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Principio Físico

Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas


Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

ELECTROFORESIS

Abelino Vargas Jiménez1

1, Curso de Biofísica

Universidad de la Salle

Bogotá, 2020

Abelino Vargas Jiménez


Principio Físico
Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Contenido

1 Principio Físico

2 Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas

3 Electroforesis de Proteínas

4 Electroforesis de ADN

Abelino Vargas Jiménez


Principio Físico
Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Sección 1 Principio Físico

Abelino Vargas Jiménez


Principio Físico
Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Campos de Fuerza y Movilidad

Al someter una partícula, que se encuentra inmersa en un medio, a un


campo de fuerza se genera en esta un movimiento con velocidad
constante (velocidad límite).
1 Esta velocidad limite se alcanza por la dependencia de la fuerza
de fricción con la velocidad y la forma del cuerpo.

Abelino Vargas Jiménez


Principio Físico
Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Campos de Fuerza y Movilidad

Al someter una partícula, que se encuentra inmersa en un medio, a un


campo de fuerza se genera en esta un movimiento con velocidad
constante (velocidad límite).
1 Esta velocidad limite se alcanza por la dependencia de la fuerza
de fricción con la velocidad y la forma del cuerpo.
2 Al alcázar esta velocidad limite se puede definir un coeficiente
constante denominado MOVILIDAD.

Abelino Vargas Jiménez


Principio Físico
Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Campo Gravitacional

En el caso del campo gravitacional se puede considerar un objeto que


cae en la superficie de la Tierra o un objeto que cae en un fluido como
el agua.

Abelino Vargas Jiménez


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Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Campo Gravitacional

En el caso del campo gravitacional se puede considerar un objeto que


cae en la superficie de la Tierra o un objeto que cae en un fluido como
el agua.

Abelino Vargas Jiménez


Principio Físico
Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Campo Gravitacional

En el caso del campo gravitacional se puede considerar un objeto que


cae en la superficie de la Tierra o un objeto que cae en un fluido como
el agua.

Abelino Vargas Jiménez


Principio Físico
Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Campo Gravitacional

La ecuación de una esfera que cae en un fluido viscoso es:

Al alcanza su velocidad limite la aceleración es cero (a = 0),


recordando de la ley de Stokes y el principio de Arquímedes, se llega
a:

6πRηv + ( ρf Vesf ) g − ( ρesf Vesf ) g = 0 (1)

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Campo Gravitacional

La ecuación de una esfera que cae en un fluido viscoso es:

Al alcanza su velocidad limite la aceleración es cero (a = 0),


recordando de la ley de Stokes y el principio de Arquímedes, se llega
a:

6πRηv + ( ρf Vesf ) g − ( ρesf Vesf ) g = 0 (1)

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Electroforesis de ADN

Campo Gravitacional

La ecuación de una esfera que cae en un fluido viscoso es:

Fr + FE − mg = −ma

Al alcanza su velocidad limite la aceleración es cero (a = 0),


recordando de la ley de Stokes y el principio de Arquímedes, se llega
a:

6πRηv + ( ρf Vesf ) g − ( ρesf Vesf ) g = 0 (1)

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Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
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Electroforesis de ADN

Campo Gravitacional

Despejando de la ecuación (1) la velocidad y escribiéndola en


términos del diámetro:

d 2 ( ρesf − ρf )
!
U =v = g = Sg (2)
18η
Donde S es la movilidad que en este caso se llama coeficiente de
sedimentación

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Campo Gravitacional
Simulación de la velocidad en función del tiempo de una partícula que
cae en un fluido.

Figura: Simulación de Velocidad Límite

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Campo Eléctrico

Ahora al someter una partícula (molécula) a un campo eléctrico


uniforme se genera en ésta una fuerza que esta dada por:

Fe = qE
Donde q es la carga y E la intensidad del campo eléctrico. La
partícula al moverse en un medio experimenta una fuerza de fricción,
que esta asociada con su velocidad, entonces:

Fe − Fr = ma
Al alcanzar su velocidad limite la aceleración es cero (a = 0):

qE − 6πRηv = 0 (3)

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Campo Eléctrico

Despejando de la ecuación (3) la velocidad:


!
q
U =v = E = µE (4)
6πRη
µ es la movilidad electroforetica, que también puede ser expresada
como:

Ze
µ=
6πRη
Donde Z es el número de electrones y e la carga del electrón. Es
importante tener en cuenta que en el caso de las proteínas su carga
depende del pH del medio, por lo tanto un cambio de pH en el medio
puede afectar la movilidad de la proteína.

