1.

Tincin de Wright
Esta coloracin es conocida como policromtica debido a que produce varios
colores. Es
una solucin de alcohol metlico de un colorante cido (eosina) y otro bsico
(azul de
metileno). El alcohol sirve como un fijador del frotis sanguneo al portaobjetos.
El
amortiguador, que consiste en una solucin tamponada, mantiene el pH del
colorante y
favorece la mejor absorcin por los diferentes componentes celulares.
Materiales:
Colorante de Wright: para 100 mL se requiere de colorante de Wright (0.3g),
metanol (97.0 mL) y glicerol (3.0 mL). Disolver en un mortero el colorante con
el
glicerol. Una vez disuelto se adiciona el metanol trasvasndolo a un frasco
oscuro.
Agitar. Filtrar antes de usar.
Solucin amortiguadora tamponada: en un litro de agua destilada se
agregan 3.76 g
de hidrofosfato disdico (Na2HPO4* 2H20) y 2.10g de fosfato de potasio
dihidrogenado (KH2PO4). Mezclar todos los reactivos y guardar en frasco de
vidrio
en lugar fresco. Ajustar el pH a 7.2.
Rejilla horizontal o soporte de tincin. Tcnica:
Colocar el frotis secado al aire sobre una rejilla o cubeta de tincin con la
sangre
hacia arriba (ver figura 4).
Cubrir completamente el portaobjetos o cubreobjetos con el colorante de
Wright
gota a gota. Dejarlo que permanezca en el frotis aproximadamente de 5-8
minutos,

para fijar los glbulos sanguneos. El colorante deber cubrir completamente el

portaobjetos, pero no debe derramarse por los bordes. Deber agregarse una
cantidad adicional si ste se comienza a evaporar.
Agregar directamente al colorante un volumen igual de amortiguador de
Wright,
para evitar la coloracin dbil. Esperar la formacin de brillo metlico. Puede
usarse
de igual manera agua desionizada. Dejar actuar de 10-15 minutos.
Lavar con agua en el chorro cuidadosamente hasta que la extensin
presente un
aspecto rosado al examinarlo a simple vista.
Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodn humedecido en
alcohol
para eliminar cualquier resto de colorante.
Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersin.
Resultados:
Los eritrocitos se observarn de color naranja o rosado. El citoplasma de
los monocitos presentarn una tonalidad azul griscea con grnulo
rojizos bastante finos y sus vacuolas caractersticas. El citoplasma de los
linfocitos
presentar varias tonalidades azules.
Los ncleos de los linfocitos y neutrfilos aparecern de color prpura
oscuro. Los
ncleos de los monocitos de color prpura algo ms claros (lila).
Los grnulos de los eosinfilos son de color rojo-anaranjado intenso. Los
grnulos
de los basfilos prpura azulado muy oscuro. Los grnulos de los neutrfilos se
aprecian de color lila, bastante finos.
Las plaquetas toman coloracin violeta o prpura.
Observaciones:

 Los tiempos varan de acuerdo a cada lote o tiempo de maduracin del

colorante.
De ah que si los frotis recin teidos resultan demasiado plidos se corrige
aumentando el tiempo de tincin o disminuyendo el tiempo de lavado.
Si en la preparacin se observa precipitados de colorante puede ser debido
a varias
causas: lavado insuficiente al final del proceso, utilizacin de porta o
cubreobjetos
sucios, mala filtracin del colorante, mala distribucin del colorante a lo largo
de la
extensin por no mantenerse en posicin horizontal.
Durante la tincin el tampn fosfato controla el pH del colorante. Si el
colorante es
demasiado cido la extensin resultar demasiado rojiza y si por el contrario es
demasiado alcalina la precipitacin presentar un aspecto azulado.

Acidfilos
Los microorganismos que tienen un crecimiento ptimo en niveles de pH inferiores a 5
se llaman acidfilos. Estos microbios se encuentran en varios entornos, incluyendo los
giseres y las piscinas sulfricas, as como en el estmago humano. Algunos ejemplos
de acidfilos son la microscpica alga Cyanidium caldarium y Dunaliella acidophila.
Los hongos microscpicos Acontium cylatium, Cephalosporium y Trichosporon
cerebriae pueden crecer en un pH cercano a 0. Un microorganismo primitivo llamado
Picrophilaceae tiene valores ptimos de pH prximos a cero y tambin puede crecer en
valores de pH negativos.

Alcalfilas
Los microorganismos alcalfilos tienen un crecimiento ptimo en valores de pH entre
9 y 12. Estos microorganismos crecen en lagos, suelos alcalinos y otros entornos de pH
alto. En los vertederos del lago Calumet, al sureste Chicago, el agua puede alcanzar un
pH de 12,8, que es similar a la soda custica. Algunas bacterias relacionadas con el
Clostridium y el Bacillus viven en ese ambiente extremadamente alcalino. El Lago
Mono en California y el Octopus Spring en el parque Yellowstone son ejemplos
deentornos donde se encuentran microorganismos alcalfilos.

Neutrfilos
Los valores de pH neutro, entre 6 y 8, son ms comunes en la naturaleza. A lo largo de
su evolucin, la mayora de los microorganismos se han adaptado para tener
crecimientos ptimos en entornos de acidez neutra. Estos microorganismos se
denominan neutrfilos e incluyen a la mayora de especies de microalgas y otros
organismos que forman el fitoplancton, as como algunas bacterias y levaduras que
viven en el suelo.

Los patgenos y el PH
La mayora de los microorganismos asociados con las enfermedades de humanos,
animales y plantas son los neutrfilos, tales como la Escherichia coli, que causa
infecciones intestinales; la Erwinia caratovora, un parsito de las plantas; la
Pseudomonas aeruginosa, que causa una serie de infecciones en humanos y animales;
y el Streptococcus pneumoniae, que causa neumona. Sin embargo, los agentes
patgenos se encuentran tambin entre acidfilos y alcalfilos. Las bacterias
Lactobacillus acidophilus tienen un crecimiento ptimo en niveles bajos de pH,
causando infecciones vaginales. La bacteria alcalfila Vibrio cholerae causa el clera en
los seres humanos.

