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Biología y bioquímica del suelo 67 (2013) 166mi173

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Biología y Bioquímica del Suelo

página de inicio de la revista: www.elsevier.com/locate/soilbio

Una comparación de dos ensayos colorimétricos, basados en las técnicas de

Lowry y Bradford, para estimar la proteína total en extractos de suelo

MA Redmile-Gordon*, E. Armenise, RP White, PR Hirsch, KWT Goulding

Rothamsted Research, Harpenden, Herts AL5 2JQ, Reino Unido

información del artículo resumen

Historial del artículo: Los extractos de suelo suelen contener grandes cantidades de material orgánico humificado disuelto, que
Recibido el 16 de mayo de 2013 normalmente se refleja en un alto contenido de polifenoles. Dado que los polifenoles confunden seriamente la
Recibido en forma revisada el 14 de
cuantificación de la proteína extraída, es importante minimizar esta interferencia para garantizar que las mediciones
agosto de 2013
sean representativas. Aunque el ensayo colorimétrico de Bradford se usa rutinariamente en la ciencia del suelo para
Aceptado el 17 de agosto de 2013 Disponible en
la cuantificación rápida de proteínas en extractos de suelo, tiene varias limitaciones. Por lo tanto, investigamos una
línea el 3 de septiembre de 2013
técnica colorimétrica alternativa basada en el ensayo de Lowry (usado con frecuencia para medir proteínas y
sustancias húmicas como grupos distintos en biopelículas microbianas). Las precisiones tanto del ensayo de
Palabras clave:
Bradford como del método de microplacas de Lowry modificado se compararon en combinación factorial. La
Determinación de proteína total Ensayo
colorimétrico de proteína Interferencia de
proteína se cuantificó en extractos de suelo (extraídos con citrato), incluidas las adiciones estándar de proteína
polifenoles Proteína del suelo relacionada modelo (BSA) y polifenol (Sigma H1675-2). Usando el ensayo de microplacas de Lowry descrito, no se detectaron
con glomalina Ácido húmico efectos de interferencia del citrato incluso con concentraciones hasta 5 veces mayores que las que se usan
normalmente para extraer proteínas del suelo. Además, se encontró que el ensayo de Bradford era altamente
GRSP susceptible a dos artefactos simultáneos y confusos: 1) el desarrollo de color debido a la proteína añadida fue
BRSP inhibido en gran medida por la concentración de polifenoles, y 2) el desarrollo de color sustancial fue causado
EPS
directamente por la adición de polifenoles. Por el contrario, el método de Lowry permitió distinguir entre el
Biopelícula microbiana del suelo
desarrollo de color de origen proteico y no proteico, proporcionando un análisis cuantitativo más preciso.
Sustancias poliméricas extracelulares

- 2013 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

1. Introducción los residuos de aminoácidos proteinogénicos (p. ej., triptófano y

Todos los métodos de estimación de proteína total están sujetos a
artefactos cuando se analizan extractos de suelo y, por lo tanto, es mejor
considerarlos como 'semicuantitativos'. La selección del método analítico
depende mucho de cómo elegimos definir la proteína del suelo y los
recursos analíticos a nuestra disposición (Gillespie et al., 2011). Por ejemplo,
Roberts y Jones (2008)favoreció la hidrólisis de la proteína seguida de la
cuantificación cromatográfica de los aminoácidos constituyentes. Si bien las
etapas analíticas de los enfoques de hidrólisis son altamente tolerantes a la
interferencia de sustancias húmicas, existen varios problemas. En primer
lugar, es probable que las moléculas orgánicas parcialmente humificadas
liberen algunos aminoácidos por hidrólisis, en segundo lugar, algunos
* Autor correspondiente. Sistemas sostenibles de suelos y pastizales, Rothamsted Research,
Harpenden, Herts AL5 2JQ, Reino Unido. Teléfono:þ44 1582 763133x2417.
Correos electrónicos:marc.redmile-gordon@othamsted.ac.uk,marc.redmile-
gordon@eco888.f9.co.uk (MA Redmile-Gordon).
cisteína) se destruyen en la etapa de hidrólisis y, además, algunos
enlaces peptídicos no se hidrolizan con éxito, en particular los enlaces
de residuos hidrofóbicos como la valina, la isoleucina y la leucina.
Roberts y Jones, 2008).
Por el contrario, los métodos colorimétricos sufren interferencias de
sustancias húmicas directamente, lo que limita seriamente su precisión (
Nannipieri y Eldor, 2009). Sin embargo, los métodos colorimétricos todavía
se usan con frecuencia para la comparación relativa entre tratamientos, ya
que son rápidos y asequibles, no requieren un paso de hidrólisis y, con
frecuencia, muestran una buena correlación con técnicas más costosas y
lentas (por ejemplo,Gillespie et al., 2011). Los extractos de suelo suelen
contener grandes cantidades de materia orgánica humificada, que se
caracteriza por un alto contenido polifenólico (Martens et al., 2004). Se ha
demostrado que esto aumenta erróneamente las estimaciones de la
proteína extraída utilizando el ensayo de Bradford (Whiffen et al., 2007).
Además, no se puede suponer que esta interferencia sea constante porque
el tamaño de la reserva polifenólica puede ser variable bajo diferentes
manejos (Martens et al., 2004), aumentado por