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Movilidad

La velocidad U puede ser escrita de forma general como el producto


de la intensidad del campo ζ y la movilidad generalizada m, la cual
depende de las propiedades físicas de la partícula (molécula).

Velocidad Inducida

U= m ζ (5)

Movilidad

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Electroforesis de ADN

Movilidad

La velocidad U puede ser escrita de forma general como el producto


de la intensidad del campo ζ y la movilidad generalizada m, la cual
depende de las propiedades físicas de la partícula (molécula).

Velocidad Inducida

U= m ζ (5)

Movilidad

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Electroforesis de ADN

Movilidad

Campo(ζ ) Velocidad Inducida (U) Movilidad(m)


!
d 2 |4ρ| d 2 |4ρ|
Gravitational Ug = 18η
g S = 18η ; Coeficiente de sedimentación

 
q q
Eléctrico Ue = 6πRη E µ = 6πRη ; Movilidad electroforetica

!
d 2 |4ρ| d 2 |4ρ|
Centrifugo Uc = 18η
r ω2 S = 18η ; Coeficiente de sedimentación

d4χ d4χ
 
Magnético Um = 48η 4H 2 m = 48η

Abelino Vargas Jiménez


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Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Movimiento Browniano

Si se tienen partículas o moléculas menores que 1µm, también están


sometidas a un movimiento aleatorio, movimiento Browniano

El cual es un efecto del movimiento molecular. Los geles en la


electroforesis limitan este movimiento.
Abelino Vargas Jiménez
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Sección 2 Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas

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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Carga Eléctrica Proteínas


La carga eléctrica de las proteínas depende del pH del medio.

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Electroforesis de ADN

Carga Eléctrica ADN y RNA

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Electroforesis de ADN

Sección 3 Electroforesis de Proteínas

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Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

La electroforesis de proteínas permite:


Hacer una estimación rápida del número de proteínas en una
mezcla.

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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

La electroforesis de proteínas permite:


Hacer una estimación rápida del número de proteínas en una
mezcla.
Hacer una estimación del grado de pureza de una preparación
proteica determinada.

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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

La electroforesis de proteínas permite:


Hacer una estimación rápida del número de proteínas en una
mezcla.
Hacer una estimación del grado de pureza de una preparación
proteica determinada.
Determinar propiedades cruciales de una proteína tales como su
punto isoeléctrico y su masa molecular aproximada.

Abelino Vargas Jiménez


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Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Montaje

Al hacer una electroforesis de proteínas se debe tener en cuenta que:


Se debe hacer generalmente en geles de poliacrilamida.

q Ze
µ= =
6πRη 6πRη

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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Montaje

Al hacer una electroforesis de proteínas se debe tener en cuenta que:


Se debe hacer generalmente en geles de poliacrilamida.
El gel retrasa el desplazamiento de las proteínas
carga
proporcionalmente con su relación masa

q Ze
µ= =
6πRη 6πRη

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Montaje

Al hacer una electroforesis de proteínas se debe tener en cuenta que:


Se debe hacer generalmente en geles de poliacrilamida.
El gel retrasa el desplazamiento de las proteínas
carga
proporcionalmente con su relación masa
El desplazamiento de la proteína es afectado por el tamaño, carga
y forma de la proteína, según se evidencia en ecuación de la
movilidad electroforetica:
q Ze
µ= =
6πRη 6πRη

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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Montaje

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Electroforesis de ADN

Montaje

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Montaje

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Electroforesis de ADN

Montaje

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Montaje

Se usa SDS (Dodecil Sulfato


Sódico). El SDS incorpora carga
negativa a la proteina.

