Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.

com

Acta Trópica 163 (2016) 32–37

Listas de contenidos disponibles en CienciaDirecta

Acta Trópica
revista Página de inicio : www. els ev ier. com/ l oc ate / actatr op ica

Detección molecular fácil y económica de los virus del dengue,

chikungunya y zika en pacientes febriles
Eliana P. Calvo a,∗, Fernando Sánchez-Quete a,B, Sandra Duran a, Isabel Sandoval a,
Jaime E. Castellanos a,B
a Laboratorio de Virología, Universidad El Bosque, Bogotá, Colombia
B Grupo Patogénesis Infecciosa, Universidad Nacional de Colombia, Colombia

información del artículo abstracto

Historial del artículo: El dengue (DENV), el chikungunya (CHIKV) y el zika (ZIKV) son virus transmitidos por artrópodos (arbovirus) que
Recibido el 28 de mayo de 2016 comparten un vector común, el mosquito Aedes aegypti. En etapas iniciales, los pacientes infectados con estos virus
Recibido en forma revisada el 11 de julio de 2016
tienen manifestaciones clínicas similares, sin embargo, los desenlaces y el manejo clínico de estas enfermedades
Aceptado el 27 de julio de 2016
son diferentes, por lo que es necesaria la identificación temprana y precisa del virus causal. Este artículo informa
Disponible en línea el 28 de julio de 2016
sobre el desarrollo de una PCR anidada rápida y específica para la detección de infecciones por DENV, CHIKV y ZIKV
en la misma muestra. Se utilizó un conjunto de seis cebadores externos dirigidos al gen C-preM, E1 y E
Palabras clave:
respectivamente en un ensayo de RT-PCR multiplex de un paso, seguido de la segunda ronda de amplificación con
Arbovirus
Chikungunya
cebadores internos específicos para cada virus. La especificidad del presente ensayo se validó con muestras de
Dengue suero positivas y negativas para virus y sobrenadantes de células infectadas. El ensayo se probó utilizando muestras
zika clínicas de pacientes febriles. En estas muestras, detectamos infecciones mono y duales y un caso de triple
Detección coinfección DENV-CHIKV-ZIKV. Este ensayo podría ser una herramienta útil y económica para la detección de estas
PCR anidado infecciones en regiones donde estos arbovirus co-circulan.
© 2016 Elsevier BV Todos los derechos reservados.

1. Introducción en la mayoría de los países de las Américas y, posteriormente, ha

Los virus transmitidos por artrópodos (arbovirus) son los agentes
causales de infecciones clínicas y subclínicas en humanos, conocidas como
enfermedades febriles inespecíficas.Vasconcelos y Calisher, 2016), que
representan una de las preocupaciones de salud pública más importantes en
las áreas tropicales y subtropicales del mundo. El virus del dengue (DENV),
junto con el virus chikungunya (CHIKV) y el virus Zika (ZIKV), recientemente
introducidos, son actualmente los arbovirus más prevalentes en las
Américas (Rodríguez-Morales, 2015).
Hay cuatro serotipos de DENV (DENV 1–4); por lo tanto, un individuo
puede infectarse hasta cuatro veces con DENV. El dengue ocurre en casi 100
países; aproximadamente 50 millones de personas se infectan anualmente y
más de 500 000 pacientes desarrollan infecciones graves por dengue (Bhatt
et al., 2013) que requieren con frecuencia ingreso hospitalario para el
manejo de la fuga de plasma, acumulación de líquidos, dificultades
respiratorias, hemorragias y daño de órganos que son características de
esta condición. A principios de la década de 1980, el dengue se propagó
∗Autor para correspondencia en: Av. Cra 9 No. 131 A-02, Edificio D., Laboratorio de
Virología, Universidad EL BOSQUE, Bogotá DC, Colombia.
Dirección de correo electrónico:calvoeliana@unbosque.edu.co (EP Calvo).
aumentado su circulación hasta llegar a 2,5 millones de casos en 2015,
incluidos 10.276 casos graves y 1174 muertes (OPS, 2016a). Brasil,
México y Colombia representan casi el 70% de los casos en las
Américas.
Aunque se han informado brotes de CHIKV desde la década de 1950
en África y Asia, no fue hasta 2013 que el virus comenzó a circular en
las Américas. Desde 2013 hasta diciembre de 2015 se han notificado 1,8
millones de casos y 265 muertes en las Américas (OPS 2014, 2016b).
República Dominicana (540.000 casos en 2014) y Colombia (356.000
casos en 2015) fueron los países más afectados, aunque Martinica, las
islas de Guadalupe y Colombia fueron los territorios que notificaron el
mayor número de casos mortales de CHIKV (83, 70 y 57). ,
respectivamente) (OPS, 2014, 2016b).
Antes de 2007, la infección y la enfermedad por ZIKV solo se habían
informado esporádicamente en África y Asia, a pesar de que el virus se
había aislado por primera vez en monos africanos en 1947.Dick et al.,
1952). No fue sino hasta 2007 que se describió el primer brote
epidémico en la Isla Yap -Estados Federados de Micronesia- (Duffy et
al., 2009), y se informaron brotes epidémicos más recientes en la
Polinesia Francesa y otras islas del Pacífico en 2013 (Cao-Lormeau et al.,
2014; Musso et al., 2014). En 2015, comenzó a circular en las Américas y
se extendió a 20 países y territorios (Hennessey et al., 2016). Eso