0038-0717/$miconsulte el material preliminar - 2013 Elsevier Ltd. Todos los derechos

reservados. http://dx.doi.org/10.1016/j.soilbio.2013.08.017
 MA Redmile-Gordon et al. / Biología y bioquímica del suelo 67 (2013) 166mi173 167

ejemplo a través del metabolismo secundario de los hongos (Haider et al., tabla 1
Principales propiedades químicas y físicas del suelo.
1975), o disminuido a través del metabolismo de las termitas (Ji et al., 2000) y
los efectos de cebado microbiano (Kuzyakov et al., 2000). Tierra Tipo de suelo Gestión Orgánico Total C/N pH Arcilla %a

Las fracciones fenólicas de bajo peso molecular se han eliminado previamente no. C (mg g1) N (mg g1) proporción

de soluciones acuosas utilizando fases sólidas polares (Ferri et al., 2011) sin 1 De cromo Cultivable 13.66 1.30 10.5 7.18 18mi27
embargo, es probable que este enfoque también provoque la eliminación de la luvisol (trigo)
proteína disuelta (Bianchi et al., 1996).Giagnoni et al. (2011)También se informó 2 Batista barbecho desnudo 0.30 0.03 10.3 5.53 7.9
Arenosol
que se producen pérdidas de proteínas al utilizar la filtración en gel para purificar
3 Batista Pradera 16.86 1.55 10.9 5.95 8.0
extractos que contienen sustancias húmicas. La eliminación de complejos húmicos Arenosol
también sería problemática porque la polimerización de proteínas extracelulares
aDatos de Avery y Catt (1995).
por moléculas húmicas es un proceso inevitable y natural en la mayoría de los
suelos (Burns et al., 2013). Las cantidades de péptidos húmicos más pequeños
también son muy variables entre extractos de diferentes suelos (Bonmati et al.,
2009). Además, se sospecha que se forman asociaciones macromoleculares Lucarini y Kilikian (1999)encontró que el citrato 2 M causó la supresión
irreversibles en respuesta a la extracción (Schmidt et al., 2011). Reducir la del desarrollo del color, lo que llevó a una subestimación de alrededor del 19
magnitud de los artefactos derivados del contenido polifenólico es, por lo tanto, % en el ensayo de Lowry y del 5 % en el método de Bradford. La sensibilidad
una alternativa razonable al intento de eliminación de la fracción polifenólica. del ensayo de Lowry al citrato puede parecer prohibitiva en un principio. Sin
embargo, las extracciones de GRSP utilizan concentraciones de citrato de
El ensayo de Bradford (bradford, 1976) se ha convertido en el método solo 20 mM (pH 7) o 50 mM (pH 8). Además, una modificación del ensayo de
colorimétrico de elección, debido principalmente a su alta sensibilidad, Lowry empleado porFrolund et al. (1995)afirmó permitir la separación de la
linealidad percibida y velocidad de análisis (Sapan et al., 1999). El ensayo de absorbancia debida a la proteína y la de la fracción húmica, mediante la
Bradford se basa en las interacciones entre los residuos de aminoácidos inclusión y exclusión de sulfato de cobre del reactivo de Lowry. Aunque esto
básicos (principalmente arginina, lisina e histidina) con el colorante azul ha tenido éxito para extractos de biopelículas de lodos de aguas residuales,
brillante G-250 de Coomassie (CBB) en una matriz ácida. La unión de CBB a no se ha probado previamente con extractos de suelo.
proteínas (o interferandos) da como resultado un cambio espectral a la
forma azul del tinte. Por el contrario, el ensayo de Lowry (Lowry et al., 1951) Por lo tanto, comparamos el ensayo de Bradford de rutina con una
funciona en condiciones alcalinas, y consta de dos pasos: 1) la reacción de adaptación de microplaca deLowry et al. (1951)incluyendo la modificación
Biuret: basada en la reducción de Cu2þque luego se une a la proteína descrita porFrolund et al. (1995)que pretendía permitir la separación de la
formando un Cu1þcomplejo peptídico, y 2) reducción posterior del Folinmi absorbancia debida a la proteína y la de la fracción húmica. Los aumentos en
reactivo de Ciocalteu por este complejo (Smith et al., 1985). En el formato el contenido de proteína total se midieron mediante la adición de cantidades
original propuesto porLowry et al., (1951)el ensayo de Lowry también dio conocidas de BSA a extractos de citrato de 3 suelos contrastantes. Nuestros
una indicación falsa de proteína en presencia de polifenoles, que reducen la objetivos eran:
FolinmiReactivo de Ciocalteu, que contribuye a la absorbancia en la misma
región del espectro para complejos proteicos (w750 nm). i) Determinar si el citrato es problemático en los ensayos de microplaca Lowry de
extractos de suelo.