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Montaje

Se usa SDS (Dodecil Sulfato


Sódico). El SDS incorpora carga
negativa a la proteina.

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Electroforesis de ADN

Montaje

Se usa SDS (Dodecil Sulfato


Sódico). El SDS incorpora carga
negativa a la proteina.
Se cargan las muestras en los
pozos de la parte superior del gel
de polia acrilamida.

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Montaje

Se usa SDS (Dodecil Sulfato


Sódico). El SDS incorpora carga
negativa a la proteina.
Se cargan las muestras en los
pozos de la parte superior del gel
de polia acrilamida.

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Montaje

Se usa SDS (Dodecil Sulfato


Sódico). El SDS incorpora carga
negativa a la proteina.
Se cargan las muestras en los
pozos de la parte superior del gel
de polia acrilamida.
Las proteinas se transladan al
aplicar el campo eléctrico.

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Montaje

Se usa SDS (Dodecil Sulfato


Sódico). El SDS incorpora carga
negativa a la proteina.
Se cargan las muestras en los
pozos de la parte superior del gel
de polia acrilamida.
Las proteinas se transladan al
aplicar el campo eléctrico.

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Montaje

Se usa SDS (Dodecil Sulfato


Sódico). El SDS incorpora carga
negativa a la proteina.
Se cargan las muestras en los
pozos de la parte superior del gel
de polia acrilamida.
Las proteinas se transladan al
aplicar el campo eléctrico.
El gel elimina las corrientes de
convección y minimiza los
movimientos de las proteínas que
no son producidos por el campo
eléctrico.
Abelino Vargas Jiménez
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Montaje
La adición del SDS hace que la mayoría de las proteínas adopten una
forma similar, separando, así, en función de la masa molecular (los
péptidos pequeños se desplazan rápidamente).

Abelino Vargas Jiménez


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Montaje
Las proteínas se visualizan añadiendo un colorante como azul de
Commassie que se fija a las proteínas pero no al gel.

Figura: Purificación de proteína RecA de Escherichia Coli

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Estimación Masa Molecular de la Proteína


Al comparar las posiciones en el gel de proteínas de masa molecular
(Mr ) conocida con la posición de una proteína desconocida se puede
estimar su masa molecular.

Abelino Vargas Jiménez


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Estimación Masa Molecular de la Proteína


Al comparar las posiciones en el gel de proteínas de masa molecular
(Mr ) conocida con la posición de una proteína desconocida se puede
estimar su masa molecular.

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de ADN

Estimación Masa Molecular de la Proteína


Al comparar las posiciones en el gel de proteínas de masa molecular
(Mr ) conocida con la posición de una proteína desconocida se puede
estimar su masa molecular.

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de ADN

Estimación Masa Molecular de la Proteína


Al comparar las posiciones en el gel de proteínas de masa molecular
(Mr ) conocida con la posición de una proteína desconocida se puede
estimar su masa molecular.

Abelino Vargas Jiménez


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Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Estimación Masa Molecular de la Proteína


Al comparar las posiciones en el gel de proteínas de masa molecular
(Mr ) conocida con la posición de una proteína desconocida se puede
estimar su masa molecular.

Carril 1: Proteína patrón de masa


molecular conocida.

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Electroforesis de ADN

Estimación Masa Molecular de la Proteína


Al comparar las posiciones en el gel de proteínas de masa molecular
(Mr ) conocida con la posición de una proteína desconocida se puede
estimar su masa molecular.

Carril 1: Proteína patrón de masa


molecular conocida.

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de ADN

Estimación Masa Molecular de la Proteína


Al comparar las posiciones en el gel de proteínas de masa molecular
(Mr ) conocida con la posición de una proteína desconocida se puede
estimar su masa molecular.

Carril 1: Proteína patrón de masa


molecular conocida.
Carril 2: Proteína de masa
molecular desconocida.

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Estimación Masa Molecular de la Proteína

La movilidad electroforética de una proteína en un gel de


poliacrilamida con SDS es proporcional a su masa molecular.