http://dx.doi.org/10.1016/j.actatropica.2016.07.021 0001-706X/©
2016 Elsevier BV Todos los derechos reservados.
 PE Calvo et al. / Acta Trópica 163 (2016) 32–37
Se ha estimado que entre 440.000 y 1,3 millones de casos ocurrieron en
2015 en Brasil, que ha sido hasta la fecha el país más afectado (CEPDE,
2016). Desde la confirmación de circulación de ZIKV en Colombia
(noviembre de 2015) hasta la semana epidemiológica 17 de 2016, se
han notificado 71.000 casos clínicos (Sivigila, 2016).
Estos tres virus pueden ser transmitidos a los humanos por la picadura
de Aedes género mosquitos (Ae. Egiptoy Ae. albopictus); por lo tanto, se
puede esperar que se produzca la cocirculación y posiblemente la infección
simultánea con dos o tres arbovirus (Musso et al., 2015). Los síntomas
clásicos asociados con estos tres virus incluyen fiebre, exantema, dolor de
cabeza, mialgias y artralgias, lo que dificulta el diagnóstico clínico durante la
fase aguda de la infección. Sin embargo, cada enfermedad tiene un curso
diferente. La infección por DENV tiene una amplia gama de presentaciones
clínicas, que van desde una enfermedad leve hasta una enfermedad mortal.
OMS, 2009). Las fiebres asociadas al CHIKV rara vez son mortales, pero
pueden desencadenar un síndrome reumático crónico o una lesión
neurológica con discapacidad permanente en los recién nacidos (
Economopoulou et al., 2009; Gérardin et al., 2014). Para la infección por
ZIKV, durante el brote de la Polinesia Francesa, las enfermedades se
asociaron con el síndrome de Guillain-Barré, meningitis y meningoencefalitis
(Cao-Lormeau et al., 2016; Ioos et al., 2014), mientras que durante el brote
de Brasil, la infección de mujeres embarazadas pareció estar relacionada con
defectos de nacimiento, como la microcefalia (Kléber de Oliveira et al., 2016;
Mlakar et al., 2016) y otras manifestaciones neurológicas, y anomalías
congénitas (Carod-Artal, 2016; Tintorero, 2015; OPS/OMS, 2015).
El diagnóstico diferencial de estos arbovirus es muy amplio y no es
posible distinguir la causa durante la fase aguda en función de los signos o
síntomas clínicos. En los países latinoamericanos, las pruebas de laboratorio
para confirmar la infección están restringidas a DENV (Castellanos y Coronel-
Ruiz, 2014). Aunque existen pruebas de laboratorio para detectar antígenos
o ARN genómico del CHIKV (Panning et al., 2009; Prat et al., 2014; Yap et al.,
2010), estas pruebas no se utilizan de forma rutinaria en el diagnóstico. La
confirmación de casos de ZIKV es aún más difícil porque no existen pruebas
comerciales o validadas disponibles, por lo que la confirmación se limita a
laboratorios de referencia a los que se envía un número reducido de
muestras.
Las pruebas moleculares se han utilizado con frecuencia y con éxito para
diagnosticar enfermedades infecciosas y muestran una mayor sensibilidad y
especificidad que las pruebas serológicas. Además, debido a la ausencia de una
prueba universal para la detección de ZIKV, el presente estudio tuvo como objetivo
estandarizar una PCR anidada para detectar simultáneamente DENV, CHIKV y ZIKV
en muestras de suero de pacientes febriles con diagnóstico presuntivo de uno de
estos virus. Tal ensayo de PCR convencional podría usarse como prueba de rutina
en la mayoría de los laboratorios de diagnóstico.
2. Materiales y métodos
2.1. aislamiento de ARN
Usando 140 L de suero o plasma, se aisló el ARN usando un mini kit de
ARN viral QIAamp (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Antes de la detección de virus, todas las muestras fueron procesadas para
evaluar la calidad del ARN, amplificando por RT-PCR un ARN no codificante
(control de extracción).
2.2. Detección de ZIKV por PCR anidada
Se utilizaron secuencias de ZIKV que se habían informado previamente
de casos diagnosticados en las Américas para analizar y modificar cebadores
específicos informados anteriormente (Faye et al., 2008, 2013; Lanciotti et al.,
2008); Los oligos elegidos se enumeran entabla 1. La utilidad de los
cebadores F944-R1269 para detectar ZIKV se probó en suero de un caso
previamente confirmado. La primera ronda de amplificación se realizó con el
kit SuperScript III One-Step RT-PCR (Invitrogen) utilizando 5 L de
33
ARN y cebadores externos 0,2 -M. El ARN aislado de células de mosquito C6/36
infectadas con DENV y muestras de suero de pacientes obtenidas en 2014, antes
de que ZIKV comenzara a circular, se usaron para evaluar la especificidad. La
segunda ronda de amplificación se llevó a cabo utilizando 2 L del primer producto
de amplificación como plantilla y 0,2 M de cebadores internos ZIKV F944–R1241.
Los productos de amplificación se separaron y analizaron en un gel de agarosa al
2% que se tiñó con bromuro de etidio. La identidad del amplicón se confirmó
mediante secuenciación.
2.3. Detección de DENV, CHIKV y ZIKV
2.3.1. Transcripción inversa y amplificación múltiplex de
primera ronda
La RT-PCR se llevó a cabo en un volumen final de 20 L utilizando el kit
Super-Script III One-Step RT-PCR (Invitrogen), 5 L de ARN molde (50–80 ng/L)
y 0,2 M de cada uno de los siguientes pares de cebadores para cada virus (es
decir, un total de seis cebadores): CHIKVF10240–R10540; VDEN mD1–D2; y
ZIKV F944–R1269 (tabla 1). El perfil de amplificación fue el siguiente: 15 min a
50◦C, 5 minutos a 95◦C y 30 ciclos de tres pasos (95◦C durante 30 s, 60◦C
durante 30 s, y 72◦C durante 30 s). Un control positivo para DENV fue el ARN
aislado de células infectadas con C6/36 con cada uno de los cuatro serotipos.
El control positivo CHIKV fue ARN obtenido de sobrenadantes de células
Vero que se habían inoculado con el aislado CHKB64; los resultados positivos
de la prueba se confirmaron mediante secuenciación. Durante el proceso de
estandarización, el ARN aislado de muestras previamente confirmadas se
clasificó como DENV o CHIKV y luego se utilizó como control positivo.
2.3.2. Amplificación de segunda ronda
La detección específica de cada virus se llevó a cabo en tubos de reacción
separados usando 2 L de producto de primera ronda como plantilla, MgCl 1,5 mM.
2, 0,2 mM de dNTP y 0,2 M de pares de cebadores específicos para cada virus (o
cinco cebadores usados para la serotipificación de DENV). Las condiciones de
termociclado fueron las siguientes: 25 ciclos de tres pasos de 95◦C durante 30 s,
recocido a 60 ◦C durante 30 s y extensión a los 72 ◦C durante 30 s. Las reacciones
se realizaron en un sistema termociclador T100 (BioRad, Estados Unidos). Los
productos de amplificación se analizaron en geles de agarosa al 2% teñidos con
bromuro de etidio.
3. Resultados
3.1. Detección de ZIKV por PCR anidada
Imprimadores específicos diseñados para recocer a los 5′-región del gen
ZIKV E reconoció robustamente los nuevos aislamientos colombianos sin
amplificar las cuatro cepas de DENV (Figura 1). Los cebadores ZIKV F944–
R1241 utilizados en la PCR anidada generaron un amplicón del tamaño
previsto (297 pb) de una muestra previamente confirmada. El amplicón de
297 pb mostró 100% de identidad con la secuencia KU922923.1 aislada de un
paciente mexicano.
3.2. Especificidad de la PCR anidada de arbovirus
Después de estandarizar el protocolo de detección de ZIKV, establecimos
una RT-PCR multiplex para detectar CHIKV, DENV y ZIKV en muestras de
pacientes febriles. Después de la primera ronda de amplificación, solo había
amplicón detectable en los controles positivos (sobrenadantes de cultivo de
DENV o CHIKV) pero no en el ARN de las muestras de suero (datos no
mostrados). Sin embargo, después de la segunda ronda de amplificación
(amplificación anidada) utilizando cebadores específicos para cada virus, se
detectaron amplicones del tamaño esperado para CHIKV (204 pb) y ZIKV (297
pb), mientras que para DENV el tamaño correspondía al serotipo. Las bandas
solo aparecieron en los controles respectivos y en las muestras de suero que
habían sido previamente confirmadas para cada virus en una reacción
uniplex (Figura 2). No observamos reactividad cruzada entre los diferentes
ARN virales ni interferencia entre los seis cebadores utilizados.
34 PE Calvo et al. / Acta Trópica 163 (2016) 32–37

