Métodos Instrumentales de Separación

Curso académico 2014/15

UCLM

PRÁCTICA 3. DETERMINACIÓN DE
ANTIDEPRESIVOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA DE ALTA PRESIÓN (HPLC)

 OBJETIVO

 El objetivo principal de esta práctica es la separación, identificación y

determinación de tres antidepresivos (fluoxetina, fluvoxamina y trazodona)
mediante HPLC.
 La modalidad que vamos a emplear es la de cromatografía líquida de partición
en fase inversa (fase estacionaria apolar con fase móvil relativamente polar).
 La fase estacionaria será una cadena hidrocarbonada ligada a un grupo silanol y
con un tamaño de partícula de 5 m.
 En cuanto al resto de condiciones, utilizaremos una fase móvil de acetonitrilo
con tampón fosfato ( Proporción 40:60) , un flujo de 1,5 mL/min y la columna
será de 15 cm de longitud.
 La detección de los compuestos la llevaremos a cabo a una longitud de onda a
la cual los compuestos tengan una absorbancia considerable ( =230nm)

 INTRODUCCIÓN TEÓRICA

El equipo de HPLC con el que se trabaja en esta práctica es el más básico que
podemos encontrar, con las partes indispensables que necesita un equipo así, que son
las siguientes:

- Bomba: Sistema encargado de introducir la fase móvil en la columna con un

flujo continuo y a una presión alta. En nuestra situación introduce la mezcla de
disolventes (acetonitrilo/tampón fosfato 40:60)
- Inyector: Inyecta la muestra con la menor dispersión posible y siempre
volúmenes muy pequeños. Para ello empleamos una válvula rotatoria de 6 vías.
- Columna: Lugar donde se va a llevar a cabo la separación de los compuestos en
función de las interacciones con la fase estacionaria y fase móvil. En nuestro
caso tendrá una longitud de 15 cm.
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- Detector: Medirá una propiedad física de los compuestos y lo manifestará en el

cromatograma, permitiendo su identificación y cuantificación. En nuestro caso
concreto mediremos la absorbancia a una longitud de onda.

 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

En primer lugar, se preparan cuatro disoluciones patrón de 4, 6, 8 y 10 ppm de

cada uno de los antidepresivos ( fluoxetina, fluvoxamina y trazodona) en matraces de
5mL. Se preparan a partir de las disoluciones de 100 ppm que son proporcionadas por
el laboratorio. Las disoluciones son preparadas con agua desionizada.

Cálculos para la preparación de los patrones:

𝐶100𝑝𝑝𝑚 · 𝑉100 = 𝐶𝑥 · 𝑉𝑥

𝐶𝑥 (𝑝𝑝𝑚) · 5(𝑚𝐿)
𝑉100 =
100 (𝑝𝑝𝑚)

𝑆𝑖 𝑥 = 4 𝑝𝑝𝑚 → 𝑉100 = 0,2 𝑚𝐿

𝑆𝑖 𝑥 = 6 𝑝𝑝𝑚 → 𝑉100 = 0,3 𝑚𝐿

𝑆𝑖 𝑥 = 8 𝑝𝑝𝑚 → 𝑉100 = 0,4 𝑚𝐿

𝑆𝑖 𝑥 = 10 𝑝𝑝𝑚 → 𝑉100 = 0,5 𝑚𝐿

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Se prepara una disolución del preparado farmacéutico. Se toma 1 mL de éste, y

se diluye 100 veces con agua desionizada ( en el matraz de 100mL), obteniendo una
primera disolución ‘’A’’. Esta primera disolución se diluye de nuevo 5 veces con agua
desionizada en un matraz de 10mL. Para ello, se toman de la disolución ‘’ A ‘’ 2mL .
Obteniendo una segunda disolución ‘’ B ‘’.

Una vez que se han preparado las 5 disoluciones, se procede a la obtención de los
cromatogramas correspondientes.

