Identificación de un nuevo

Flavivirus: virus Nanay

Blgo.Julio Evangelista
Departamento de Virología y Enfermedades Emergentes
Centro de Investigación de Enfermedades Tropicales No.6
(NAMRU-6).
Lima - Perú
 Descargos
Las opiniones y afirmaciones expresadas en esta presentación, son propias del autor y no
deben interpretarse como posición oficial o que reflejan la opinión del Departamento de la
Marina, del Departamento de Defensa o del Gobierno de los Estados Unidos de América.

Este trabajo ha sido financiado por la unidad de trabajo (Work Unit

No.80000.82000.25GB.B0016).

Los experimentos que se reportan en esta presentación se realizaron siguiendo las normas
de la Ley de Bienestar Animal y de acuerdo con los principios establecidos por la "Guía para
el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio," Institute of Laboratory Animals Resources,
National Research Council, National Academy Press, 2011.

El presente estudio ha sido aprobado mediante Permiso Nro. 415-2009-AG-DGFFS-

DGEFFS y 1552-2010-AG-DGFFS-DGEFFS de la Dirección de Gestión Forestal y de Fauna
Silvestre del Ministerio de Agricultura del Perú.
 Descargos
Soy personal del gobierno de los Estados Unidos y este trabajo ha sido preparado como
parte de mis funciones oficiales. El articulo 17 U.S.C. § 105 menciona ‘La protección de los
derechos de autor bajo este artículo no se encuentra disponible para ningún trabajo del
Gobierno de los Estados Unidos’. El Artículo 17 U.S.C § 101 define como un trabajo del
Gobierno de los Estados Unidos como el trabajo realizado por un miembro del servicio militar
o empleado del Gobierno de los Estados Unidos como parte de los deberes oficiales de esa
persona.
 Introducción
• El género flavivirus agrupa patógenos importantes para
humanos y animales (DENV, YFV, JEV, WNV).

• En los últimos años, nuevos flavivirus han sido aislados de

mosquitos alrededor del mundo, los cuales fueron reportados
sin capacidad patógena conocida.

• El primer virus caracterizado como flavivirus "específico de

insecto" (ISF) fue el virus de agente de fusión celular (CFAV)
en 1974 (Stollar y Thomas, 1975)

Cook et al., 2012

Calzolari et al., 2016
 Transmisión
Flavivirus se transmiten:

Atípicos, se han aislado de murciélagos y roedores;

Principalmente por artrópodos hematófagos
pero los vectores artrópodos son desconocidos

Virus transmitidos por mosquitos podrían subdividirse en Aedes y Culex.

Curiosamente, los virus transmitidos por Aedes están asociados con las fiebres hemorrágicas y los transmitidos por Culex con
enfermedades encefalíticos

Gaunt et al., 2001; Gould, 2002

 Transmisión

Horizontal Vertical
La mayoría de los flavivirus se transmiten horizontalmente entre artrópodos hematófagos y huéspedes
vertebrados (doble huésped), ejemplos: DENV, JEV y VNO, todos ellos patógenos humanos de interés
mundial.
La transmisión vertical se define como el proceso por el cual una hembra infectada transmite
directamente un patógeno a su progenie, transmisión asociada a los ISF.
Schols and Alen, 2012
Blitvich and Firth, 2015
http://temas.sld.cu/vigilanciaensalud/2016
• Distribución de virus del Dengue

http://www.healthmap.org/dengue/es/
 Flavivirus específicos de insectos (ISFs)

virus Lammi
(Filandia, 2009)

Virus Hanko
(Filandia, 2012)

Aedes flavivirus
(Italia, 2008) Aedes galloisi flavivirus
Japon, 2003)

virus Culex Flavivirus

virus agente de fusión celular
virus Quang Binh Japon (2007)
Puerto Rico (2006) virus de Ngoye (Vietnam, 2009)
(Senegal, 2006)
virus Nakiwogo
(Uganda, 2009)

virus Nounané virus del Rio Kamiti

(Costa de Marfil, 2009) (Kenia, 2003)
virus de Nuevo Mapoon,
(Australia, 2005)

Virus Palm Creek

(Australia, 2013)

Los estudios teóricos han estimado la existencia de más de 2000 Flavivirus (Cook et al, 2009; Farfan-Ale et al, 2009, 2010; Hoshino et al, 2007; Kim et al,
transmitidos por mosquitos no descubiertos y la diversidad de secuencias 2009; Morales-Betoulle et al, 2008), (Crabtree et al, 2003) (Cook et al, 2006),
(Junglen et al, 2009) (Huhtamo et al, 2009), (Cook et al, 2009), (.Blitvich and Firth,
parecen estar relacionados con los Flavivirus “específicos de insectos”. 2015).
Procedimientos
 Muestreo

Iquitos

Zona de Bellavista – Nanay, donde fue realizada la

colecta de los mosquitos para este estudio.