Las investigaciones colorimétricas de los extractos del suelo también se ven
fuertemente afectadas por las interferencias físicas (dispersión) y los efectos
fisicoquímicos de las arcillas en suspensión (sorción). Centrifugación a 3000 -
gramono elimina completamente la fracción de arcilla extrafina, que es la más
activa en estos procesos de sorción (Lozzi et al., 2008). En el estudio mencionado
anteriormente, el ensayo de Lowry fue el único método para dar estimaciones de
proteína correctas. Además de ser muy sensible al contenido de arcilla residual, el
ensayo de Bradford es muy sensible al tiempo, y la precipitación del colorante
unido a proteínas se produce unos 10 minutos después del contacto. Esto
introduce limitaciones con respecto a la cantidad de muestras medibles por
ejecución, lo que reduce el rendimiento y la velocidad.
La técnica de extracción de citrato descrita porWright y Upadhyaya
(1996)se practica ampliamente, con contenido de proteína comúnmente
conocido como proteína del suelo relacionada con la glomalina (GRSP).
Originalmente se propuso que el contenido de proteína en estos extractos
provenía de hongos micorrícicos arbusculares (AMF) productores de
glomalina de los Glomeromycots, pero desde entonces se ha confirmado
que los extractos contienen grandes cantidades de proteína del suelo de
origen no micorrícico (Gillespie et al., 2011; Rosier et al., 2006).
Independientemente del origen, el uso del ensayo de Bradford para medir
GRSP o proteína en general genera una medición falsa cuando se analiza en
presencia de polifenoles que se encuentran en cantidades grandes y muy
variables en los extractos del suelo (Halvorson y González, 2006; Roberts y
Jones, 2008; Whiffen et al., 2007). Además, la interferencia de los polifenoles
no se cuantifica en el procedimiento de ensayo. Esto significa que no se
puede hacer ninguna distinción entre el contenido de proteínas y
polifenólicos y, por lo tanto, las referencias a GRSP o incluso a las proteínas
cuantificadas mediante el ensayo de Bradford pueden ser muy engañosas (
Nannipieri y Eldor, 2009).
ii) Comparar la precisión de las estimaciones de Bradford y Lowry de las
adiciones de proteínas a los extractos de suelo (albúmina de suero
bovino; BSA), con y sin aumento de las adiciones de polifenoles (ácido
húmico; Sigma H1675-2).
2. Materiales y métodos
2.1. Descripción del sitio y muestreo de suelo
Se obtuvieron tres suelos de manejo contrastante de dos sitios experimentales
en el sur de Inglaterra con propiedades químicas y físicas contrastantes (tabla 1).
El suelo 1 (campo: 'Long Hoos') estaba bajo cultivo de trigo en Rothamsted
Research, Hertfordshire, Reino Unido (50-500norte, 0-250W). El suelo 1 se clasifica
como franco arcilloso pedernal sobre arcilla con inclusiones arenosas (serie
Batcombe). El suelo 2 y el suelo 3 eran de Woburn Experimental Farm, Bedford,
Reino Unido (51-590norte, 0-350W), y clasificados como Arenosoles Cambric
arenosos (FAO). Se tomaron muestras de suelos tanto de un área de gestión de
barbecho desnudo (Suelo 2) como de pastizales permanentes (Suelo 3). Se
recolectaron muestras compuestas de suelo en abril de 2010 utilizando una
barrena de 2,5 cm de diámetro a una profundidad de 0mi23 cm para los suelos
cultivables y barbechos desnudos (Suelos 1 y 2) y de 0mi10 cm para el pastizal
(Suelo 3). Las muestras se agruparon y almacenaron durante la noche (10-C) antes
de tamizar en húmedo (<2 mm) y posteriormente se seca al aire en la oscuridad a
25-C.
2.2. extracciones de suelo
Los suelos se extrajeron utilizando el protocolo de 'glomalina fácilmente
extraíble' deWright y Upadhyaya (1996). Brevemente, 8 ml de 20 mM
168 MA Redmile-Gordon et al. / Biología y bioquímica del suelo 67 (2013) 166mi173
Se dispensó citrato de sodio a pH 7,0 sobre 1 g de suelo secado al aire en tubos de
centrífuga de polipropileno de 15 ml y se esterilizaron en autoclave (121-C)
durante 30 min. Inmediatamente después del autoclave, los tubos se enfriaron en
hielo y se centrifugaron en un rotor preenfriado (4-C) a 3500gramodurante 20 min.
Los sobrenadantes se decantaron y almacenaron toda la noche a 4-C para el
análisis.
2.3. Preparación de muestras y patrones
Se utilizaron como patrones un polifenol modelo (ácido húmico; Sigma
H1675-2) y una proteína (albúmina de suero bovino; Sigma A7906). Los
extractos de suelo 1, 2 y 3 se diluyeron 7,5, 2 y 12,5 veces respectivamente,
con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para permanecer dentro
del rango de ensayo efectivo (absorbancia máxima < 1,0). Las adiciones
estándar de BSA fueron iguales a 0, 20, 40, 60, 80 ppm para los extractos de
suelo y 0, 25, 50, 75, 100 ppm para los estándares en PBS solo. Estos se
combinaron con adiciones de ácido húmico (HA) de 0, 80, 160, 240, 320 ppm
para los extractos de suelo y 0, 100, 200, 300, 400 ppm en PBS solo.
2.4. Análisis de microplaca de Bradford
Las mediciones de proteínas en extractos y PBS se realizaron utilizando un kit
de ensayo Bradford (Bio Rad Protein Assay; Bio Rad Laboratories). a cada 50metro
Se agregaron L de extracto diluido o PBS (tres repeticiones) en microplaca (Nunc
442404) 25metroL alícuotas de PBS que contienen suficiente BSA y/o HA para dar
concentraciones equivalentes (en relación con el original 50metroL extracto) de 0
mi100 ppm BSA y 0mi400 ppm AH. El colorante Bio-Rad G-250 se mezcló
rápidamente con PBS inmediatamente antes de la adición, luego se agregó
inmediatamente y con fuerza con una pipeta de 12 canales para garantizar una
mezcla adecuada (termoelectrónica 'Finnpipette' ajustada a la velocidad 9). Esto
entregó 50metroL de tinte a cada pocillo con suficiente PBS para alcanzar un
volumen de pocillo final de 250metroL. Las placas se leyeron 7 minutos más tarde
a 595 nm usando un lector de placas 'Varioscan' (Thermo Scientific) ajustado a una