Ciclo celular y control de la replicacin

El DNA tiene que duplicarse a lo largo del ciclo celular para que las clulas hijas tengan la misma
cantidad de DNA que la clula de que proceden. Por tanto ha de haber un acoplamiento perfecto
entre replicacin y divisin celular. El tiempo que tarda una clula en dividirse se llama tiempo de
generacin (T) que, en el caso de E. coli en condiciones ptimas de crecimiento (medio rico, 37
C, buena aireacin) es 20 min; si crecemos E. coli en condiciones limitantes este tiempo puede
alargarse hasta 60 min. El tiempo de generacin es variable y depende de las condiciones
ambientales de crecimiento. El tiempo que tarda el DNA de E. coli en replicarse se llama tiempo de
replicacin (C) y es de 40 min en condiciones normales. Desde que termina una ronda de
replicacin hasta que la clula se divide, pasa un tiempo de 20 min. que se llama D.
Como es que siendo C y D constantes T es variable ?. La velocidad de elongacin en la
replicacin es constante, es decir, las horquillas avanzan a la misma velocidad, pero la frecuencia
con que se inicia una ronda de replicacin no es constante. Esto significa que el control de la
replicacin se efecta a nivel de iniciacin, cuando la clula crece mas deprisa y por tanto T es
mas pequeo, el DNA no se replica ms rpidamente, sino que las rondas de replicacin se inician
con ms frecuencia, de hecho, en condiciones ptimas las rondas de replicacin se solapan, es
decir empieza una ronda antes de haber acabado la anterior.
El siguiente esquema muestra cmo estara el DNA de una clula con un tiempo de generacin de
60 min., el DNA se representa lineal para simplificar el esquema:

En el primer caso T = C + D. En el segundo T = C, por lo que C y D estn solapados, cada 40 min

se inicia una ronda de replicacin y nada mas terminar una comienza otra. No se sabe bien qu es
lo que controla la iniciacin de la replicacin, pero si se sabe por qu no hay reiniciaciones.
Una vez que se inicia una ronda, no debe iniciarse otra hasta pasado un tiempo T. Qu es lo que
bloquea la reiniciacin? En los 245 pb de oriC hay 12 secuencias GATC conservadas. Estas
secuencias son sustrato de la enzimaDam metilasa, que introduce un grupo metilo en una A
(dam = deoxyadenosin metilasa) de la secuencia GATC de un DNA hemimetilado (una banda
metilada y la otra no).:

La metilasa Dam no acta inmediatamente, sino que tarda unos 2 min. en metilar la hebra
complementaria. Las GATC de oriC tardan mucho ms, ver ms adelante. Durante estos dos
minutos dicho DNA hemimetilado constituye una seal que impide la reiniciacin (esto supone una
ventana a lo largo de la cual estas secuencias actan como seales de reparacin). Estas seales
interaccionan especficamente con la membrana que secuestra secuencias GATC hemimetiladas

(si ambas estn metiladas o ninguna est metilada no existe esta interaccin). El oriC secuestrado
en la membrana no es activo, esto es lo que explica que no haya una nueva iniciacin:

Existe una protena unida a la membrana llamada secA que impide que entre la DnaA. Las
secuencias unidas en la membrana tardan 10 min en metilarse del todo, despus se liberan de
dicha membrana, interaccionan con Dna A y se inicia otra ronda de replicacin.
Ese origen ha de activarse de forma sincronizada con la divisin celular. Lo ms lgico es pensar
que lo que controla la frecuencia de iniciacin son los niveles de protena DnaA, sin embargo s vio
que los niveles de DnaA no fluctan a lo largo del ciclo, sino que permanecen constantes. Lo que
vara en realidad es la cantidad de DnaA activa. Para que la protena, DnaA est activa y
reconozca las cajas DnaA, ha de estar desagregada y acomplejada con ATP. Esta es la
representacin de la hiptesis:

Replicacin del DNA eucaritico

De manera similar a los procariontes la replicacin eucaritica es semiconservativa, bidireccional,
semidiscontinua y tiene el mismo mecanismo general. La diferencias fundamentales de la
replicacin en eucariontes con respecto a la replicacin de procariticos radican en que:
1) La velocidad de elongacin es mucho menor: E. coli: 1000 nt/seg, levaduras: 60
nt/seg, Drosophila: 40 nt/seg, ratn: 30 nt/seg y sin embargo los DNAs son mucho ms grandes: E.
coli 4.6103 kb y en el humano ~1.5105 Kb, los DNAs eucariticos tardaran mucho en replicarse, lo
que ocurre es que:
2) Existen mltiples orgenes de replicacin (en E. coli slo haba uno).
3) No existen rondas de replicacin solapadas. En E. coli haba rondas de replicacin solapadas
que generaban tiempos de generacin cortos. Esto es algo inadmisible en eucariotas: la divisin
celular se da una vez se ha replicado el DNA, dicha replicacin solo ocurre en una fase concreta
del ciclo celular: la fase S.
4) Los fragmentos de Okazaki son ms cortos.
5) El control es ms complejo.
Sistemas modelo in vitro
Reconstruccin in vitro de un sistema que replique DNA. Se han purificado protenas vindose as
cuales son necesarias para replicar el DNA. Uno de los sistemas ms utilizados ha sido el del
virus SV40 (virus con DNA circular de doble banda). La ventaja del SV40 es que para replicar solo
se requiere una protena del virus, las dems son celulares. La protena requerida del virus es
el antgeno T que reconoce especficamente el origen de replicacin. A partir de aqu todo es
extrapolable a lo que ocurre en otros organismos eucarioticos. En la tabla se listan los
componentes del sistema celular HeLa que puede replicar el DNA del virus del simio SV40.
Las dos polimerasas y existen como un complejo que consiste de una subunidad cataltica de
180 kD asociada con otras subunidades, incluyendo dos pequeas protenas que le aporta
actividad primasa. DNA pol esta menos bien caracterizada. El sistema que replica el DNA
eucaritico in vitro se ha purificado, con la excepcin de las topoisomerasas todos los
componentes listados forman parte de la horquilla de replicacin.
Factores de replicacin eucariticos:

Protena

Funcin

DNA polimerasa /primasa

Sntesis del cebador

DNA polimerasa

Sntesis de DNA

PCNA

Le confiere procesatividad

Factor de replicacin C

Elongacin (Actividad ATP asa)

Factor de replicacin A

Se unen a DNA de simple cadena

Topoisomerasas I y II

Liberan superarrollamientos en el DNA parental

MF-1 (5 3 exonucleasa)