Número de Permiso 415-2009-AG-DGFFS-DGEFFS

y 1552-2010-AG-DGFFS-DGEFFS
Dirección General Forestal y de Fauna Silvestre
Ministerio de Agricultura, Perú.

Los mosquitos fueron colectados entre marzo de 2008 y mayo de 2010,

ubicados en áreas peri-domésticas.
Esquema de tres noches consecutivas por cada mes.

Trampa de luz con CO2 CDC

 Aislamiento viral
Aislado de Culex (Melanoconion) occossa

Se trituraron en 1 ml de Medio Mínimo Esencial de Eagle con sales de

Earles (E-MEM) con aditivos.
15 unidades de mosquitos en un vial

Centrifugación a 7000 rpm durante 10 min

El sobrenadante se inoculó en las C6/36 y Vero 76

C6/36 y Vero 76

Se incubó a 330 C (C6/36) y 370 C (Vero 76) por 10 días

Se reviso el efecto citopático (diariamente)

Después de los 10 días de incubación, se cosecho

y almacenaron a – 800 C hasta su uso
Monocapa de línea celular C6/36
Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
Después de cosechar, se preparó la lamina para la prueba

Se reconstituyo en PBS las células

Secar y fijar

Células (antígeno)

Anticuerpos policlonales

Lavaron dos veces en PBS

incubación por 1 hora a 37 °C

Anticuerpos monoclonales

Lavaron dos veces en PBS incubación por 1 hora a 37 °C

Fluoresceína con anticuerpo secundario marcado

con isotiocianato
 Rango de hospedero in vitro

Células:
Riñón mono verde africano (Vero-76, Vero-E6)
Riñón de cría de hámster (BHK)
Riñón de mono No malignas (LLCMK)
Riñón canino Madin-Darby (MDCK)
Epiteliales de adenocarcinoma de pulmón humano (A549)
Sobrenadante C6/36 Rabdomiosarcoma embrionario humano (RD)

Los sobrenadantes de los cultivos celulares se

pasaron dos veces en células frescas.

Sobrenadante de los segundo pasajes

NAMRU-6 Institutional Animal Care and IFI PCR

Use Committee (protocol NMRCD-10-02)
Amplificación de secuencias
Sobrenadantes de los cultivos celulares
(Vero-76, Vero-E6, BHK, LLCMK, MDCK, A549, RD.)

Extracción ARN

RT-PCR

Purificación
(columnas centri- Secuenciamiento
sep)
gen NS5 y gen E
 Análisis filogenético
Se utilizaron secuencias de Flavivirus (Gen bank). Para los análisis filogenéticos, se utilizaron el método de ¨participacion vecina¨ (NJ) y los métodos
de ¨máxima verosimilitud¨ (ML). Re - muestreo Bootstrap con 1000 repeticiones fue empleado para establecer límites de confianza aproximados
en las ramas individuales.

Gen NS5 y E

Clustal http://www.clustal.org
Gen Bank
www.megasoftware.net
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
Secuencias de nt que se generaron, se
compararon con el GenBank.

Análisis Máxima verosimilitud

http://www.atgc-montpellier.fr/phyml/ www.megasoftware.net
Secuencias obtenidas de algunos miembros del género Flavivirus con
sus respectivos códigos de acceso disponibles en GenBank
Resultados
Cultivo
• Un grupo de mosquitos hembras de Culex (Melanoconion) occossa (n=12)
fue capturado en Julio 2009 del vecindario de Bellavista-Nanay.
•Este grupo reaccionó a los anticuerpos policlonales de DENV, YFV, y SLEV del
cultivo celular C6/36 para la prueba de IFI.
•NO se observó reacción utilizando anticuerpos monoclonales de fiebre
amarilla y de dengue específicos (serotipos 1, 2, 3 y 4).

Células Mamíferas
Los intentos para hacer crecer el virus en células mamíferas incluyendo Vero
76, Vero E6, BHK, LLCMK, MDCK no tuvieron éxito debido:
• No presencia de EC
•Cultivos negativos para IFI
•Cultivos negativos para ARN RT-PCR Viral (inoculados del cultivo C6/36)
 Estructura
Los Flavivirus son virus con envoltura,
esféricos.