duración de lectura de 150 ms por pocillo.
2.5. Análisis de microplacas de Lowry
Una modificación del ensayo de Lowry (1951) descrito porFrolund et al.
(1995)se utilizó para cuantificar por separado los compuestos proteicos y
polifenólicos en cada extracto de suelo. El principio de esta modificación es
que la omisión del sulfato de cobre del reactivo permite la determinación de
la autoabsorbancia de compuestos húmicos y aminoácidos cromogénicos.
Concentraciones y volúmenes de Lowry y FolinmiLos reactivos de fenol de
Ciocalteu (Sigma F9252), fueron optimizados para velocidad y sensibilidad
(resultados no mostrados) usando principios deMiller (1959), Oosta et al.
(1978)y peterson (1979). En última instancia, un reactivo más concentrado en
comparación con el deLowry et al. (1951)se preparó para maximizar la
sensibilidad del ensayo y reducir el tiempo de incubación como se detalla a
continuación.
Los reactivos de Lowry se prepararon a partir de tres soluciones madre a 3,5
veces la concentración del reactivo de macroensayo de Lowry original, es decir; 3,5
g de sulfato de cobre (CuSO4$5H2O) 100 mL1H2O, 7 g tartrato sódico potásico 100
mL1H2O y 70 g de Na2CO3L1NaOH 0,35N. Las tres soluciones se combinaron
secuencialmente en proporciones de 1:1:100 (v:v:v), respectivamente (Reactivo A).
El segundo reactivo (Reactivo B) se preparó de la misma manera, excepto que se
excluyó la solución de sulfato de cobre y se sustituyó el volumen con agua
desionizada. Tres réplicas de cada muestra o estándar (50metroL) se añadieron a
microplacas de 2 - 96 pocillos, marcadas con 'A' y 'B'. Los volúmenes de todos los
pozos se incrementaron a 100metroL usando PBS o estándar en PBS,
posteriormente, 100metroL de reactivo A se inyectó rápidamente en los pocillos
de la placa A usando una Finnpipette electrónica de 12 canales ajustada a la
velocidad 9 para asegurar una buena mezcla. Se añadió el reactivo B a la placa B
de la misma manera. Ambas placas se incubaron a temperatura ambiente.
en la oscuridad durante 10 min. El reactivo Folin-Phenol se preparó
inmediatamente antes del final de la primera incubación (2 N diluido 10 veces en H
2O) y 100metroL posteriormente se inyectó a todos los pozos. A continuación, las
placas se incubaron durante 30 min más (temperatura ambiente, oscuridad) antes
de leer a 750 nm durante 150 ms por pocillo.
Se obtuvieron así dos absorbencias por muestra: 'AbdominalesA'y 'AbdominalesB'
para los respectivos reactivos. A partir de estas absorbencias, la absorbancia teórica
debida a la proteína (equivalentes de BSA) se calculó como 'Abdominalesproteína'. La
absorbancia debida a 'sustancias húmicas' (específicamente 'equivalentes de ácido
húmico' o HAE) se presenta como 'Abdominaleshúmico'de acuerdo con las siguientes
fórmulas dadas porFrolund et al. (1995):
Abdominalesproteína¼1:25DAbdominalesA AbdominalesBÞ
Abdominaleshúmico¼AbdominalesB
0:2Abdominalesproteína
2.6. Evaluación del efecto del citrato en el método de microplacas de
Lowry
Muestras de 100metroL con adiciones estándar de BSA y citrato se
prepararon combinando 25metroL de extracto de suelo diluido al 2,5 (suelo
1) con 25metroL PBS que contiene 80, 160, 240 y 320 ppm de BSA, en tres
réplicas, en microplacas 'A' y 'B'. Se añadió citrato (20 mM) a estas muestras
(0, 10, 20 o 40metroL) luego hecho hasta 100metroL volúmenes finales con
tampón PBS. La dilución final del extracto de suelo fue por lo tanto 10 veces,
siendo las concentraciones de proteínaþ0,þ20, þ40,þ60,þ80 ppm. Las
concentraciones de citrato investigadas fueron, por lo tanto, 1, 2, 4 y 5 veces
la concentración típica del ensayo. Luego se siguió el procedimiento de
Lowry modificado descrito en el párrafo 2.5. También se prepararon para el
contraste adiciones de citrato al tampón PBS (sin extracto de suelo) y PBS
con 160 ppm de ácido húmico (sin extracto de suelo).
2.7. Precisión de las estimaciones de proteínas
Se evaluó el efecto del ácido húmico sobre la señal de proteína para cada
extracto de suelo (tabla 1) y PBS solo, en diseño factorial, incluyendo tipo de
extracto, adición de BSA y HA.
2.8. métodos de estadística
2.8.1. efecto citrato
Cambios enAbdominalesproteínadebido a las adiciones de BSA y citrato se
examinaron mediante regresión múltiple utilizando la probabilidad máxima
residual (REML). El efecto de aumentar las adiciones de citrato sobre
Abdominalesproteínasobre todas las adiciones de BSA y citrato se presenta
para las diferentes matrices analíticas.
2.8.2. Absorbancia específica de proteína y efecto de ácido húmico
Las adiciones conocidas de BSA se compararon con el aumento medido
en la concentración de proteína de las muestras. Se utilizó el análisis de
regresión para comparar la fuerza del impacto de las adiciones de HA en la
intercepción y la pendiente de la calibración en los extractos de tampón y
suelo.
3. Resultados
3.1. Efecto del citrato en el análisis de Lowry
El análisis de regresión de las adiciones de BSA con adiciones crecientes de
citrato al tampón de ensayo, tampón más 160 ppm de HA y extracto de suelo
reveló un impacto insignificante del citrato sobreAbdominalesproteína. Las curvas
de calibración resultantes deAbdominalesproteínacontra las adiciones de BSA al
extracto de suelo y tampón más HA fueron casi indistinguibles en
 MA Redmile-Gordon et al. / Biología y bioquímica del suelo 67 (2013) 166mi173
Figura 1.Efecto insignificante del citrato sobre la estimación de Lowry de estándares en PBS que contiene
160 ppm de HA.
las concentraciones más altas y más bajas de citrato probadas (Figura 1).
Comparando las regresiones lineales deAbdominalesproteínaen función de
BSA en PBS que no contiene extracto de suelo ni adición de HA, se aprecia
una diferencia muy pequeña (Figura S1a).
Representación gráfica del efecto de todas las adiciones de citrato sobre
Abdominalesproteínaque van desdeþ20 mM aþ80 mM sobre todas las