Elimina el RNA

DNA ligasa I

Sella mella

En la figura siguiente se muestra un modelo para el mecanismo de la replicacin en eucariontes:

1. La iniciacin en el origen de SV40 requiere el producto del virus, antgeno T que se une al
origen e inicia el proceso de separacin de las cadenas. (no se sabe en las clulas eucariticas
quien lleva a cabo esta funcin del anti T)

2. El factor de replicacin A (RFA) es una protena tipo SSB que se une al DNA y permite
desenrollar las cadenas ms extensivamente. La polimerasa existe como un complejo que
contiene la actividad cebadora.
3. La unin de pol inicia la sntesis de ambas cadenas del DNA. La reaccin cebadora es
inusual, comienza con RNA, como otras, pero el cebador es extendido por la actividad
polimerizante una secuencia de DNA (200 bases), llamada iDNA. El factor de replicacin C (RFC)
se une al extremo 3del iDNA y carga la DNA pol y PCNA (llamada as por razones histricas
Proliferating Cell Nuclear Antigen) que acta como un factor que confiere procesatividad a la pol .
La tuberculosis es una de las enfermedades ms antiguas en la historia de la humanidad. Se calcula que
habr cerca de 80 millones de casos de tuberculosis en la primera dcada del siglo XXI, una proporcin de los
cuales es muy probable que sea resistente a medicamentos. Aproximadamente un tercio de la poblacin
mundial es portadora de M. tuberculosis, y la OMS predice que, en el ao 2005, en los pases en desarrollo,
causar 8 millones de nuevos casos y de 3 a 4 millones de muertes por ao, ms que cualquier otro agente
infeccioso nico. Esto est atribuido primariamente a una respuesta inmune inadecuada del husped, lo cual
sugiere que se produce una inhibicin del crecimiento de la micobacteria ms que su destruccin, con la
ulterior multiplicacin catastrfica 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.
El agente causal de la tuberculosis fue descubierto en 1882 por Roberto Koch, es de aspecto bacilar recto y
alargado, mide 0.4 x 3 micras, pertenece al orden Actinomicetae, a la familia Mycobacteriaceae y al
gnero Mycobacterium 9, 10, 11.
El gnero Mycobaterium incluye ms de 100 especies que pueden clasificarse en seis grupos desde el
punto de vista bacteriolgico; con fines didcticos se dividen en tres apartados 13.
Complejo tuberculosis: Incluye las especies M. tuberculosis, Mycobacterium bovis (incluida la cepa BCG)
y Mycobacterium africanum, productoras todas ellas de tuberculosis, siendo el primero el que se asla con
mayor frecuencia. Se incluye tambin Mycobacterium microti, productor de tuberculosis en rata.
Complejo lepra: En el que se incluyen las especies M. leprae, productor de la lepra humana.
Otras Micobacterias: Algunas llegan a ser patgenas, otras pueden ser patgenas oportunistas y finalmente
otras suelen ser saprofitas. Producen las denominadas micobacteriosis.
Se caracteriza por ser un microorganismo intracelular obligado, aerobio, inmvil, que se replica dentro de los
fagosomas de los macrfagos6, 13, 14. Su tiempo de duplicacin es de 12 horas o ms por lo que su crecimiento
en medios de cultivo es muy lento. 15 Es sensible al calor, rayos ultravioleta y al sol directo, presenta
resistencia a cidos, alcoholes, lcalis, desinfectantes y a la desecacin; adems es naturalmente resistente a
muchos antibiticos debido principalmente a la envoltura celular altamente hidrofbica que acta como una
barrera permeable lo que hace difcil su tratamiento.13, 16
Su pared celular es compleja, posee un alto contenido de lpidos (40%), protenas y polisacridos; es rica en
cido miclico, el cual se encuentra unido covalentemente con glicolpidos tales como ,- tetrahalosa
dimicolato (TDM, cord factor) y ,trihalosa monomycolato (TMM). sta barrera permeable protege al
organismo del medio ambiente, contribuye a la persistencia de la enfermedad y a la resistencia a muchos
antibiticos a la vez que contribuye a la longevidad de la micobacteria. Inicia las reacciones inflamatorias del
husped y acta en la patognesis de la enfermedad15, 17, 18.
Estructura celular de M. tuberculosis12