tabla 1
Secuencias de oligonucleótidos utilizadas en este estudio.

Virus Reacción Secuencia 5′→3′ amplicón (pb)

CHIKV RT-PCR (exterior) E1F10240ACGCAATTGAGCGAAGCAC E1R 301

10541CCAAATTGTCCYGGTCTTCCCTE1F
PCR (interior) 10240ACGCAATTGAGCGAAGCAC E1R10444 204
CTGAAGACATTGGCCCCAC

DENV RT-PCR (exterior) D1AGTTGTTAGTCTRYGTGGACCGAC D2 511

TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC D1-TS1
Serotipado PCR (interno) CCCGTAACACTTTGATCGC D1 211
-TS2CGCCACAAGGGCCATGAACAGTTT D1-TS3 119
TAACATCATCATGAGACAGAGC D1-TS4 288
TTCTCCCGTTCAGGATGTTC 266

ZIKV RT-PCR (exterior) FM944GGTCATGATACTGCTGATTGC ER 325

1269CCACTAACGTTCTTTTGCAGAC
44GGTCATGATACTGCTGATTGC 297
41AGTGTCTGACTGCTGTTCAAGG

3.3. Detección de DENV, CHIKV y ZIKV en muestras de suero mediante

PCR anidada

Este protocolo se evaluó en 20 muestras de pacientes febriles que tenían un

Figura 1.Prueba de especificidad de oligonucleótidos ZIKV en una PCR anidada. La amplificación del gen
ZIKV E da como resultado un producto de 297 pb que se muestra en el análisis de gel de agarosa. Se utilizó
escalera de ADN de rango bajo (Bioline) como marcador de tamaño molecular. Carril Z+: muestra de suero
previamente confirmado a ZIKV; carriles D1-D4: sobrenadantes de células C6/36 infectadas por DENV1-4.
Carriles (-): controles negativos. Los imprimadores utilizados para cada panel se especifican en la parte
superior.
en la reacción de RT-PCR. Esta estrategia de amplificación permitió la
detección de estos tres arbovirus a partir de la misma muestra (Z+)
utilizando tres pares de cebadores externos para obtener el primer
amplicón, que se amplificó en la segunda ronda de PCR con cebadores
internos específicos, mejorando así la sensibilidad de la prueba y facilitando
la detección. de coinfecciones pos
como ZIKV positivo
presencia de otros
diagnóstico presuntivo de infección por arbovirus. En este conjunto de muestras,
confirmamos dos casos de CHIKV, un caso de DENV y cuatro casos de ZIKV.
Además, detectamos dos muestras con coinfección por ZIKV+DENV, una muestra
con coinfección por CHIKV+ZIKV y cuatro muestras con coinfección por
DENV+CHIKV. Además, cinco de las muestras analizadas dieron negativo para cada
uno de estos arbovirus (Fig. 3, Tabla 2). Las muestras positivas para CHIKV se
verificaron mediante RT-PCR en tiempo real (Tabla 2) y los fragmentos de ZIKV de
seis muestras se secuenciaron y mostraron una identidad del 98-100 % con los
aislamientos estadounidenses.
4. Discusión
La aparición en los últimos tres años de dos nuevos arbovirus en las Américas
que causan enfermedades febriles similares al dengue y son transmitidas por el
mismo vector ha puesto de relieve la necesidad de pruebas de laboratorio para
confirmar con precisión las infecciones por estos virus. Estas pruebas deben ser
rápidas, eficientes, específicas, económicas y fáciles, permitiendo identificar el
virus en muestras de pacientes. Los laboratorios en América Latina
frecuentemente procesan muestras para confirmar casos de dengue, pero la
mayoría de las muestras febriles de CHIKV y ZIKV no se someten a confirmación de
laboratorio. Además, debido al diagnóstico sugerido