Las condiciones de trabajo son las siguientes:

FASE MÓVIL : Acetonitrilo: 75mM tampón fosfato pH=2.5 (40:60)

COLUMNA : C18

FLUJO: 1.5mL/min

DETECCIÓN: 230 nm

El flujo se va aumentando poco a poco debido a la presión generada. Si no se

hace paulatinamente, se crean corrientes entre el empaquetamiento de la columna
causando picos dobles, triples etc.

(*) Caso particular: Al empezar a aumentar el flujo, se observó que la presión no

aumentaba siendo P=0MPa. Esto fue debido a la presencia de aire en los pistones
procedente de la fase móvil. Para corregirlo se desconectó la columna del sistema, y
una vez desconectado se aumentó de golpe el flujo , desechando fase móvil hasta que
las pompas de aire salieron. Una vez solucionado el problema, se conectó la columna.

Cuando se tiene el sistema en las condiciones deseadas, en el ordenador se

marca ‘crear una secuencia’, se nombra y se indica el número total de muestras que se
van a inyectar (4 patrones + muestra problema + disolución B + 2disoluciónes para
identificación experimental). Se selecciona un tiempo de medida (5 minutos).

Las muestras se introducen y se procede del siguiente modo: en el monitor se

indica la muestra que va a ser introducida. Por otra parte, se introduce en la jeringuilla
un pequeño volumen de la muestra, y se lava la jeringuilla llevando el émbolo hasta el
final para homogeneizar, y se desecha. Se vuelve a introducir muestra en la jeringuilla,
asegurando de que no quede ninguna burbuja de aire (no puede entrar aire en el
equipo). Se introduce la jeringuilla y se presiona el émbolo introduciendo muestra en
la válvula de inyección (sin llegar al tope ). Cuando se ha introducido la muestra, se gira

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la válvula e inmediatamente se presiona ‘’mark’’, para que empiece a registrar el

cromatograma. Pasado el tiempo de la medida, se pulsa en el monitor el botón ‘’stop’’,
y se retira la jeringuilla después de volver a girar la válvula y devolverla a su posición
original.

Una vez que se han registrado los cromatogramas de las 4 disoluciones patrón,
de la muestra problema y del preparado farmacéutico (disolución B), se procede a la
identificación de los picos. Para ello, a la disolución patrón más diluida (4ppm), se le
añaden 0,2mL de uno de los antidepresivos y se registra el cromatograma donde se
observa que un pico crece con respecto al cromatograma original. A la misma
disolución, se le añade otro volumen de 0,2mL de otro de los antidepresivos y se
procede igual, donde se observa un nuevo pico de mayor altura. Por descarte se
concluye que el pico restante es del antidepresivo que no se ha añadido. Esto es lo que
se conoce como Procedimiento de identificación experimental.

En la identificación experimental, hemos añadido en primer lugar Fluvoxamina,

que corresponde con el segundo pico. La segunda adición ha sido de Trazodona donde
se ha observado que corresponde al primer pico. Por descarte, el pico último
corresponde con la Fluoxetina. Además, sabiendo que pico corresponde con cada
antidepresivo, se puede llegar a la conclusión de que el preparado farmacéutico lleva
Fluoxetina (tercer pico).

Cuando todos los cromatogramas han sido registrados, por una parte se cambia
la fase móvil, a Acetatonitrilo: Agua (40:60) para eliminar las posibles sales
procedentes del tampón fosfato de tal manera que se lava y limpia el sistema. Por otra
parte, en el monitor se lleva a cabo la integración de los picos obtenidos. Se anota el
tiempo de retención de los picos y el Area de cada uno de ellos.

Los resultados obtenidos son los siguientes:

Pico 1  Trazodona  tr = 1,59 min

Pico 2  Fluvoxamina  tr = 2,70 min

Pico 3  Fluoxetina  tr = 3,68 min

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Muestras: 4ppm 6ppm 8ppm 10ppm 4+ 4+ Muestra

Fluvoxamina Trazodona problema
Pico 1 92,6 160,22 212,73 281.16 107,22 332,15 171,16
Pico 2 51,97 80,19 105,27 135,40 119,25 104,06 70,57
Pico 3 145,37 210,54 276,59 342,23 157,59 129,55 269,82
(*) En la tabla se muestran las áreas de pico.