adiciones de BSA requiere representación tridimensional (inclusión dez eje),
y cuando se grafica, la diferencia es visualmente indistinguible. Por lo tanto,
las pendientes medias de las curvas de calibración a lo largo de lazeje se dan
enTabla 2, mostrando un efecto insignificante del citrato en los tres
extractos.
Un sentidof [citrato] (Zpendiente) de 0,000266 para PBS muestra que el
aumento de las adiciones de citrato a PBS reprime marginalmente el desarrollo de
color de la proteína añadida, como se ve porJi (1973). Sin embargo, el alcance es
insignificante en el rango de concentraciones de citrato que probablemente se
usará para la extracción del suelo (Figura S1b). El efecto insignificante del citrato
se pone en perspectiva en comparación con el efecto matriz de HA en PBS (Tabla 3
). Aquí es evidente que la adición de 160 ppm de HA al tampón suprimió
claramenteAbdominalesproteína, cambiando la absorbancia de 0,005573 por unidad
BSA a 0,004399 por unidad BSA (alrededor del 20%). Del mismo modo, en extracto
de suelo,Abdominalesproteínaes 0,004485 de adición de BSA (nuevamente,
aproximadamente un 20% menos en comparación con la respuesta de las
adiciones de BSA a PBS). La supresión del desarrollo del color debido a la proteína.
(Abdominalesproteína) se investigó más a fondo en el siguiente experimento
variando la concentración de HA, tanto en PBS como en extractos de suelo.
3.2. Comparación de la precisión entre las estimaciones de
estándares de Bradford y Lowry en PBS
El sistema Lowry modificado de dos a tres reactivos era menos sensible
al tiempo que el Bradford, lo que permitía el uso completo de los 96
Tabla 2
Coeficientes de regresión de regresiones múltiples para adiciones de citrato dados con
error estándar (se).
Matriz analítica SignificarZpendiente
Proteína Abs como f [citrato]
PBS 0.000266
Extracto de suelo en PBS PBS þ0.000294
enriquecido con HA (160 ppm) þ0.000052
169
Tabla 3
Coeficientes de regresión de Absproteínacomo f(BSA) en las tres matrices contrastantes, también
en presencia de citrato.
Matriz analítica pendiente de abdominales se
proteína como f [BSA]
PBS 0.005573 0.000076
Extracto de suelo en PBS 0.004485 0.000076
PBS enriquecido con HA (160 ppm) 0.004399 0.000076
placas de pozo. El procedimiento analítico basado en Lowry (incluida la
mezcla de los reactivos madre) se logró en aproximadamente una hora. Con
el ensayo de Bradford, la adición de HA en ausencia total de proteína dio
como resultado una estimación positiva falsa de proteína (80 ppm de
proteína estimada en presencia de 400 ppm de HA) (Figura 2a,X¼0). Aunque
las inclusiones crecientes de HA provocaron un efecto aditivo en términos de
absorbancia total, también se produjo una subestimación cada vez mayor de
la proteína adicional, como se ve por la reducción del ángulo de pendiente
con el aumento del contenido de HA. Por ejemplo, con 400 ppm de ácido
húmico (Figura 2a, HA400), la pendiente de la regresión lineal es un 65%
menor que en ausencia de ácido húmico (HA0).
El método de microplaca de Lowry dio estimaciones más precisas de la
cantidad de proteína añadida (Figura 2B). Con el ensayo de microplacas de Lowry,
la adición de HA solo no dio como resultado una indicación falsa positiva de
proteína (Figura 2B,X¼0). Cuando se combinó con adiciones de proteínas, se
produjo una subestimación sistemática de las proteínas (***pag <0,001). Sin
embargo, esto fue menos de la mitad del efecto supresor observado con el ensayo
de Bradford (solo una disminución del 31 % en la pendiente que compara las
regresiones para HA400 y HA0;Figura 2B).
Utilizando el método de Bradford, los errores cuadráticos medios de
predicción (MSEP) de la proteína añadida al tampón (afectada por las
adiciones de HA) se calcularon utilizando el método deWallach y Goffinet
(1987). MSEP aumentó con la adición de HA, de 2 a 364, 1152, 1983 y 2778,
para adiciones de HA de 0, 100, 200, 300 y 400 ppm, respectivamente.
Utilizando la técnica de microplacas de Lowry, los valores observados
(proteína medida) difieren mucho menos de los esperados (proteína
añadida), con MSEP correspondientes de 2, 81, 219, 290 y 469,
respectivamente. Por lo tanto, con adiciones crecientes de HA, el MSEP de la
técnica de microplacas de Lowry fue más de 5 veces más pequeño que el
ensayo de Bradford (Tabla S1).
3.3. Comparación entre estimaciones de Bradford y Lowry de
adiciones estándar al extracto del suelo
Las concentraciones de proteína en extractos diluidos de suelo 1 dadas
por los métodos de microplacas de Bradford y Lowry (Fig. 3a y b,
respectivamente), sin adición de BSA (X¼0) fueron 21,8 ppm y 12,5 ppm (50 y
100metroL concentraciones de ensayo, respectivamente). Estas mediciones
absolutas, incluida la proteína del suelo, con un rango de adiciones de BSA y
HA muestran patrones de respuesta similares a los observados con PBS solo
(Figura 2a y B). Utilizando el ensayo de Bradford (Fig. 3a), la pequeña adición
de ácido húmico (80 ppm) provocó un aumento en la estimación de proteína
de alrededor del 75%. En contraste, con el ensayo de Lowry modificado (Fig.
3b) la misma cantidad de ácido húmico provocó undisminuciónen suelomi
extraer estimaciones de proteínas de alrededor del 25%.
3.4. Comparación de la precisión de la estimación entre Bradford y
Lowry
Usando extractos del Suelo 1, elaumentaen la estimación de proteínas
se
en respuesta a adiciones conocidas de BSA se presentan enFigura 4(a y b).
Se excluye el desarrollo de color debido a la proteína del suelo preexistente
0.000146 o directamente del polifenol agregado. En comparación con el 'ideal
0.000146
teórico' (línea 1: 1), utilizando estimaciones proporcionadas por el ensayo de
0.000146
Bradford (Figura 4a), supresión sustancial del desarrollo del color debido
170 MA Redmile-Gordon et al. / Biología y bioquímica del suelo 67 (2013) 166mi173