Consta de un gruesa pared, separada de la membrana celular por el espacio periplsmico, con cuatro capas.
La mas interna es el glicopptido o peptidoglicano con molculas de N-acetilglucosamina y cido-Nglucolilmurmico, con cortas cadenas de alanina. Esta capa es el esqueleto de la bacteria que le da forma y
rigidez. Externamente, hay otras 3 capas compuestas: una por polmeros de arabinosa y galactosa, otra
formada por cidos miclicos (que son cidos grasos derivados y otra superficial formada por lpidos como los
sulfolpidos, el cord factor, llamado as por su aparente asociacin con la forma acordonada con que se
agrupan las micobacterias virulentas, y los micsidos.
Los principales antgenos de las micobacterias pueden dividirse en dos grandes grupos: los solubles o
citoplasmticos y los insolubles ligados a la pared celular
En relacin a la naturaleza de los antgenos solubles, se sabe que hay:
a) De naturaleza polisacrida: comunes a todas las micobacterias y constituidos por arabinomananos,
arabinogalactanos, glucanos.
b) Protenas: algunas estn bastante estudiadas. Entre ellas la denominada tuberculina vieja (OT) o el
Derivado Proteco Purificado (PPD). Tambin el antgeno 5 o el de 65 Kda.
c) Lipdica: los monsidos de fosfatidil inositol (PIM) constituyen una familia de lpidos polares que se
encuentran presentes en la membrana plasmtica de las micobacterias. Entre ellos podemos citar los
glicolpidos fenlicos, especficos para M. tuberculosis (PGL-Tbl).
d) El denominado antgeno 60 (Ag 60): es un complejo proteco-lipopolisacrido procedente del citoplasma y
de la membrana celular de M. bovis BCG y es comn a M. tuberculosis. M. bovis y otras micobacterias.
Las protenas del Mycobacterium son las que le confieren la propiedad antignica; ciento cincuenta de sus
1000 protenas han sido caracterizadas15. Las ms predominantes han sido aisladas, caracterizadas y
copiadas por sntesis qumica o sus genes han sido insertados en huspedes comoEscherichia coli, para la
reproduccin en gran escala de protenas recombinantes 19. Para su estudio se han agrupado en cuatro grupos
de acuerdo a su funcin, secuencia y caractersticas fsico qumicas:
El primer grupo formado por protenas de stress trmico (hsp, del ingls heat shock protein), son un grupo de
polipptidos esencialmente citoplasmticos, que incrementan su sntesis frente a estmulos estresantes como
los cambios en la temperatura, el incremento de dao oxidativo y la disminucin de nutrientes; esta respuesta
probablemente proteja a la micobacteria durante situaciones adversas, manteniendo la conformacin
funcional de protenas esenciales y asistiendo en la reduccin de protenas desnaturalizadas. Se agrupan en
familias dependiendo del peso molecular: hsp65 kDa o GroEL, hsp 10 kDa o GroES, hsp 70 kDa o DnaK, hsp
90 kDa, hsp 16 kDa entre otras. Estas protenas estn presentes tanto en clulas procariticas como
eucariticas; se conoce que estn altamente conservadas dentro y a travs de las especies, lo que ha llevado
a plantear la hiptesis de que la respuesta de las clulas T a determinantes compartidos de las hsp propias y
las del Mycobacterium tuberculosis tienen un papel importante en el desarrollo de las enfermedades
autoinmunes4, 15, 20, 21, ,22, 23, 24, 25, 26, 27.
El segundo grupo son las lipoprotenas, incluye a las de 19 kDa, 26 kDa, 27 kDa y 38 kDa, fundamentalmente
constitutivas de la pared celular pero pueden ser encontradas en el citoplasma, las de 19 y 38 kDa son las
ms importantes. Se considera que estas lipoprotenas estn involucradas en la induccin de respuestas
humoral y celular, en especial de la respuesta de las clulas T de memoria invitro, y tienen un papel funcional
en el transporte de nutrientes a travs de la pared celular 28,29. Un tercer grupo son las protenas secretorias,
estn constituidas principalmente por protenas de 15, 18, 23, 26, 27, 30, 31, 31.5 y 41 kDa, algunas de stas
forman el complejo 85 que es el mayor constituyente del sobrenadante de los cultivos delMycobacterium
tuberculosis30, 31, 32.

El ltimo grupo est constituido por las enzimas, la L-alanina deshidrogenasa de 40 kDa y la
superxidodismutasa de 23 kDa, que estn involucradas en los mecanismos de defensa del bacilo dentro de
los macrfagos.
Se est tratando de definir que antgeno o eptopo estimula las diferentes respuestas de las clulas T; la gran
mayora de los antgenos micobacterianos son llamados timodependientes, ya que necesitan de la
participacin de los linfocitos T cooperadores para generar suficientes respuestas humorales33.
El Mycobacterium presenta 30 diferentes sustancias antignicas que son capaces de despertar reacciones de
hipersensibilidad con destruccin celular34.
El antgeno 38 kDa antes conocido como antgeno 78, antgeno 5 o antgeno proteico b (pab), es una protena
de 38,000 daltones, que se ha identificado como una de las de ms alta especificidad para la deteccin de la
enfermedad. Es el mayor constituyente de lquido de cultivo de Mycobacterium tuberculosis. De las especies
de Micobacterias se encuentra slo presente en Mycobacterium bovis y Mycobacterium tuberculosis, su
concentracin en este ltimo es 10 veces superior. La secuencia de aminocidos de la protena 38 kDa posee
un 30% de homologa con una protena (PhoS) relacionada con la fijacin y el transporte de fsforo
en Eschericia coli, la cual se incrementa durante la disminucin de fosfato en el citoplasma.
El antgeno 38 kDa de la micobacteria posee diferentes eptopes localizados en la porcin central de la
molcula y en el carboxilo terminal, los cuales son capaces de inducir la proliferacin de clones de clulas T
especficos para M. tuberculosis, aunque algunos pueden tener reactividad cruzada. Una respuesta humoral
excesiva al 38 kDa parece tener significado patognico 11, 33, 35. La glicoprotena 38 kDa es una molcula
blanco para los CD8. La inmunodominancia del 38 kDa en las reacciones mediadas por anticuerpos y clulas
T se basa en su localizacin extracelular.
Lo anticuerpos dirigidos contra la protena 38 kDa se presentan en un alto porcentaje de pacientes con
Tuberculosis y tiene una alta especificidad para la enfermedad activa 35, 36. La mayora de pacientes produce
anticuerpos contra la protena 38 kDa, mientras que en los controles sanos no se encuentra.
Recientemente se demostr que la vacuna DNA de 38kDa est induciendo una inmunidad protectora en
ratones vacunados que se exponen a bacilos tuberculosos virulentos, lo que resulta en una disminucin de la
carga bacteriana. Este anticuerpo se une slo al antgeno hallado en M. tuberculosis y en BCG de M. bovis,
no produce una reaccin visible con otros sueros, por lo que el antgeno de 38 kDa parece ser
serolgicamente especfico. Debido a su alta especificidad, se considera que la protena 38 kDa puede llegar
a sustituir al derivado proteico purificado (PPD) en el diagnstico de la Tuberculosis4, 11, 33, 38, 39, 40, 41.
El antgeno 16 kDa es una protena de superficie, el ms potente inmungeno, una herramienta de gran valor
en el estudio del Mycobacterium, puesto que es altamente especfico. La localizacin celular es desconocida,
aunque se considera que est en la parte externa de la pared celular; en otras palabras, esta protena es
probablemente perifrica asociada con la membrana4, 42 . Forma un complejo de 9 subunidades especficas
con una masa total calculada de 144.9 kDa, pudiendo funcionar como chapern molecular in vitro en una
forma independiente del ATP.
Cuando hay infeccin por M. tuberculosis, la respuesta al xido nitroso (NO) produce el incremento en la
sntesis del homlogo alfa cristalino sHsp 16, que es una protena mayor de M tuberculosis producida por la
exposicin a intermediarios de nitrgeno reactivos37, 43, 44. El antgeno de 16 kDa es un antgeno
inmunodominante con valor serodiagnstico, lleva los eptopes restringidos al bacilo tuberculoso. La presencia
de la protena 16 kDa se eleva en casos de enfermedad activa o cuando se ha desarrollado una recada o el
bacilo se ha vuelto resistente a los frmacos, disminuye en caso de que exista una respuesta adecuada al
tratamiento. Los anticuerpos contra 16 kDa podran elevarse en respuesta a la infeccin an sin que la
tuberculosis sea clnicamente aparente, por lo que se considera como un marcador temprano de enfermedad,
adems de que puede utilizarse tambin en el diagnstico de la enfermedad en los nios.