Figura 2.Prueba de especificidad de PCR anidada de arbovirus. Análisis en gel de agarosa de amplicones de CHIKV, DENV o ZIKV de muestras de suero de pacientes. Se utilizó escalera de ADN de rango bajo (Bioline) como
marcador de tamaño molecular. Carril C+: sobrenadante de células Vero infectadas por CHB64; carriles S1 y S2: muestras de suero previamente confirmadas para CHIKV; carril D+: sobrenadante de células C6/36 infectadas
con DENV-1; carriles S3 y S4: muestras de suero previamente confirmadas a DENV; carril Z+: muestra de suero previamente confirmado a ZIKV; carril S5: muestra de suero presuntiva de ZIKV. Carriles (-): controles negativos.
La muestra Z+ también fue positiva para CHIKV y DENV-2. Los imprimadores utilizados para cada panel se especifican en la parte superior.
 35

Fig. 3.Detección de CHIKV, DENV y ZIKV en muestras de suero mediante PCR anidada. Los productos de amplificación específicos de CHIKV, DENV o ZIKV se separaron en un gel de agarosa teñido con
bromuro de etidio. Se utilizó escalera de ADN de rango bajo (Bioline) como marcador de tamaño molecular. Carriles 01-20: muestras de suero de pacientes; Carriles (-): controles negativos; Carril C+:
control positivo CHIKV; Carriles D1-D4: controles positivos de DENV; carril Z+: control positivo ZIKV.

Tabla 2
Resultados de PCR anidada, PCR en tiempo real y Secuenciación de muestras clínicas. Las muestras positivas para CHIKV o ZIKV mediante PCR anidada se verificaron dos veces mediante qRT-PCR o secuenciación.

número de muestra PCR anidado Confirmación

CHIKV Serotipo DENV ZIKV qRT-PCR CHIKV Número de acceso de ZIKV GenBank

01 + – + + KX261851.1
02 + 3 – +
03 + – – +
04 – – –
05 – 1 –
06 – 2 + KX261852.1
07 + 2 – +
08 – – +
09 – – –
10 – 1 + KX261853.1
11 – – + KX261854.1
12 – – +
13 + – – +
14 – – –
15 – – –
dieciséis – – + KX261855.1
17 + 2 – +
18 – – –
19 + 2 – +
20 + 2 + + KU954085.1