Fig. 3.a) Bradford y b) estimación de Lowry de proteína en extracto de suelo (suelo 1) con tampón,
Figura 2.a) Bradford y b) estimación de Lowry de la proteína en función de las adiciones de ácido incluidas las respuestas analíticas a las adiciones de BSA y HA.
húmico y proteína al tampón solo (HA0, 100, 200, 300 y 400 corresponden a adiciones de ácido
húmico de 0, 100, 200, 300 y 400 ppm, respectivamente) ).

a la proteína se produce, incluso para el extracto del suelo sin adición de HA. Esto adiciones de proteínas (Figura 4a), con adiciones de HA, solo el 95.20% de la
sería especialmente problemático si se cuantifica la proteína del extracto usando varianza puede ser explicada por el modelo de línea recta (Figura S2a), con
una curva de calibración generada en PBS (procedimiento común). Con el ensayo un 99,99% descrito por un polinomio de tercer orden (Figura S2b).
de Bradford, las regresiones lineales de las respuestas a la proteína añadida, en De manera similar, las regresiones lineales de los aumentos de absorbancia

comparación con el ideal teórico 1:1, muestran subestimaciones de las adiciones con el ensayo de microplacas de Lowry representaron el 99,71 % de la varianza en

de proteína iguales al 62, 69, 75, 81 y 86% (se 0,8%) para 0, Adiciones de 100, 200, respuesta a las adiciones de proteínas (Figura 4B). Sin embargo, aunque las

300 y 400 ppm de HA respectivamente. respuestas de Lowry a las adiciones de HA al búfer son, estrictamente hablando,

Por el contrario, utilizando el ensayo de microplacas de Lowry (Figura 4b), la mejor descritas por un polinomio de segundo orden (Figura S3b), el 99,78 % de la

subestimación de las adiciones fue sustancialmente menor, con subestimaciones varianza debida a las adiciones de HA puede explicarse mediante una línea recta

correspondientes de 13, 23, 28, 30 y 28 % (1,8 %) para adiciones de 0, 100, 200, 300 simple (Figura S3a). El ensayo de microplacas de Lowry dio una respuesta más

y 400 ppm de HA, respectivamente. Las estimaciones de proteínas analizadas en lineal que el ensayo de Bradford a las adiciones de polifenoles y proteínas a los

respuesta a las adiciones de BSA respondieron de manera similar entre el tampón extractos de suelo.