MECANISMOS DE INTERCAMBIO
DE INFORMACIN GENTICA
La transferencia de ADN entre microorganismos puede ocurrir bsicamente por cuatro procesos : a)
transformacin, b) conjugacin, c) transduccin y d) sexduccin. Mediante estos mecanismos los
microorganismos pueden incorporar material gentico o donar material gentico dando lugar a formas
recombinantes.
Transformacin
Podemos definir el proceso de transformacin bacteriana como la capacidad que presenta una bacteria para
incorporar un fragmento de ADN que se encuentra en el medio externo. Este mecanismo fue descubierto en el
ao 1928 por F, Griffith en Streptococcus pneumoniae (transformacin de cepas rugosas no patgenas a
cepas lisas patgenas). Posteriormente Avery, Mac Leod y Mc Carty (1944) demuestran que el principio
transformante era el ADN (experiencia que muestra por primera vez que la informacin gentica estaba
codificada en las molculas de ADN).
En el proceso de transformacin natural el ADN a ser captado debe encontrarse en estado de doble cadena y
el nmero de molculas de ADN que puede captar una bacteria es limitado existiendo una cintica de
saturacin.
El fenmeno de transformacin ocurre en varias etapas, y la bacteria que va a recibir el ADN exgeno debe
encontrarse en estado "competente" (estado en el cual la bacteria es capaz de incorporar ADN del medio e
integrarlo al cromosoma bacteriano).
El estado de competencia depende de varios factores y es diferente para cada especie bacteriana. Los
factores que influyen son varios como la densidad celular del cultivo, temperatura, pH, nutrientes (fuente
de carbono o de nitrgeno). Las bacterias pueden llegar al estado de "competencia" cuando se acercan al
final de la fase de crecimiento exponencial y entran en la fase estacionaria. En el estado de "competencia" en
general se encuentran entre un 10% a 20% de la poblacin bacteriana aunque esto puede variar segn la
especie bacteriana. Por ejemplo el Streptococcus pneumoniae el estado competente afecta al 100% de las
clulas
durante la etapa exponencial mientras que el Bacillus subtilis solo entre el 1 y el
20% se encuentran en estado competente y este se manifiesta en la etapa estacionaria. El primer paso de la
transformacin consiste en la unin de la molcula de ADN a la superficie de la clula bacteriana. Por ejemplo
el Streptococcus pneumoniae presenta entre 20 y 50 puntos de unin. Una vez que el ADN se une, sufre una
serie de cortes en las dos cadenas mediante la accin de endonucleasas. Cuando los fragmentos de ADN
entran a la clula, pierden una de las dos cadenas. En el interior de la clula, el ADN forma un complejo
con protenas quedando protegido de la ADNasa I.
Existe en este momento un estado denominado fase de eclipse cuando el ADN que entr por transformacin
(exogenote) si sale de la clula no va a poder ejercer el efecto transformante.
Este ADN posteriormente se integra al cromosoma bacteriano en zonas de homologa de secuencias.
Conjugacin
Lederberg y Tatum en 1946 descubren un proceso por el cual las clulas de E. coli
pueden intercambiar material gentico mediante un contacto fsico entre ellas (fig
1). Hoy da este fenmeno tiene gran importancia evolutiva y ecolgica puesto que la transferencia de ADN
puede establecerse no solo entre clulas de la misma cepa bacteriana sino entre especies distintas y alejadas
evolutivamente. El plsmido F conocido originalmente como factor de fertilidad fue el primero que se
descubri que poda pasar de una bacteria donante a una receptora mediante el mecanismo de conjugacin
(fig 2).
El plsmido F es de tipo conjugativo y tiene la capacidad de interaccionar con el cromosoma bacteriano e
integrarse en l (forma denominada "episoma")
El contacto fsico se establece mediante la formacin de un "pelo" o "pili" sexual constituido por protenas.
Para la formacin del "pili" intervienen no menos de 16 productos gnicos. Dentro de las bacterias donantes
se pueden diferenciar tres
+
tipos 1) las F
, que presentan al plsmido F y pueden transferirlo, 2) las Hfr

(clulas de alta frecuencia de recombinacin) que contienen al factor F integrado en su propio cromosoma
bacteriano, y lo pueden transferir junto con genes bacterianos, y 3) las F' (F-prima) que son clulas Hfr que
portan el genoma del factor F pero este tiene la capacidad de excindirse y recircularizarse (forma de plsmido)
llevando consigo genes bacterianos. El primer factor F-prima (F') fue aislado por Jacob & Adelberg y llevaba
genes del opern Lac . A este fenmeno de transferencia de F' de una bacteria donante a una receptora se le
conoce con
el nombre de sexduccin. A las bacterias receptoras se le denomina F
, ellas no
contienen al plsmido F y lo reciben de las bacterias donantes . Previo al proceso de conjugacin, el Plsmido
F se replica y transfiere su informacin a la clula F- convirtindola en F+ sin perder ella misma dicha
capacidad.

Fig 1: Observacin al microscpio electrnico del mecanismo de

Conjugacin.

Fig 2 : Mapa fsico y funcional del plsmido F (100 Kb).

Transduccin
Este mecanismo se puede definir como la transferencia de material gentico no vrico de una bacteria a otra
por intermedio de un bacterifago. Estos fagos llevan la informacin gentica de la bacteria en el interior de su
cpsida (partculas transductoras) (fig 3).
Originalmente este fenmeno se describi en Salmonella aunque hoy se conoce en distintas especies
bacterianas. Varios fagos presentan capacidad transductora como el P1, T4, Mu y el fago ?. Existen dos tipos
de transduccin:, a) la transduccin generalizada en la cual el fago puede portar un fragmento cualquiera del
genoma bacteriano, b) la transduccin especializada en la cual el fago lleva informacin de regiones
especficas del cromosoma bacteriano (ej el opern gal de E.coli en el fago ? ) pudiendo transducir e infectar.

Fig 3: Esquema general del proceso de transduccin.

