que se hidratan al inocularlos con la suspensin bacteriana pura. Las pruebas se clasifican en grupos; a cada uno de resultados positivos de los ensayos de se le asigna un determinado valor numrico, obtenindose un cdigo que corresponder a un determinado gnero o especie en un texto de la base de datos.

Con fines de control microbiolgico, la USP indica cuales son las pruebas bioqumicas mnimas que se requieren para la identificacin de los microorganismos objetables, pero no descarta que se utilicen sistemas miniaturizados donde se realizan un nmero mayor de pruebas bioqumicas. Existen muchas casas comerciales que producen sistemas miniaturizados para diferentes tipos de microorganismos adems de las enterobacterias. Cada casa fabricante tiene su propia presentacin, clculos, manuales, etc. Una limitacin de este tipo de mtodo de identificacin es la aparicin de cepas mutantes y la adquisicin de plasmidios que pueden dar origen a cepas con caractersticas diferentes. Este tipo de mtodo de identificacin tambin ha sido desarrollado para la identificacin de levaduras y de otros hongos.

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4. Mtodos basados en tipificacin con fagos La interaccin entre un virus bacteriano (fago) y su clula bacteriana sensible es sumamente especfica, ya que el proceso de adsorcin se encuentra mediado por receptores especficos tanto en el virus como en la clula bacteriana. A una placa con medio de cultivo slido inoculado con un cultivo puro de una determinada bacteria, se le aade una alcuota de un fago especfico; ste puede ocasionar la lisis de las bacterias, hecho que se evidencia en el cultivo como zonas claras definidas, denominadas placas, que indican que hubo infeccin y lisis celular. El uso de fagos especficos permite identificar y subclasificar bacterias dentro de una misma especie.

5. Mtodos basados en ensayos serolgicos Los mtodos serolgicos, implican la utilizacin de preparaciones de inmunoglobulinas especficas provenientes del suero o de un reactivo, y que pueden ser de gran utilidad en la identificacin microbiana en muestras puras o en muestras biolgicas. Cada uno de los mtodos tiene su fundamento particular, pero en lneas generales, todos se basan en la reaccin de un antgeno presente en el agente microbiano con su anticuerpo correspondiente. La solucin que contiene los anticuerpos se denomina antisuero. Estos mtodos son muy tiles en diversas situaciones: Si a travs de un sistema miniaturizado basado en pruebas bioqumicas se determin que la bacteria causante de la infeccin es un miembro del gnero Salmonella, utilizando una batera de antisueros contra el antgeno O presente en el lipopolisacarido de las bacterias gram negativas, es posible identificar a la Salmonella aislada hasta el nivel de serotipo (poli O, A, B, C, D, etc.). La inmunofluorescencia ha resultado ser sumamente til en casos de infecciones de diferente origen. Puede utilizarse para la identificacin del microorganismo aislado o presente en una muestra biolgica. En el mtodo directo se fija la muestra problema a una lmina y se pone en contacto con el antisuero especfico marcado con una sustancia fluorescente (rodamina o fluorescena). Una vez transcurrido el tiempo para que tenga lugar la reaccin antgeno anticuerpo, se expone la lmina a la radiacin ultravioleta para visualizar la reaccin. Tambin existe la tcnica indirecta, donde en primer lugar se utiliza el anticuerpo especfico no marcado y posteriormente se utiliza un anti anticuerpo marcado.

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En caso de una infeccin viral, los virus no pueden ser identificados mediante pruebas bioqumicas, pero si pueden ser identificados en diferentes fluidos biolgicos utilizando inmunoensayos, tales como el ELISA (Enzyme-linked immunoabsorbent assay), el cual, a manera general, utiliza anticuerpos monoclonales especficos para el antgeno a identificar, marcados con una enzima. En un ensayo de ELISA tipo sandwich, los anticuerpos especficos para el antgeno, se colocan sobre los pozos de una microplaca, posteriormente se aade la muestra donde se quiere determinar la presencia del agente (bacteria, virus, protozoario). Si el agente est presente ocurre la reaccin antgeno-anticuerpo; luego del lavado se aade el anticuerpo especfico marcado con la enzima. Una vez transcurrido el tiempo de incubacin y realizado el lavado correspondiente, se aade el sustrato. Si se desarrolla un color se trata de un resultado positivo. Estos ensayos, al igual que otros, involucran el uso de controles positivos y negativos. Inmunoensayos tipo ELISA han sido desarrollados para la deteccin e identificacin de varios tipos de agentes microbianos. Ejemplos: VIH, virus de la Hepatitis A,B,C, Chlamydea trachomatis, Legionella pneumophili, Mycoplasma pneumoniae, Escherichia coli, Entamoeba hystoliticum, Haemophilus influenzae, Neisseria.

6. Mtodos basados en biologa molecular Modernamente adquiere ms importancia el uso de mtodos basados en biologa molecular donde, a travs de procedimientos y reactivos, se pueden detectar determinadas secuencias de ADN que son propias de un determinado agente microbiano. El mtodo que se est utilizando ampliamente en los laboratorios de diagnstico es el PCR (Polymerase Chain Reaction), que se aplica generalmente para la identificacin de- microorganismos que no pueden ser cultivados por los mtodos convencionales. A travs de este mtodo, puede aumentarse la cantidad de ADN hasta niveles detectables mediante electroforesis o mediante sondas de ADN.