gle infecciones por DENV (Chien et al., 2006; Lanciotti et al., 1992; Santiago et
al., 2013), CHIKV (Ho et al., 2010; Pastorino et al., 2005; Ummul Haninah et
al., 2010) o ZIKV (Faye et al., 2008, 2013; Lanciotti et al., 2008). Se han
desarrollado pruebas para detectar coinfecciones por DENV+CHIKV (Cecilia
et al., 2015; Dash et al., 2008; Mishra et al., 2011), demostrando la utilidad de
este enfoque. Debido a las condiciones epidémicas actuales, se necesita una
prueba clínicamente aplicable para la detección molecular de estos tres
arbovirus. En este estudio, se estandarizó un protocolo de PCR anidado
clásico fácil para detectar DENV, CHIKV y ZIKV de la misma muestra. El
enfoque utiliza tres pares de cebadores externos específicos para cada virus
para realizar la transcripción inversa y la amplificación por PCR en un solo
paso. La amplificación de este producto en una segunda ronda anidada
utilizando tres pares de cebadores internos permite la detección de cada
virus en reacciones independientes. Aunque nuestro método requiere dos
rondas de amplificación, es un protocolo fácil y rápido (que da resultados en
menos de 6 h) que podría implementarse en casi cualquier
laboratorio equipado con el mínimo equipo y experiencia en biología
molecular.
Aunque la PCR en tiempo real tiene muchas ventajas en
comparación con la PCR anidada, como la velocidad, la sensibilidad,
una menor probabilidad de falsos positivos e incluso, en algunos casos,
mediciones cuantitativas, requiere equipos y reactivos costosos. Por lo
tanto, su uso en países subdesarrollados permanece restringido. Las
técnicas de PCR multiplex exigen la ausencia de reactividad cruzada
entre cebadores y moldes y la ausencia de interferencia entre
cebadores. En consecuencia, la mezcla de pares de cebadores debería
reconocer una plantilla diana específica y amplificarla con una eficacia
similar a la de una reacción uniplex.
Los cebadores externo e interno de ZIKV reconocieron específicamente el
genoma de ZIKV en una región utilizada antes para detectar ZIKV (Lanciotti et al.,
2008) sin amplificación de DENV RNA. Aunque se han desarrollado otras pruebas
moleculares para detectar ZIKV usando los genes de la glicoproteína E y NS5 (Faye
et al., 2008, 2013), la prueba de Lanciotti et al.
36 PE Calvo et al. / Acta Trópica 163 (2016) 32–37
informado en 2008 es el ensayo más utilizado para confirmar casos de ZIKV a nivel
mundial (Buathong et al., 2015; Cao-Lormeau et al., 2014; Faria et al., 2016; Grard
et al., 2014). Los cebadores de ZIKV usados aquí amplificaron específicamente
este virus sin reactividad cruzada de DENV en todas las reacciones (es decir, RT-
PCR y PCR anidada); la secuencia del fragmento de 297 pb confirmó su identidad y
la utilidad de este método.
Para CHIKV, se han informado varios ensayos de PCR en tiempo real para
su detección (Ho et al., 2010; Pastorino et al., 2005; Ummul Haninah et al.,
2010), pero en el presente estudio, nuestro objetivo fue establecer una
metodología que fuera aplicable a los laboratorios de biología molecular
básica. Por lo tanto, diseñamos oligos específicos para amplificar el gen E1,
una región que se usa con frecuencia para detectar el CHIKV circulante en
Asia y África (Moyen et al., 2014; Pastorino et al., 2005; Renault et al., 2007).
Este par de cebadores amplificó un fragmento de 204 pb y nuestro grupo lo
había utilizado previamente con éxito para detectar CHIKV en niños febriles (
Calvo et al., 2016). En este estudio, la identidad de los amplicones CHIKV de
algunas muestras se confirmó mediante secuenciación.
Para amplificar DENV, usamos los cebadores D1-D2, que se hibridan con
la región prM-C y producen un producto de 511 pb. La utilidad de este par
de cebadores ha sido demostrada por muchos estudios (Lanciotti et al.,
1992; Magalhães et al., 2014; Pérez-Castro et al., 2016; Ridde et al., 2016).
PCR de segunda ronda usando D1 con una mezcla de cebadores modificados
TS1 a TS4 (Chien et al., 2006) permite la detección de cualquier serotipo
DENV en la muestra.
La eficacia y la especificidad del cebador se confirmaron utilizando
sobrenadantes de cultivos infectados con DENV o CHIKV como controles
positivos, que produjeron los tamaños de amplicón correctos. Nuestro
ensayo estandarizado se probó utilizando muestras de suero de pacientes
febriles recolectados en áreas endémicas de dengue donde también se
había confirmado la transmisión autóctona de CHIKV (2014) y ZIKV (2015). En
estas muestras pudimos detectar siete casos de infección por un solo virus y
siete co-infecciones duales (DENV+ZIKV, CHIKV+ZIKV y DENV+CHIKV)
confirmando la co-circulación de estos tres virus en áreas definidas, junto
con una alta número (8/20) de pacientes infectados por ZIKV. Además, la
metodología recientemente desarrollada permitió la detección de DENV-2 y
CHIKV en muestras de control positivas para ZIKV (muestra Z+ enFigura 2;
muestra 20 enFig. 3). La presencia de un amplicón y secuencias específicas
para estos tres virus confirmó un caso de coinfección.
Estos hallazgos plantean preocupaciones sobre los enfoques de
diagnóstico de ZIKV. De hecho, hay una amplia circulación del virus, un bajo
