USOS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

¾ Immunofenotipificación
¾ Ciclo celular (contenido de DNA)/ploidía
tumoral
Publicaciones en Medline Publications
¾ Potential de Membrana
citando "Flow Cytometry"
¾ Flujo de iones
¾ Viabilidad celular 5000
¾ Tinción de prots. intracelulares
¾ Cambios de pH 4000
Publicaciones

¾ Cell tracking y proliferación

¾ Sorting
¾ Estado Redox
3000
¾ Estructura de la cromatina
¾ Lípidos 2000
¾ Fusión de membranas
¾ Actividad enzimática 1000
¾ Metabolismo Oxidativo
¾ Detección de grupos sulfhidrílicos 0
¾ Degradación de DNA
60
65
70
75
80
85
90
95
00

¾ Expresión génica
19
19
19
19
19
19
19
19
20

Año
¿CÓMO ES EL EQUIPO?

SISTEMA DE DETECCIÓN
 SISTEMA DE FLUIDOS

Tubo
muestra

Presión de
muestra
Sheath (Variable)
Tanque Pressure
Tanque del (Constante)
“waste” “Sheath
fluid”

Vacío Line Pressure

 EL SISTEMA DE FLUIDOS

• Se requiere un flujo unicelular de células o

partículas para un buen análisis.

• Se logra a través de un sistema de flujo laminar

a presión.

• La muestra se inyecta en un fluido envolvente a

medida que pasa a través de un pequeño
orificio (50um-300um)

FLUJO CELULAR
Las células se mueven a
lo largo del tubo debido
a que la muestra se
Punta
encuentra a una presión
inyectora Sheath
levemente mayor que la
presión del flujo fluid
envolvente.

La introducción de un
Señ
Señal Fluorescente
pequeño volumen
dentro de un gran
volumen de modo que
Haz de laser quede “enfocado” a lo
enfocado largo del eje mayor se
conoce como enfoque
hidrodiná
hidrodinámico
 DIFERENCIAS DE PRESIÓN
Las diferencias de presión entre la muestra y el flujo envolvente
controlan el volumen de flujo de la muestra.

10 psi 10 psi 10 psi

10.2 psi 10.4 psi 10.8 psi

A mayor diferencia de presiones, mayor será el grosor de la

columna de muestra.

=> las células dejan de pasar alineadas en una suspensión

unicelular.
Consecuencia: mayores CV y un aumento en el Nº celulas que
pasan por el laser al mismo tiempo.
No existe aná
análisis unicelular!!!

300
280 G0/G1 CV= 2.42
260
240
220
200
180 68.70 19.16 9.56
Count

160
140

Baja presión 120

100
80 S phase
60
G0/G1
G2/M
40
20
0
0 1024 2048 3072 4096
FL3

340
320 GO/G1 CV= 7.79
300
280
260
74.85 9.12 15.84
240
220
200
Count

180
Alta presión 160
140
120
100
80
60
40
20
0
0 1024 2048 3072 4096
FL3
 ¿ QUÉ PASA CON LA MUESTRA?

Granulosidad

*
(reflexiòn)

) tamaño
HAZ DEL
LASER

(difracción)

Dispersión hacia delante y dispersión angular:

permite el reconocimiento de distintas
poblaciones celulares.

suspensión celular
 Dispersión hacia delante y dispersión angular:
permite el reconocimiento de distintas
poblaciones celulares.

R1

SISTEMA ÓPTICO DEL CITÓMETRO

LASER
488 nm

LASER
633 nm

Tomado de BD Biosciences
 Filtros “Long Pass”
• Transmiten las long. de onda mayores a la especificada
Ej. 500LP transmite todas las λ>500nm
Transmitancia

400nm 500nm 600nm 700nm

Tomado de Cytomation Training Manual

Filtros “Short Pass”

• Transmiten todas las long. de onda menores a la indicada
Ej. 600SP transmite todas las λ<600nm
Transmitancia

400nm 500nm 600nm 700nm

Tomado de Cytomation Training Manual

 Filtros “Band Pass”
• Transmiten un rango acotado entorno a una long. de onda
específica
Ej. 550/20BP transmite 560nm >λ>540nm

(550/20 = 550+/-10, no 550+/-20)

Transmitancia

400nm 500nm 600nm 700nm

Tomado de Cytomation Training Manual

Filtros Dicroicos

• Pueden ser filtros “long pass” o “short pass”

• Se ubican a 45º de la luz incidente

• Parte de la luz se refleja a 90º respecto de la luz incidente y

parte es transmitida.

Detector 1

Detector 2

Filtro dicroico
 Detectores

• Existen dos tipos principales de fotodetectores usandos en

citometría de flujo:
¾ Photodiodes
o Indicados para señales fuertes, cuando la saturacion es
un problema potencial (eg. Detector FSC)

¾ Photomultiplier tubes (PMT)

o Más sensibles que un Photodiode.
o Los PMT se emplean para detectar pequeñas cantidades
de fluorescencia emitida por los fluorocromos.

¾ Ambos poseen un filtro band pass por delante que selecciona

el rango de luz que registran.
 SISTEMA ÒPTICO DEL CITÓMETRO

Tomado de BD Biosciences

Multifaceted polygon assembly of filters and detectors

¿CÓMO SE TRANSFORMA LA SEÑAL ELÉCTRICA
EN UN DATO ANALIZABLE
POR UN SOFTWARE?

e integra ambos
parámetros para Dato que
sacar el área para pasa a la
computadora
cada célula para el
análisis
Ancho del pulso
(tiempo de vuelo de
la célula a través del
laser)
Para CADA
Pico de voltaje CÉLULA el
equipo registra:
 ANÁLISIS DE DATOS: Construcción de “gates”

GATES

R1: linfocitos
R2: monocitos
R3: granulocitos
R4:
leucocitos menos los
eosinófilos
 ANÁLISIS DE DATOS: Gráfico tipo HISTOGRAMA

Tubo control de
fluorescencia
inespecífica o
autofluorescen-
cia

Tubo de
Fluorescencia
específica

Datos en un histograma
 ESPECTROS DE EXCITACIÓN Y EMISIÓN DE FLUORÓFOROS

FL-1
FL-2
FL-3
FL-4

Lásers del FacsAria: 488 561 640

Tomado de BD Biosciences

COMPENSACIÓN: exclusión de emisión superpuesta

Diferencias y semejanzas entre citometría y microscopía
Propiedades citometría Imaging
Análisis poblacional y estadística ++ -/+
Detalles estructurales/morfológicos de células - +
Separación de células vivas + -
Análisis de microambiente celular - +
Análisis de funciones celulares (entrada de Ca++ ) + -
Análisis de múltiples parámetros (>5) Relativ. fácil Más dificil

Análisis simultáneo de múltiples parámetros + +/-

Costoso + +
Registros permanentes + +/-