TRANSPOSONES
Se conocen tambin con el nombre de elementos genticos mviles, genes saltarines, casetes, etc. Los
primeros genes saltarines los descubri Barbara McClintock en la dcada del 40 cuando estudiaba la gentica
del maz y en 1967 se descubren en organismos procariotas (E.coli). Son secuencias de ADN que tienen la
capacidad de saltar de un lugar a otro del genoma. Los transposones
ms simples se denominan elementos IS (secuencias de insercin) y presentan una regin central de 700 a
1500 bp rodeados de una secuencia invertida de 10 a
30 bp. En la regin central se encuentran los genes encargados de realizar el salto o transposicin. Tambin
se encuentran los llamados transposones compuestos que presenta una regin central rodeada por dos
elementos IS, estos transposones llevan informacin gentica adicional. En el mecanismo del salto o
transposicin intervienen enzimas tales como la transposasa (produce cortes) y la resolvasa (acta en el
proceso de recombinacin).
En algunos casos el elemento mvil puede replicarse antes de saltar dejando una copia en el lugar original
mientras que otras veces puede saltar sin dejar copia e insertarse en otra regin del genoma. Estos
elementos genticos mviles los podemos encontrar tanto en el cromosoma bacteriano como en plsmidos y
pueden ser transferidos entre bacterias por los mecanismos de conjugacin, transduccin y transformacin.

MUTACIN EN MICROORGANISMOS
El material gentico de un microorganismo puede alterarse por factores endgenos (origen espontneo) o
exgenos (origen inducido). Existen distintos niveles mutacionales, por ejemplo cuando la mutacin tiene un
efecto puntual en un gen se denomina mutacin gnica mientras que si esta afecta a diversas partes del
genoma, la denominamos mutacin genmica. Si la mutacin afecta la estructura del cromosoma (en
bacterias) o de los cromosomas (microorganismos eucariotas; levaduras) las denominamos mutaciones
cromosmicas. Al hablar de mutaciones en microorganismos debemos tener en cuenta la variabilidad
microbiana existente as como el tamao de sus genomas (Tabla 1).
Microorganismo s
E. coli
H. influenzae
H. pylori
Mycoplasma pneumoniae

Saccharomyces cerevisie
Tabla 1: Comparacin de genomas de distintos microorganismos
Las mutaciones que afectan al fenotipo del microorganismo nos permiten diferenciarlo en algn carcter en
particular respecto del microorganismo con fenotipo "normal" que sirve de referencia (fenotipo silvestre).
En ltima instancia los fenmenos mutacionales tienen su efecto a nivel de la molcula de ADN y pueden
verse alteradas secuencias o elementos necesarios para la expresin de un gene o de varios genes
(promotores, secuencias reguladoras, terminadores, etc.). Por otro lado las mutaciones pueden afectar
secuencias moduladoras tales como operadores.
Las clulas bacterianas crecen y se dividen d tal forma que en uno o dos das una clula origina millones de
ellas, todas genticamente idnticas (clones). Las clulas que derivan de una de ellas se mantienen juntas
formando la colonia bacteriana (visible al ojo humano, aproximadamente 10 millones de bacterias). Por lo
tanto la colonia constituye la unidad ms importante para la identificacin de clulas mutantes. Uno de los
desafos del genetista microbiano consiste en disear estrategias experimentales para el reconocimiento de
colonias mutantes; a tales efectos se emplean los procesos de rplica, seleccin y contraseleccin (Fig 4).
Actualmente existe tecnologa adecuada y costosa para poder identificar clulas mutantes en forma separada
o sea que mediante estos mtodos, la clula pasara a ser la unidad de identificacin de fenotipos mutantes.
Una de las tcnicas de anlisis reciente de clulas es la citometra de flujo; que consiste en tratar a una
poblacin celular con un agente mutagnico y luego se hace pasar por un tubo capilar iluminado por un rayo
de luz que analiza varios parmetros celulares (tamao, transparencia celular, emisin de fluorescencia).
Posteriormente mediante un sistemaseparador es posible obtener clulas aisladas con diferentes
caractersticas. La posibilidad de marcar a las clulas con compuestos fluorescentes aumenta las
posibilidades de separacin de las mismas en un citmetro de flujo.

Fig 4: Procedimientos para la bsqueda de colonias mutantes. Mediante la rplica se comparan copias
idnticas de colonias en dos o ms cajas de Petri con distintos medios de cultivo (por ejemplo: medio
completo y medio mnimo para identificar mutantes auxtrofos) o tambin con igual medio de cultivo pero
distintas
condiciones de temperatura (por ejemplo: cultivos a 30 C y cultivos a 40 C, para identificar microorganismos
termosensibles). El sistema de seleccin utiliza el agregado de sustancias que matan a unas clulas mientras
que otras no se ven afectadas. El sistema de contraseleccin se utiliza para la identificacin y anlisis de las
colonias mutantes ya que se eliminan primero las que crecen y posteriormente se dejan crecer en condiciones
ptimas a las colonias supervivientes.

Prottrofo: Cepa de microorganismo capaz de crecer en un medio mnimo definido a partir del cual puede
sintetizar la totalidad de las molculas biolgicas complejas que requiere.
Auxtrofo: Cepa de microorganismo incapaz de sintetizar una molcula orgnica determinada necesaria para
su crecimiento. Se produce su crecimiento cuando se
suministra en el medio de cultivo el compuesto requerido.
Son frecuentes las mutaciones?
En general las mutaciones espontneas son poco frecuentes. Para cuantificar las mutaciones se suelen usar
dos parmetros a) tasa de mutacin, y b) frecuencia de mutacin.
La tasa de mutacin nos mide la tendencia que tiene un gen de sufrir mutaciones, y se expresa como el
nmero de mutaciones que ocurren por cada unidad que mida la oportunidad de mutar. Dicha unidad puede
ser el tiempo de generacin celular o de divisin celular (tiempo biolgico).
Por frecuencia de mutacin se entiende como la frecuencia de aparicin de un mutante en la poblacin final
de bacterias.

Ejemplo: Tasa de mutacin ser el cociente entre un evento mutacional (M) en 7 divisiones celulares reales.
Mientras que la frecuencia mutacional se calcular como el cociente entre la frecuencia de clulas mutadas en
el total final de la poblacin (2/8= 0.25).