número de casos confirmados por laboratorio (Sivigila, 2016), y evidencia
alarmante de una asociación entre infección en mujeres embarazadas y
microcefalia (Tintorero, 2015; Kléber de Oliveira et al., 2016; Mlakar et al.,
2016) y el desarrollo de manifestaciones neurológicas después de la
infección por ZIKV (Carod-Artal, 2016). Además, el cuadro clínico de
coinfecciones ZIKV+DENV o ZIKV+CHIKV o incluso infecciones triples, como
se detecta aquí, sigue estando poco caracterizado.
Sin embargo, aunque la confirmación de los casos de CHIKV se considere
menos esencial, el diagnóstico virológico sigue siendo un desafío en el
futuro cercano para la salud pública en los países subdesarrollados debido a
las secuelas crónicas que pueden aparecer tanto en los recién nacidos
infectados como en los adultos mayores (Economopoulou et al., 2009;
Gérardin et al., 2014). En conclusión, la detección de arbovirus y la
confirmación de infecciones es un asunto urgente, tanto para mejorar el
diagnóstico y la atención de los pacientes durante la enfermedad aguda,
como para reducir la transmisión viral y describir las manifestaciones típicas
y/o atípicas de la enfermedad durante las coinfecciones. El protocolo de PCR
anidado descrito en el presente estudio representa un método útil a utilizar
en el diagnóstico diferencial de DENV, CHIKV y ZIKV en pacientes febriles que
podría facilitar la confirmación de casos y fortalecer la vigilancia
epidemiológica de estos arbovirus.
Fondos
Vicerrectoría de Investigaciones, Universidad El Bosque.
Colciencias 360-2011. Programa Red de Investigación
Multidisciplinaria para la prevención y control de Enfermedades
Transmitidas por Vectores.
Conflicto de intereses
El autor declara no tener ningún conflicto de interés.
Reconocimiento
Al Dr. Wilmer Villamil-Gomez y Clínica Santa María (Sincelejo-
Colombia) por brindarnos algunas de las muestras de pacientes
febriles.
Referencias
Bhatt, S., Gething, PW, Brady, OJ, Messina, JP, Farlow, AW, Moyes, CL, Drake,
JM, Brownstein, JS, Hoen, AG, Sankoh, O., Myers, MF, George, DB, Jaenisch,
T., et al., 2013. La distribución global y la carga del dengue. Naturaleza 496,
504–507,http://dx.doi.org/10.1038/nature12060.
Buathong, R., Hermann, L., Thaisomboonsuk, B., Rutvisuttinunt, W., Klungthong, C.,
Chinnawirotpisan, P., Manasatienkij, W., Nisalak, A., Fernandez, S., Yoon, IK,
Akrasewi, P., Plipat, T., 2015. Detección de la infección por el virus del zika en
Tailandia, 2012–2014. Soy. J. Trop. Medicina. Hig. 93 (2), 380–383,http://dx.doi.org/
10.4269/ajtmh.15-0022.
Calvo, EP, Coronel-Ruiz, C., Velazco, S., Velandia-Romero, M., Castellanos, JE,
2016. Diagnóstico diferencial dengue-chikungunya en pacientes pediátricos.
Biomédica 36 (Suplemento 1),http://dx.doi.org/10.7705/biomedica.v36i0.2982.
Cao-Lormeau, VM, Roche, C., Teissier, A., Robin, E., Berry, AL, Mallet, HP, Sall,
AA, Musso, D., 2014. Zika virus, Polinesia Francesa, Pacífico Sur, 2013. Emerg.
Infectar. Dis. 20 (6), 1084–1086,http://dx.doi.org/10.3201/eid2006.140138. Cao-
Lormeau, VM, Blake, A., Mons, S., Lastère, S., Roche, C., Vanhomwegen, J.,
et al., 2016. Brote del síndrome de Guillain-Barré asociado con la infección por el virus del
Zika en la Polinesia Francesa: un estudio de casos y controles. Lanceta 387 (10027), 1531–
1539,http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(16)00562-6. Carod-Artal, FJ, 2016.
Epidemiología y complicaciones neurológicas de la infección
por el virus Zika: un nuevo virus neurotrópico emergente. Rev. Neurol. 62, 317–328. Castellanos, JE,
Coronel-Ruiz, C., 2014. Diagnóstico de la enfermedad del dengue: un rompecabezas para ser
resuelto Fac.Rev. Medicina. Universidad Nac. colombino 62 (4), 455–464,http://dx.doi.org/10.
15446/revfacmed.v62n4.45593.
Cecilia, D., Kakade, M., Alagarasu, K., Patil, J., Salunke, A., Parashar, D., Shah, PS,
2015. Desarrollo de un ensayo multiplex de RT-PCR en tiempo real para la
detección simultánea de los virus del dengue y chikungunya. Arco. Virol. 160 (1),
323–327, http://dx.doi.org/10.1007/s00705-014-2217-x.
Chien, LJ, Liao, TL, Shu, PY, Huang, JH, Gubler, DJ, Chang, GJ, 2006.
Desarrollo de ensayos de PCR con transcriptasa inversa en tiempo real para detectar
y serotipificar virus del dengue. J. Clin. Microbiol. 44 (4), 1295–1304.
Dash, PK, Parida, M., Santhosh, SR, Saxena, P., Srivastava, A., Neeraja, M., Lakshmi,
V., Rao, PV, 2008. Desarrollo y evaluación de una reacción en cadena de polimerasa de
transcripción inversa dúplex de 1 paso para el diagnóstico diferencial de la infección por
chikungunya y dengue. Diagnóstico Microbiol. Infectar. Dis. 62 (1), 52–57, http://dx.doi.org/
10.1016/j.diagmicrobio.2008.05.002.
Dick, GW, Cocina, SF, Haddow, AJ, 1952. Virus Zika: aislamientos y serología
especificidad Trans. R. Soc. trop. Medicina. Hig. 46, 509–520.
Duffy, MR, Chen, TH, Hancock, WT, Powers, AM, Kool, JL, Lanciotti, RS, et al.,
2009. Brote del virus Zika en la isla Yap, estados federados de Micronesia. N. ingl.
J.Med. 360, 2536–2543.
Dyer, O., 2015. El virus del Zika se propaga por las Américas a medida que aumenta la preocupación por el nacimiento