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El proceso de PCR, puede resumirse en 4 etapas, que se repiten un n nmero de veces: 1. Separacin de las cadenas de ADN, ello se realiza aumentando la temperatura, la cual rompe los enlaces de hidrgeno que mantiene unidos a las cadenas de ADN. 2. Adicin de cadenas cortas de polinucletidos, denominados cebadores, que se unen por complementariedad de bases a cada una de las cadenas del fragmento de ADN que se desee amplificar. Uno se une a la cadena 5 ---3 y otro a la cadena 35. 3. Disminucin de la temperatura para permitir que los cebadores hibridicen con las cadenas de ADN de la muestra problema, por complementariedad de bases. 4. Adicin de la ADN polimerasa, los cuatro nucletidos (ATP, GTP, TTP, CTP) y dems cofactores, para que tenga lugar la sntesis de la cadena complementaria. 5. Repeticin de las etapas 1 a 4. Este proceso se caracteriza por ser exponencial. En cada ciclo se duplica la regin de ADN ubicada entre los cebadores.

Este procedimiento se realiza en un equipo denominado termociclador, que permite regular las diferentes temperaturas que se requieren para cada uno de los pasos. A continuacin se enumeran ejemplos de agentes microbianos subclasificados en bacterias, virus y protozoario, que han sido identificados mediante PCR. Bacterias: Borrelia burghdoferi, Vibrio cholerae, Helicobacter pylori, Stahylococcus aureus, Chlamydea trachomatis, Shigella dysenteriae, Treponema pallidum, Escherichia coli enterotoxinognica, Mycobacterium tuberculosis y Legionella pneumonophilia, Campylobacter jejuni. Virus: Parvovirus, Herpes-simplex virus, Rotavirus, Papillomavirus, Virus del dengue, Virus Varicella-Zoster, Virus de la Rubola, Adenovirus, Rhinovirus. Protozoarios: Plasmodium falciparium, Toxoplasma gondii, Entamoeba histolyticum, Pneumocystis carinii, Trypnanosoma cruzi.

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Otro mtodo que tambin ha sido ampliamente utilizado y que se fundamenta en complementariedad de bases de cidos nucleicos, son aquellos que utilizan sondas de ADN, que se definen como secuencias de oligonucleotidos de ADN marcados, con un elemento radioactivo (32P,125I, 35S) o con una protena unida a una enzima como la fosfatasa alcalina. Estas sondas se utilizan para la deteccin de una secuencia complementaria de ADN o ARN, presente en el agente que se desea identificar. La muestra, que se supone que contiene un agente microbiano con una secuencia complementaria que se desea identificar, se coloca en un filtro, se trata de manera tal de liberar al cido nucleico, se calienta para que las cadena s complementarias

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se separen. Posteriormente se aade la sonda, y se deja transcurrir un periodo para que tenga lugar la hibridacin si existe la cadena complementaria. La unin de la sonda a la secuencia complementaria se detecta mediante la seal radiactiva que emite la sonda o mediante mtodos enzimticos.

A continuacin se presentan una lista con ejemplos de bacterias que han sido detectadas e identificadas por medio de sondas de ADN: Bacterias gram negativas: Neisseria gonorrhoeae, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Haemophilus influenzae. Bacterias gram positivas: Streptococcus Grupo A, Streptococcus Grupo B, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes. Micobacterias: Mycobacterium tuberculosis, M. Avium, M. Intracelulare. Hongos: Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitis, Cryptococcus neoformans, Coccidiodes immitis.

Siempre que sea posible se debe utilizar el mtodo ms eficiente y ms barato. Las identificaciones utilizando PCR son muy costosas debido a los equipos, los reactivos y los materiales de laboratorio que se deben utilizar. El rea donde se realiza una parte del ensayo slo puede utilizarse para un determinado agente.

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BIBLIOGRAFA Madigan M.T, Martingo J. M. y Jack Parker. 2004. Dcima Edicin. Brock Biologa de los Microorganismos Prentice Hall Mahon, C. and Manuselis G. 2000. Textbook of Diagnostic Microbiolgy. Second Edition. W.B. Saunders Company. USA Prescott, L.; Harley, J.; Klein, D. 1999. Microbiologa. Cuarta edicin. McGraw-Hill Interamericana. Tortora G. J., B. R. Funke and Ch. L. Case 2007. Introduccin a la Microbiologa 9na Edicin. Editorial Mdica Panamericana.

Milagros de Vizcarrondo Sofa Gutirrez de Gamboa Enero 2002 Revisin 2008

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ACTIVIDADES ADICIONALES Elabore una clave para la identificacin de diferentes especies bacterianas. Investigue por qu la prueba del ELISA-VIH presenta el inconveniente de obtener falsos negativos. Busque en un diccionario de ingls tcnico la traduccin al espaol de las palabras siguientes: Acid fast stain Annealing Antibodies labeled cells Antiserum Differential staining Food associated infections Human pathogen Hybridization Indirect fluorescent antibody Monoclonal antibodies Morphology Nucleic target sequence Oligonucleotide Primer Probe Serology Specificity Sputum Viral species Western blotting

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