Test de AMES
Dicho test fue desarrollado por el microbilogo Bruce Ames con la finalidad de poder determinar el poder
mutagnico de determinadas sustancias qumicas. Este nos permite en forma rpida evaluar aquellas
sustancias qumicas que pueden tener poder carcinognico.
En este tipo de anlisis se parte de la premisa de que si una sustancia qumica ocasiona dao en el ADN con
un efecto mutagnico, tambin pueden llegar a tener un efecto carcinognico. A pesar de esto existen
sustancias que causan cncer en animales de laboratorio y son negativas al mismo.
En el test de Ames se emplean diferentes cepas de la bacteria Salmonella typhimurium de las cuales se le
conocen los tipos de mutaciones que presentan. Estos mutantes han perdido la capacidad de sintetizar el
aminocido histidina (His) por lo tanto se dice que son histidina auxotrficos (His-) pues solo crecen en medios
de cultivo a los que se les adiciona dicho aminocido. Las cepas salvajes de Salmonella typhimurium
contienen todas las enzimas necesarias para fabricar el aminocido His (cepas prototrficas, His +).
Por lo tanto se evaluara la capacidad o habilidad que presentan determinados compuestos qumicos para
producir mutaciones revertientes (back mutation) o sea que las cepas mutantes histidina auxotrficas reviertan
a cepas salvajes de Salmonella typhimurium (prototrficas) (Fig 5).

Los principales tipos de mutaciones observadas son a) de cambio del marco de lectura de genes, que traen
como consecuencia una traduccin errnea de los mismos y b) mutaciones puntuales con sustitucin de una
base produciendo un cambio en la secuencia aminoacdica de la protena codificada por dicho gen.
Las cepas de Salmonella typhimurium que se utilizan en el test han sido seleccionadas basndose en la
sensibilidad a sufrir mutaciones. Estas cepas presentan una serie de caractersticas: a) un aumento de la
permeabilidad de la pared celular para permitir el ingreso rpido de la sustancia a testar (mutantes rfa), b)
mutaciones en el sistema de reparacin de daos en el ADN (mutantes uvrB)
,c) plsmidos R y plsmidos multicopias que agregan errores durante la accin del sistema reparador de
daos del ADN. Estas cepas se conocen con el nombre de TA97A, TA98, TA100, TA102 y TA1535.
Con el correr de los aos se observ que existan sustancias que si bien no eran mutagnicas pero que al ser
metabolizadas en organismos superiores producan metabolitos intermediarios que si tenan capacidad
mutagnica y podan ser potenciales carcnogenos. Para solucionar parcialmente este problema; al medio de
cultivo empleado en el test de AMES se le adicion una mezcla de enzimas de hgado de rata para simular
el metabolismo que sufre la sustancia en un organismo superior. Este sistema que simula al hgado de un
mamfero se conoce
con el nombre de S-9 y nos permite detectar metabolitos intermediarios posiblemente carcinognicos.
Las ventajas del empleo de dicho test son muchas: es rpido (las bacterias crecen y se dividen rpidamente),
es muy simple (El tiempo aproximado para obtener un resultado final en este test es de 30 das), tiene
bajo costo econmico, es posible testar varias sustancias al mismo tiempo, utilizando las mismas condiciones
es repetible el resultado obtenido.

Figura 5: Se observa una versin cualitativa del test de Ames. En la placa de Petri se sembraron cepas de
Salmonella typhimurium que requieren His para su crecimiento (auxotrficas, His- ). El disco de papel blanco
esta impregnado con una sustancia carcinognica (2-aminofluorine). Dicha sustancia produce un efecto
mutagnico en dicha cepa y se observa crecimiento de diversas colonias alrededor del disco (los mutantes
His- mutan a cepas prototrficas que crecen en un medio carente de His).

Resistencia Microbiana a sustancias antibiticas

En los ltimos aos el avance de la industria farmacutica permiti generar nuevos antibiticos artificiales
para el tratamiento de enfermedades infecciosas.
Por otra parte esto genero una adaptabilidad de los microorganismos producto del desarrollo de resistencia.
Durante los aos de 1940 al 1950 el uso de las sulfamidas y penicilinas produjo el surgimiento de cepas
bacterianas resistentes a esas drogas constituyendo un serio problema.
En Inglaterra el uso de penicilina G produjo en los staphylococcus aureus un aumento de la frecuencia de
cepas resistentes del 10% al 60%. Existe una fuerte base gentica que permite explicar la resistencia
bacteriana a determinadas drogas. Dentro de los mecanismos genticos-moleculares podemos citar: 1) la
capacidad de que se generen nuevas mutaciones en genes localizados en el cromosomas bacteriano,
2) introduccin de plsmidos R. Estos pueden pasar de una cepa bacteriana a otra mediante conjugacin.

Los plsmidos R presentan una serie de ventajas adaptativas: a) han evolucionado como respuesta a
la presin selectiva del ambiente como ser, los distintos antibiticos utilizados por humanos, b) presentan
genes de resistencia a mltiples sustancias antibiticas, c) pueden trasladarse entre bacterias de la misma
especie o de especies diferentes, d) presentan elementos genticos mviles o transposones, e) al no existir
presin selectiva (utilizacin de antibiticos) las clulas bacterianas los van perdiendo como una forma de
"economa" f) no interfieren con otros genes bacterianos por lo cual las bacterias se desarrollan normalmente
mostrando todo su potencial fenotpico.
En el tema de la resistencia, los seres vivos ms abundantes del planeta (las bacterias) nos permiten
comprobar la teora "Darwiniana" de la supervivencia de los ms aptos. Como mecanismos bioqumicos
implicados en el fenmeno de la resistencia podemos citar : disminucin en la permeabilidad a absorber el
antibitico, inactivacin enzimtica de la sustancia antibitica, modificacin del "blanco" o "diana" sobre la que
acta el antibitico, sntesis de una enzima de resistencia.
La disminucin de la permeabilidad puede estar dada por: modificaciones a nivel de la membrana externa
(barrera natural), por la existencia de mecanismos de bomba de expulsin que enva al exterior al antibitico
luego de su entrada, alteraciones en el mecanismos, por alteraciones en el mecanismo de transporte del
antibitico.
En el caso de las tetraciclinas por ejemplo hay bacterias que presentan transposones tipo el Tn10 o el Tn1721
que codifican protenas con la funcin de expulsar al antibitico desde el interior al exterior de la clula. En el
caso de los antibiticos beta-lactmicos (penicilina, cefalosporina) los plsmidos R presentan genes que
codifican para enzimas beta lactasas (penicilasas, cefalosporinasa) que abren el anillo lactmico y hacen que
el antibitico pierda su accin. En el caso de la resistencia generada al cloranfenicol , esta viene dada por una
enzima inactivante del mismo, denominada cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT). Uno de los genes que
codifica para la CAT forma parte del transposn Tn9 . La presin selectiva contnua va generando nuevos
mecanismos de resistencia como la creacin de nuevas enzimas resistentes.