defectos BMW 351, h6983.
Centro Europeo para la Prevención y el Control de Enfermedades, 2016. Evaluación rápida de riesgos
− Epidemia de enfermedad por el virus del Zika: asociación potencial con microcefalia y
síndrome de Guillain-Barré. Cuarta actualización, 9 de marzo de 2016. Estocolmo: ECDC,
Disponible en:http://ecdc.europa.eu/en/publications/Publications/zika-virusrapid-
riskassessment-9-march-2016.pdf.
Economopoulou, A., Domínguez, M., Helynck, B., Sissoko, D., Wichmann, O.,
Quenel, P., Germonneau, P., Quatresous, I., 2009. Infecciones atípicas por el virus
Chikungunya: manifestaciones clínicas, mortalidad y factores de riesgo de
enfermedad grave durante el brote de 2005–2006 en Reunión. Epidemiol. Infectar.
137 (4), 534–541,http://dx.doi.org/10.1017/S0950268808001167.
Faria, NR, Azevedo Rdo, S., Kraemer, MU, Souza, R., Cunha, MS, Hill, SC, Thézé,
J., Bonsall, MB, Bowden, TA, Rissanen, I., Rocco, IM, Nogueira, JS, et al., 2016. El
virus del Zika en las Américas: primeros hallazgos epidemiológicos y genéticos.
Ciencia 352 (6283), 345–349,http://dx.doi.org/10.1126/science.aaf5036. Faye, O.,
Faye, O., Dupressoir, A., Weidmann, M., Ndiaye, M., 2008. Alpha sall a
RT-PCR de un solo paso para la detección del virus zika. J. Clin. Virol. 43 (1), 96–101,http://
dx.doi.org/10.1016/j.jcv.2008.05.005.
Faye, O., Faye, O., Diallo, D., Diallo, M., Weidmann, M., Sall, AA, 2013. Cuantitativo
Detección por PCR en tiempo real del virus del Zika y evaluación con mosquitos
capturados en el campo. Virol. J. 10, 311,http://dx.doi.org/10.1186/1743-422X-10-311.
Gérardin, P., Sampériz, S., Ramful, D., Boumahni, B., Bintner, M., Alessandri, J.-L.,
et al., 2014. Resultado neurocognitivo de niños expuestos a
 PE Calvo et al. / Acta Trópica 163 (2016) 32–37
Infección por el virus chikungunya de madre a hijo: el estudio de cohorte
CHIMERE en la isla Reunión. PLoS negl. trop. Dis. 8 (7), e2996, disponible en:http://
dx. plos.org/10.1371/journal.pntd.0002996.
Grard, G., Caron, M., Mombo, IM, Nkoghe, D., Mboui Ondo, S., Jiolle, D., Fontenille,
D., Paupy, C., Leroy, EM, 2014. Zika virus in Gabon (Central Africa)-2007: ¿una nueva
amenaza de Aedes albopictus? PLoS negl. trop. Dis. 8 (2), e2681,http://dx. doi.org/
10.1371/journal.pntd.0002681.eCollection2014.
Hennessey, M., Fischer, M., Staples, JE, 2016. El virus Zika se propaga a nuevas áreas:
región de las américas mayo 2015-enero 2016. MMWR Morb. semana mortal. Rep.
65 (3), 55–58,http://dx.doi.org/10.15585/mmwr.mm6503e1.
Ho, PS, Ng, MM, Chu, JJ, 2010. Establecimiento de SYBR verde de un solo paso
ensayo time-PCR para la detección y cuantificación rápidas de la infección por el
virus chikungunya. Virol. J 7, 13,http://dx.doi.org/10.1186/1743-422X-7-13. Ioos, S.,
Mallet, HP, Leparc Goffart, I., Gauthier, V., Cardoso, T., Herida, M., 2014.
Epidemiología actual del virus Zika y epidemias recientes. Medicina. Mal. Infectar. 44
(7), 302–307,http://dx.doi.org/10.1016/j.medmal.2014.04.008.
Kleber de Oliveira, W., Cortez-Escalante, J., De Oliveira, WT, do Carmo, GM,
Henriques, CM, Coelho, GE, Araújo de França, GV, 2016. Aumento de la prevalencia
notificada de microcefalia en bebés nacidos de mujeres que viven en áreas con
transmisión confirmada del virus del zika durante el primer trimestre del embarazo –
Brasil, 2015. MMWR Morb. semana mortal. Rep. 65 (9), 242–247,http://dx.doi. org/
10.15585/mmwr.mm6509e2.
Lanciotti, RS, Calisher, CH, Gubler, DJ, Chang, GJ, Vorndam, AV, 1992.Rápido
detección y tipificación de virus del dengue a partir de muestras clínicas mediante reacción
en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa. J. Clin. Microbiol. 30 (3), 545–551.
Lanciotti, RS, Kosoy, OL, Laven, JJ, Vélez, JO, Lambert, AJ, Johnson, AJ,
Stanfield, SM, Duffy, MR, 2008. Propiedades genéticas y serológicas del virus del Zika
asociadas con una epidemia, Estado de Yap, Micronesia, 2007. Emerg. Infectar. Dis.
14 (8), 1232–1239,http://dx.doi.org/10.3201/eid1408.080287.
Magalhães, BM, Siqueira, AM, Alexandre, MA, Souza, MS, Gimaque, JB, Bastos,
MS, Figueiredo, RM, Melo, GC, Lacerda, MV, Mourão, MP, 2014. Coinfección por
malaria y dengue por P. vivax: un estudio transversal en la Amazonía brasileña. PLoS
negl. trop. Dis. 8 (10), e3239,http://dx.doi.org/10.1371/journal.
pntd.0003239.eCollection2014.
Mishra, B., Sharma, M., Pujhari, SK, Ratho, RK, Gopal, DS, Kumar, CN, Sarangi,
G., Chayani, N., Varma, SC, 2011. Utilidad de la reacción en cadena de la polimerasa con
transcriptasa inversa multiplex para el diagnóstico y caracterización serotípica de los virus
del dengue y chikungunya en muestras clínicas. Diagnóstico Microbiol. Infectar Dis. 71 (2),
118–125,http://dx.doi.org/10.1016/j. diagmicrobio.2011.06.020.
Mlakar, J., Korva, M., Tul, N., Popović, M., Poljšak-Prijatelj, M., Mraz, J., Kolenc, M.,
Resman Rus, K., Vesnaver Vipotnik, T., Fabjan Vodušek, V., Vizjak, A., Pižem, J.,
Petrovec, M., Avšič Županc, T., 2016. Virus Zika asociado con microcefalia. N. ingl.
J.Med. 374 (10), 951–958,http://dx.doi.org/10.1056/NEJMoa1600651.
Moyen, N., Thiberville, S.-D., Pastorino, B., Nougairede, A., Thirion, L., et al., 2014.