Preparado farmacéutico:

tr = 3,66min  Fluoxetina

A = 469,79

A continuación, se construyen las rectas de calibrado. Una recta para cada pico (con los
áreas de las disoluciones patrón). Las rectas y sus ecuaciones son las siguientes:

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Determinación de la concentración de antidepresivos en la muestra problema

Utilizando las rectas de calibrado para cada pico, y los áreas de los picos
obtenidos en el cromatograma correspondiente a la muestra problema, obtenemos la
concentración de cada antidepresivo en dicha muestra.

MUESTRA PROBLEMA
PICO AREA CONCENTRACIÓN (ppm)
Trazodona (1) 171,16 6,49
Fluvoxamina (2) 70,57 5,35
Fluoxetina (3) 269,82 7,79

Determinación de la concentración de antidepresivo presente en el preparado

farmacéutico.

Como ya se ha indicado anteriormente, el preparado farmacéutico contiene un

antidepresivo que recibe el nombre de Fluoxetina.

Debido a que corresponde con el tercer pico del cromatograma, con la ecuación de la
recta obtenida para el pico 3, introducimos el área obtenida ( y = 469,79) y obtenemos
la concentración.

𝐶𝑓𝑙𝑢𝑜𝑥𝑒𝑡𝑖𝑛𝑎 = 13,88 𝑝𝑝𝑚

Cálculo de la eficiencia para cada compuesto (N), factor de capacidad (K’) , factor de
separación y de la resolución cromatográfica.

Para esta última parte, los cálculos que se piden han sido realizados con los datos
experimentales para el primer cromatograma (disolución patrón 4ppm).

Datos:

𝑡𝑚 = 1,15 𝑚𝑖𝑛

Trazodona (pico1) Fluvoxamina Fluoxetina (pico3)

(pico2)
tr (min) 1,59 2,70 3,68
W (min) 0,2 0,25 0,36

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Cálculos:

- Eficiencia para cada compuesto (N)

𝒕𝒓 𝟐
𝑵 = 𝟏𝟔 · ( )
𝒘
1,59 2
1º 𝑝𝑖𝑐𝑜 → 𝑁 = 16 · ( ) = 1011 𝑝𝑙𝑎𝑡𝑜𝑠 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜𝑠
0,2

2,70 2
2º 𝑝𝑖𝑐𝑜 → 𝑁 = 16 · ( ) = 1866 𝑝𝑙𝑎𝑡𝑜𝑠 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜𝑠
0,25

3,68 2
3º 𝑝𝑖𝑐𝑜 → 𝑁 = 16 · ( ) = 1672 𝑝𝑙𝑎𝑡𝑜𝑠 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜𝑠
0,36

- Factor de capacidad (K’).

𝒕𝒓 − 𝒕𝒎
𝒌′ =
𝒕𝒎

1.59 − 1.15
1º𝑝𝑖𝑐𝑜 → 𝐾 ′ = = 0.38
1.15
2.70 − 1.15
2º𝑝𝑖𝑐𝑜 → 𝐾 ′ = = 1.35
1.15
3.68 − 1.15
3º𝑝𝑖𝑐𝑜 → 𝐾 ′ = = 2.2
1.15
- Factor de separación (α)

𝒕𝒓′𝟐 𝒕𝒓𝟐 − 𝒕𝒎
𝜶= =
𝒕𝒓′𝟏 𝒕𝒓𝟏 − 𝒕𝒎

- entre el primer pico y el segundo:

2,70 − 1,15
𝛼= = 1,12
1,59 − 1,15

- entre el segundo pico y el tercero :

3,68 − 1,15
𝛼= = 1,63
2,70 − 1,15

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- Resolución cromatográfica (R)

𝟐( 𝒕𝒓𝟐 − 𝒕𝒓𝟏)
𝑹𝒔 =
𝒘𝟐 + 𝒘𝟏

- entre el primer pico y el segundo:

2(2,70 − 1,59)
𝑅= = 4,93
0,25 + 0,2

- entre el segundo pico y el tercero:

2(3,68 − 2,70)
𝑅= = 3,21
0,36 + 0,25