RESISTENCIA BACTERIANA Y SU RELACIN CON LA

BIOTECNOLOGA
La construccin biotecnolgica a gran escala de plantas modificadas genticamente (plantas transgnicas)
plantea una serie de problemticas. Una de ellas es la posibilidad de generar resistencia a los antibiticos por
parte de las bacterias que habitan el mismo ecosistema. Este fenmeno podra producirse mediante
la migracin de genes de resistencia antibitica desde la planta transgnica a las bacterias.
Este efecto boomerang (retorno de los genes hacia las bacterias) podra generar bacterias con alta resistencia
a los antibiticos, patgenas para el hombre y los animales (Fig 6).
El proceso de transgnesis supone la introduccin de un gen extrao, llamado transgn en el genoma de un
organismo vivo. Este transgn aportar una ventaja
ecolgica, nutricional, farmacutica, o permitir avanzar en las investigaciones sobre regulacin gnica en
eucariotas. Para la realizacin de este proceso en los laboratorios de biologa molecular es necesario
manipular los genes para obtener la clonacin de los mismos. Esta tcnica exige el uso de vectores de
clonacin
portadores de genes de resistencia a sustancias antibiticas (tabla 2).
Nombre del gen
Bla TEM-1
aph 3'-2 (NPTII)
Aph 3'-3

Aad
Tabla 2: genes de resistencia a sustancias antibiticas ms frecuentemente utilizados en los procedimientos
de transgnesis en vegetales.
Actualmente se ha demostrado que las transferencias de ADN pueden establecerse entre reinos muy alejados
como el procariota (bacterias) y el reino vegetal. En este caso estaramos hablando de transferencia entre un
organismo eucariota (planta transgnica) y un organismo procariota (bacteria). Dicho proceso se muestra
favorecido por el cultivo intensivo de una planta que porta un gen de resistencia a un antibitico provocndose

un aumento del nmero de copias de este gen en el ecosistema. En teora este proceso es totalmente viable
de ah la preocupacin de las empresas biotecnolgicas destinadas a la produccin de plantas mejoradas por
estas tcnicas.
La transferencia horizontal de informacin gentica se efecta en tres etapas: a) transferencia del ADN, b)
estabilizacin del mismo en un nuevo ser vivo (husped receptor), c) expresin del gen en dicho husped.

Fig 6: Bacterias patgenas (Staphylococcus aureus) que desarrollan una resistencia cada vez mayor a los
antibiticos de uso frecuente. Problema preocupante en hospitales de salud
humana y salud animal.
Cmo puede transferirse un gen de resistencia antibitica desde una planta transgnica a una bacteria?
El efecto boomerang del cual hablamos puede producirse por dos mecanismos. El primero de ellos podra
ocurrir en el tubo digestivo de animales o seres humanos que ingieren una planta transgnica o un derivado
de la misma. Pensemos que en el tubo digestivo encontramos una gran variedad de cepas bacterianas
comensales que se encuentran en distintos estados fisiolgicos. Algunas bacterias podran encontrarse en
estados de competencia donde por permeabilidad pueden recibir un gen codificador de resistencia antibitica
liberado por la planta durante la digestin (ej. gen bla TEM-1 de 858 bp). A su vez el contacto ntimo entre las
bacterias podra favorecer el intercambio de este material gentico dentro del tubo digestivo (transferencia
horizontal entre distintas especies bacterianas) generndose cepas resistentes. El segundo mecanismo
mediante el cual puede generarse el efecto boomerang sera el pasaje de genes desde la planta transgnica
en descomposicin (races) hacia bacterias del suelo. Este mecanismo se ve favorecido por la resistencia y
estabilidad de la molcula de ADN en los suelos y por la eficacia de las bacterias del suelo para incorporar
material hereditario.
Cmo puede estabilizarse el o los genes de resistencia incorporados?
La estabilizacin de dichas secuencias de ADN puede realizarse por la llamada recombinacin homloga
entre secuencias que estn a ambos lados del gen de resistencia y el ADN de la clula bacteriana receptora.
Holliday en 1964 propone un modelo de recombinacin mediante el proceso de rotura-reunin donde se
constituye un ADN hbrido e intervienen una serie de protenas (RecA, RecBCD, ligasas) (fig 7). En este
proceso de estabilizacin, el gen se incorporar al cromosoma bacteriano y se transmitir a la descendencia
de manera estable.
Otro de los procesos de estabilizacin de material gentico extrao puede darse a travs de elementos
genticos mviles (transposones) o plsmidos no
integrativos. En estos casos la transmisin puede ser vertical (a la descendencia)
u horizontal (entre bacterias).
Qu alternativas existen para evitar estos problemas?
Si bien los genes de resistencia a sustancias antibiticas son los ms utilizados como marcadores de
seleccin en las tcnicas de ingeniera gentica, una de las alternativas viables sera sustituir a dichos
marcadores por otros menos problemticos. Actualmente se empez a utilizar un gen de resistencia a un
herbicida que sera de mayor utilidad en los procesos de seleccin de plantas transgnicas.

Otra solucin sera realizar construcciones separadas o sea el gen marcador y el gen de inters (transgn) e
integrarlos en sitios diferentes del genoma para posteriormente realizar cruzamientos entre estas plantas
transgnicas y seleccionar aquellas que solo heredan el transgn y no el gen marcador.
La tercer alternativa consistira en colocar a ambos lados del gen marcador secuencias especiales que
posteriormente con la utilizacin de enzimas de restriccin se podran cortar y eliminarlas junto con el gen
marcador.

Fig 7: Modelo de Holliday para explicar los fenmenos de recombinacin gentica.

DIRECCIONES DE INTERNET DE IMPORTANCIA EN

GENTICA MICROBIANA

Leer ms: http://www.monografias.com/trabajos94/genetica-microbiana/geneticamicrobiana.shtml#ixzz389O4URwT