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Estimación Masa Molecular de la Proteína

La movilidad electroforética de una proteína en un gel de


poliacrilamida con SDS es proporcional a su masa molecular.

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Estimación Masa Molecular de la Proteína

La movilidad electroforética de una proteína en un gel de


poliacrilamida con SDS es proporcional a su masa molecular.

Para determinar la masa molecular de


una proteína desconocida se hace una
grafica de log (Mr ) en función del
desplazamiento relativo.

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de ADN

Determinación del Punto Isoeléctrico

El enfoque isoeléctrico se usa para determinar el punto isoeléctrico


(pI) de una proteína,este se hace:

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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Determinación del Punto Isoeléctrico

El enfoque isoeléctrico se usa para determinar el punto isoeléctrico


(pI) de una proteína,este se hace:
1 Estableciendo un gradiente de pH en el gel con una mezcla de
ácidos y bases orgánicos de baja masa molecular.

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de ADN

Determinación del Punto Isoeléctrico

El enfoque isoeléctrico se usa para determinar el punto isoeléctrico


(pI) de una proteína,este se hace:
1 Estableciendo un gradiente de pH en el gel con una mezcla de
ácidos y bases orgánicos de baja masa molecular.
2 Colocando una mezcla de proteínas en la parte superior del gel.

Abelino Vargas Jiménez


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Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
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Electroforesis de ADN

Determinación del Punto Isoeléctrico

El enfoque isoeléctrico se usa para determinar el punto isoeléctrico


(pI) de una proteína,este se hace:
1 Estableciendo un gradiente de pH en el gel con una mezcla de
ácidos y bases orgánicos de baja masa molecular.
2 Colocando una mezcla de proteínas en la parte superior del gel.
3 Aplicando un campo eléctrico que hace entrar las proteínas en el
gel, las cuales se desplazan hasta alcanzar un pH equivalente a su
pI.

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de ADN

Determinación del Punto Isoeléctrico

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Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Electroforesis Bidimensional

Proceso que se obtiene al combinar el enfoque isoeléctrico y la


electroforesis en gel con SDS, técnica más sensible que permite:
Separar proteínas de masa molecular idéntica que difieren en el
pI.

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Electroforesis Bidimensional

Proceso que se obtiene al combinar el enfoque isoeléctrico y la


electroforesis en gel con SDS, técnica más sensible que permite:
Separar proteínas de masa molecular idéntica que difieren en el
pI.
Separar proteínas con valores de pI similares pero con diferente
masa molecular Mr .

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Electroforesis Bidimensional

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Electroforesis de ADN

Electroforesis Bidimensional

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Electroforesis de ADN

Electroforesis Bidimensional

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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Electroforesis Bidimensional

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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Electroforesis Bidimensional

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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Electroforesis Bidimensional

Primero las proteínas se separan


mediante enfoque isoeléctrico

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Electroforesis de ADN

Electroforesis Bidimensional

Primero las proteínas se separan


mediante enfoque isoeléctrico

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Electroforesis de ADN

Electroforesis Bidimensional

Primero las proteínas se separan


mediante enfoque isoeléctrico
Segundo las proteínas se separan
mediante electroforesis en gel de
poliacrila con SDS.

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Sección 4 Electroforesis de ADN

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de ADN

En este caso la corrida del ADN se hace de manera horizontal, usando


gel agarosa y se usa como buffer TAE o TBE (mezcla de sales con
acido a pH 8)

Abelino Vargas Jiménez


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Propiedades Eléctricas de las Macromoléculas
Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Bibliografía

Lehninger David, Cox Michael. Principles of Biochemistry, Fifth


Edition. 2008

Abelino Vargas Jiménez


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Electroforesis de Proteínas
Electroforesis de ADN

Bibliografía

Lehninger David, Cox Michael. Principles of Biochemistry, Fifth


Edition. 2008
Watson, Baker, Bell, Gann, Levine and Losick. Molecular
Biology of The Gen. Fifth Edition. 2004.

Abelino Vargas Jiménez

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