PBS enriquecido con HA y los 3 extractos de suelo.

3.6. Estimaciones del contenido de proteína del suelo

3.5. Supuestos de linealidad

Las estimaciones calculadas para todos los extractos (corregidas por
Mientras que las regresiones lineales de los aumentos de absorbancia utilizando el dilución) se presentan enTabla 4para referencia. Es importante recordar que
ensayo de Bradford representaron el 99,65 % de la varianza en respuesta a aunque el desarrollo del color a partir de proteínasper seutilizando el
 MA Redmile-Gordon et al. / Biología y bioquímica del suelo 67 (2013) 166mi173
Figura 4.El polifenol (HA) suprime el desarrollo de color de la proteína en a) análisis
Bradford yb) Lowry del extracto de suelo 1.
El ensayo de Bradford es más suprimido por la presencia de polifenol, es
compensado de forma variable por el desarrollo de color directamente del
polifenol mismo. Lo más probable es que esto explique la aparente
sobrestimación de la proteína en el suelo 3. Por el contrario, parece haber un
sesgo negativo en los suelos 1 y 2 en comparación con las concentraciones
proporcionadas por el ensayo de Lowry. Lo más probable es que esto se deba a la
supresión del desarrollo del color de la proteína, como se demuestra enFigura 4a,
es decir, donde la fracción de proteína es proporcionalmente mayor, el ensayo de
Bradford subestima. Los extractos del Suelo 1 y el Suelo 2 (manejos cultivables y
en barbecho, respectivamente) exhiben proporciones de polifenoles/proteínas
más bajas que el extracto del Suelo 3 (pastizales).
4. Discusión
Con respecto al contenido de proteína ensayado (Tabla 4), aunque el
desarrollo del color a partir de proteínasper seutilizando el ensayo de
Bradford se encontró que estaba altamente suprimido por la presencia de
polifenol (Figura 4a), esto fue compensado de forma variable (y no lineal) por
el desarrollo del color directamente de los complejos de polifenoles con
171
el tinte Bradford (Figura S2b). Lo más probable es que esto explique la aparente
sobrestimación de la proteína en el suelo 3 por el ensayo de Bradford en
comparación con el de Lowry. La sobreestimación se observó previamente con
extractos de suelo que contenían una gran fracción fenólica, por ejemploWhiffen
et al. (2007). El aumento de la relación AEH/proteína indicado por el ensayo de
Lowry para el suelo 3 está de acuerdo con los hallazgos deMartens et al. (2004)
donde la proporción de C orgánico presente como fenoles en los pastizales
también fue mayor que en el suelo cultivable: los pastizales son altamente
competitivos, y los fenoles se producen biológicamente como fitotoxinas
competitivas de alelopatía (Lipinska y Wanda, 2005) y como agentes de
señalización entre raíces y rizobios (Cesco et al., 2012), probablemente explicando
la alta proporción de AEH/proteína encontrada en el presente estudio. El
contenido fenólico del suelo es de mayor interés contemporáneo ya que se ha
relacionado con la dinámica de la materia orgánica del suelo en el contexto del
cambio de uso de la tierra, el clima y el CO2
emisiones, por ejemplo (Fernández et al., 2012).
Se cree que los extractos de citrato contienen una mezcla de bioquímicos de
los microbios del suelo, materia orgánica del suelo humificada y productos de
reacción de la extracción (Nannipieri y Eldor, 2009). En el estudio actual, según el
tipo de suelo, las estimaciones del contenido de polifenoles (mostrado como HAE)
fueron entre 5 y 10 veces mayores que el contenido de proteína. De Estado sólido
13Los espectros C DPMAS NMR de varios extractos 'GRSP' fueron presentados por
Schindler et al. (2007)mostrando un alto grado de aromaticidad pero poco C
alifático (41%mi51% y 4%mi 11%, respectivamente). Los autores resumieron que
esto era indicativo de una mayor proporción de compuestos orgánicos
humificados en comparación con el contenido de proteínas con BSA que mostraba
solo un 12 % de aromaticidad y un 54 % de contenido alifático. Las proporciones
de proteína/AEH que observamos se ubican cómodamente en el rango sugerido
por RMN.
No es posible comentar con precisión sobre la precisión de las
determinaciones de la proteína del extracto del suelo.per se (extracto de
suelo en ausencia de adiciones de BSA o polifenoles), porque actualmente
no existe un método universalmente aceptado para medir la proteína en los
suelos, y cada método está sujeto a artefactos idiosincrásicos (Nannipieri y
Eldor, 2009). Por lo tanto, en este estudio, la comparación de precisión se
basa en la suposición de que BSA, el estándar de referencia de proteína más
utilizado, es un buen modelo para la proteína del suelo. Aunque se han
planteado dudas con respecto a la idoneidad de utilizar una proteína no
microbiana como sustituto de la proteína en los suelos (Criquet et al., 2002),
BSA sigue siendo el modelo más utilizado, p.Taylor y Williams (2010)yYoung
et al., (2012)y hasta donde sabemos, ningún reemplazo está recibiendo
mucha consideración. El bien caracterizado estándar BSA (Wu et al., 2011)
por lo tanto, todavía se usa ampliamente como proteína de referencia.