Primer brote de fiebre chikungunya informado en la República del Congo, 2011. PLoS
One 9 (12), e115938,http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0115938. Musso, D.,
Nilles, EJ, Cao-Lormeau, VM, 2014. Rápida propagación del Zika emergente
virus en el área del Pacífico. clin. Microbiol. Infectar. 20, O595–O596,http://dx.doi.
org/10.1111/1469-0691.12707.9.
Musso, D., Cao-Lormeau, VM, Gubler, DJ, 2015. Virus Zika: siguiendo el camino de
dengue y chikungunya? Lanceta 386 (9990), 243–244,http://dx.doi.org/10. 1016/
S0140-6736(15)61273-9.
OPS, 2014. Número de casos reportados de chikungunya en países o territorios
de las Américas 2013–2014 (por semanas), Semana Epidemiológica/SE 52,
(actualizada al 29 de diciembre del 2014) http://www.paho.org/hq/index. php?
Itemid=40931.
OPS, 2016a. Número de Casos Notificados de Dengue y Dengue Grave (DE) en el
Américas 2015. Semana Epidemiológica/SE 52, (Actualizado al 3 de febrero de
2016). Disponible dehttp://www.paho.org/hq/index.php?option=com
topics&view=article&id=1&Itemid.
37
OPS, 2016b. Número de casos reportados de chikungunya en países o territorios
de las Américas 2015. Semana Epidemiológica/SE 52, (Actualizado el 3 de febrero
de 2016). Disponible dehttp://www.paho.org/hq/index.php?option=com
docman&task=doc view&Itemid=270&gid=33092&lang=es.
Organización Panamericana de la Salud/Organización Mundial de la Salud (OPS/OMS),
2015. Alerta epidemiológica y síndrome neurológico, malformaciones congénitas e
infección por virus Zika. Implicaciones para la salud pública en las Américas, 1 de
diciembre, Disponible en:http://www.paho.org/hq/index. php?optionZcom
docman&taskZdoc view&ItemidZ270&gidZ32405&langZen. Panning, M., Hess, M.,
Fischer, W., Grywna, K., Pfeffer, M., Drosten, C., 2009.
Rendimiento del kit de PCR de transcripción inversa en tiempo real del virus
RealStar Chikungunya. J. Clin. Microbiol. 47 (9), 3014–3016,http://dx.doi.org/
10.1128/JCM.01024-09.
Pastorino, B., Bessaud, M., Grandadam, M., Murri, S., Tolou, HJ, Peyrefitte, CN,
2005. Desarrollo de un ensayo TaqMan RT-PCR sin paso de extracción de ARN para la
detección y cuantificación de virus africanos Chikungunya. J.Virol. Métodos 124 (1-2),
65–71.
Pérez-Castro, R., Castellanos, JE, Olano Matiz, MI, Jaramillo, JF, Vargas, SL,
Sarmiento, DM, Stenström, TA, Overgaard, HJ, 2016. Detección de los cuatro
serotipos de dengue en mosquitos hembra Aedes aegypti recolectados en una zona
rural de Colombia. Mem. Inst. Osvaldo Cruz. 111 (4), 233–240,http://dx.doi.org/10.
1590/0074-02760150363.
Prat, CM, Flusin, O., Panella, A., Tenebray, B., Lanciotti, R., Leparc-Goffart, I., 2014.
Evaluación de pruebas diagnósticas serológicas comercialmente disponibles para el virus
chikungunya. emergente Infectar. Dis. 20 (12), 2129–2132,http://dx.doi.org/ 10.3201/
eid2012.141269.
Renault, P., Solet, JL, Sissoko, D., Balleydier, E., Larrieu, S., Filleul, L., Lassalle, C.,
Thiria, J., Rachou, E., de Valk, H., Ilef, D., Ledrans, M., Quatresous, I., Quenel, P.,
Pierre, V., 2007. Una gran epidemia de infección por el virus chikungunya en la Isla
Reunión, Francia, 2005–2006. Soy. J. Trop. Medicina. Hig. 77 (4), 727–731.
Ridde, V., Agier, I., Bonnet, E., Carabali, M., Dabiré, KR, Fournet, F., Ly, A., Meda, IB,
Parra, B., 2016. Presencia de tres serotipos de dengue en Uagadugú (Burkina Faso):
implicaciones para la investigación y la salud pública. Infectar. Dis. Pobreza 5, 23,http://
dx.doi.org/10.1186/s40249-016-0120-2.
Rodriguez-Morales, AJ, 2015. Zika: la nueva amenaza de los arbovirus para América Latina. j
Infectar. desarrollo Pruebas. 9, 684–685,http://dx.doi.org/10.3855/jidc.7230.art.
Santiago, GA, Vergne, E., Quiles, Y., Cosme, J., Vázquez, J., Medina, JF, Medina, F.,
Colón, C., Margolis, H., Muñoz-Jordán, JL, 2013. Rendimiento analítico y clínico del
ensayo de RT-PCR en tiempo real de los CDC para la detección y tipificación del virus del
dengue. PLoS negl. trop. Dis. 7 (7), e2311,http://dx.doi.org/10.1371/
journal.pntd.0002311.
Sivigila, Boletín Epidemiológico Semanal. Semana Epidemiológica 17 de 2016.
Disponible de:http://www.ins.gov.co/boletin-epidemiologico/
BoletnEpidemiologico/2016Boletinepidemiologicosemana17.pdf.
Ummul Haninah, A., Vasan, SS, Ravindran, T., Chandru, A., Lee, HL, Shamala Devi,
S., 2010.Desarrollo y evaluación de un ensayo de RT-PCR en tiempo real basado en SYBR-
Green I de un solo paso para la detección y cuantificación del virus Chikungunya en muestras
de humanos, monos y mosquitos. trop. biomedicina 27 (3), 611–623. Vasconcelos, PF,
Calisher, CH, 2016. Emergencia de enfermedades arbovirales humanas en
las américas, 2000–2016. Enfermedades zoonóticas transmitidas por vectores. 16 (5), 295–301,
http://dx.doi.org/10.1089/vbz.2016.1952.
Organización Mundial de la Salud, 2009. Dengue: Directrices para el diagnóstico, tratamiento,
Prevención y control. Ginebra.
Yap, G., Pok, K.-Y., Lai, Y.-L., Hapuarachchi, H.-C., Chow, A., et al., 2010. Evaluación
de ensayos de diagnóstico de chikungunya: diferencias en la sensibilidad de los ensayos de
serología en dos brotes independientes. PLoS negl. trop. Dis. 4 (7), e753,http://dx.doi. org/
10.1371/journal.pntd.0000753.