Aproximadamente 50 nm de diámetro.

Las proteínas de la superficie están

dispuestas en una simetría icosaédrica-
similares.

Esquema de la estructura de los Flavivirus (Fuente; Cabezas, 2005)

Flavivirus: Genes
Las tres proteínas estructurales
(C, M y E) están localizadas en el
extremo aminoterminal, mientras
que las proteínas no estructurales
(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A,
NS4B, NS5) están en el extremo
carboxilo de la poliproteína

RNA de un Flavivirus y representación de los genes que traducen

proteínas estructurales y no estructurales. (Cabezas, 2005)
 Amplificación de secuencias
Se generaron dos productos cDNA, abarcando:
597 nucleótidos de la región ENV (43 – 1329pb)
1,032 nucleótidos de la región NS5 (1678—3007pb)
Para amplificar:
Región del Gen E, primers degenerados adaptados a los primers Unifor (pares
de bases 1274-1299 del virus YF17D) (Gaunt y Gould, 2005).
Región NS5, FU1 (correspondientes a los pares de bases 8993-9018 de YF17D)
y cFD3 (pares de bases 10056-10077 de YF17D) (Kuno et al., 1998).
 Análisis filogenético
• El análisis filogenético de las secuencias virales de la región NS5 del nuevo Flavivirus, resultaron
agrupados significativamente con el virus Nounané, formando un nuevo subclado (Figura A)
• El análisis filogenético de las secuencias virales de la región ENV se agrupó con otras cepas que
pertenecen a las especies de Flavivirus que infectan solo mosquitos, pero formaron un sub-grupo
independientemente de los otros subclados, grupos Aedes y Culex (Figura B)

NS5 ENV
Discusión
• Kuno et al. (1998), definiendo a especies como una clase de virus con mas de 84%
de identidad a nivel de secuencias de nucleótidos. NANV tiene menos de 67% de
identidad a nivel de nucleótidos y menos de 71% de identidad a nivel de aminoácidos
en comparación con otros Flavivirus en la región más conservada (gen NS5).

• A pesar de la clasificación de NANV dentro del grupo de los Flavivirus transmitidos

por mosquitos, del cual todos han sido asociados con infecciones de mamíferos y
otros vertebrados, no detectamos replicación de NANV en células de mamíferos.

• NANV y NOUV resultaron ser taxones hermanos, formando un clado separado de

otros Flavivirus transmitidos por mosquitos.

• Como NANV no replicó en células mamíferas, no está claro si su persistencia implica

un reservorio en vertebrado o se limita a la transmisión vertical en los mosquitos.

(Kuno; 2007) (Billoir et al., 2000; Cook y Holmes, 2006)

 Discusión
• Los Flavivirus transmitidos por garrapatas y mosquitos que están asociados con
infecciones de vertebrados se replican fácilmente en cultivo de células de mamíferos,
mientras que los Flavivirus específicos de insectos no replican.

• Los datos demuestran la circulación de un nuevo Flavivirus en la cuenca amazónica

de Perú.

• Junto con NOUV y LAMV, NANV representa un nuevo fenotipo entre los Flavivirus:
clasificación filogenética con Flavivirus patógenos transmitidos por mosquitos, sin
replicación en células de mamífero.

(Forshey et al, 2010; Morrison et al, 2010; Turell et al, 2005) (Kuno, 2007) (Bolling et al., 2011)
Conclusiones
• El análisis filogenético de las proteínas ENV y NS5 mostró que el virus
evaluado forma un grupo distinto dentro del clado de los Flavivirus
transmitidos por mosquitos.

• A pesar del agrupamiento con Flavivirus transmitidos por mosquitos, el

virus evaluado creció exitosamente sólo en células de insectos (C6/36) lo
cual puede indicar que este virus podría sólo infectar especies de
mosquitos.

• Por los análisis realizados, el aislamiento se trataría de un nuevo Flavivirus

y proponemos que este nuevo virus genéticamente distinto sea llamado
virus Nanay por la zona de Iquitos, Perú, donde se encontró por primera
vez.
 Agradecimientos:
Cristhopher Cruz Personal de campo del NAMRU-6 Iquitos – Perú.
Carolina Guevara
Helvio Astete Global Emerging Infections Surveillance (GEIS)
Cristiam Carey
Tadeusz J. Kochel Division of the Armed Forces Health Surveillance Center
Amy C. Morrison
Maya Williams
Eric S. Halsey
Brett M. Forshey
Gracias