Ahora se reconoce ampliamente que el procedimiento de extracción de
Wright y Upadhyaya (1996)extrae grandes cantidades de proteínas no
micorrizales del suelo e incluso proteínas termolábiles contribuyen a las
medidas de GRSP (Janos et al., 2008; Rosier et al., 2006). Sin embargo, las
determinaciones de Bradford de 'GRSP' o 'Proteína reactiva del suelo de
Bradford' (BRSP) siguen siendo comunes, y se encuentran repetidamente
buenas correlaciones con la estabilidad de los agregados y el C y N
orgánicos del suelo, p.Emran et al. (2012). Resulta quesila fracción reactiva
de Bradford sirve como una medida sustituta de la estabilidad de los
agregados o del contenido de materia orgánica, entonces lade facto La
medida GRSP aún puede ser útil. Sin embargo, si la motivación es una mejor
comprensión de la dinámica de la materia orgánica del suelo, o si vamos a
continuar estimando la proteína de los extractos (y no solo los extractos de
citrato), entonces las técnicas analíticas simples que son más selectivas para
'proteináceos' versus más 'polifenólicos' El material será más descriptivo.
Además, confundir estos depósitos mediante el uso del ensayo de Bradford
nublará las interpretaciones de las respectivas contribuciones de estas
fracciones orgánicas a las propiedades del suelo.
Es probable que en el futuro se requiera una medición rápida de la proteína del suelo
distinta de las piscinas altamente humificadas, por ejemplo, si vamos a intentar
cuantificar los impactos de la proteína microbiana que se encuentra dentro
172 MA Redmile-Gordon et al. / Biología y bioquímica del suelo 67 (2013) 166mi173
Tabla 4
Extraiga las concentraciones de proteínas (corregidas por dilución). Lowry modificado también proporciona una estimación de los compuestos fenólicos (como equivalente de HA: 'HAE').
Extraer Suelo 1
Estimación de proteínas Estimación de polifenoles
(ppm) (ppm)
bradford 163.7 2.4a mi
Lowry 187.5 3.3 1048 11
Relación AEH/Prot 5.6
a
Indica error estándar.
matrices extracelulares de comunidades microbianas enteras, y no atribuir
de manera engañosa la proteína extraíble y la materia orgánica humificada
colectivamente a AMF. Las proteínas microbianas extracelulares se producen
en vivocon una variedad de impactos sospechados sobre las propiedades
físicas del suelo (O et al., 2007). Las funciones estructurales de las proteínas
extracelulares se están explorando actualmente en disciplinas científicas
relacionadas y se cree que ayudan a impartir fuerza y elasticidad a las
biopelículas.Flemming y Wingender, 2010). Se cree que estos polímeros
extracelulares, producidos por la biomasa viva del suelo (incluidos HMA,
hongos saprofitos, bacterias y arqueas) mejoran la estabilidad de los
agregados, peso por peso, en mayor medida que la SOM total.Chenu, 1993;
Roberson y Firestone, 1992; Tang et al., 2011; Watts et al., 2005). Lo mismo
también se planteó originalmente para la glomalina (Wright y Upadhyaya,
1998) y desde entonces, muchos estudios informaron vínculos entre las
reservas de proteínas/polifenoles del suelo y la estabilidad de los agregados.
Posteriormente se estableció un vínculo causal firme entre AMF y la
estabilidad agregada a través de otros métodos, por ejemploRillig et al.,
(2010). Ahora se requiere una mayor comprensión del material proteico
extracelular de la comunidad en los suelos y, además de mejorar la
especificidad de los métodos de extracción, es probable que el paso más
importante sea evitar el mayor artefacto conocido que afecta actualmente a
los análisis colorimétricos, es decir, la interferencia del contenido
polifenólico.
5. Conclusión
El ensayo de Lowry modificado presentado aquí proporcionó una estimación
razonable del contenido de polifenoles y una estimación más precisa del
contenido de proteínas en extractos de citrato de 3 suelos contrastantes y
extractos modelo. Por lo tanto, tiene un valor potencial en estudios comparativos
de proteína extraíble total donde se espera que el contenido de polifenoles sea
alto.
Estos hallazgos nos llevan a agregar precaución contra el uso impreciso de los
términos 'proteína del suelo relacionada con la glomalina' (GRSP) y 'proteína del
suelo reactiva de Bradford' (BRSP) para describir la 'fracción reactiva de
Bradford' (BRF) en los extractos del suelo, que a su vez produce una respuesta
analítica muy compleja afectada por la relación AEH/proteína.
Agradecimientos
Marc Redmile-Gordon agradece al BBSRC por su financiación
(Doctoral Training Grant number D527069) y a los revisores por sus
útiles comentarios.
Apéndice A. Datos complementarios
Los datos complementarios relacionados con este artículo se pueden encontrar en
http://dx.doi.org/10.1016/j.soilbio.2013.08.017.
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Suelo 2 Suelo 3
Estimación de proteínas Estimación de polifenoles Estimación de proteínas Estimación de polifenoles
(ppm) (ppm) (ppm) (ppm)
33,1 0,3 mi 374.9 2.5 mi
49,0 0,5 274 2 328.8 10.6 3384 11
5.6 10.3
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