¿Qué podemos ver con un microscopio?

16 de Mayo de 2019

Una de las mayores barreras a las que se enfrentó la biología

durante siglos es la incapacidad de ver de qué estaban hechos los
tejidos que formaban los seres vivos. Hay que tener en cuenta que
una célula animal tiene de media un diámetro de 10-20 µm, lo
cual si hacemos cuentas supone que es unas cincuenta veces más
pequeña que el objeto más diminuto que un ser humano
normalmente puede ver con sus ojos. No fue hasta el desarrollo de
los primeros microscopios ópticos de calidad que a principios del
siglo XIX científicos como Schleiden y Schwann propusieron que
todos los tejidos animales y vegetales son en verdad agregados de
células individuales. Tras estos descubrimientos, que se agruparon
formando el concepto de “doctrina celular” (1838), empezó a
desarrollarse la rama de la ciencia que ahora se llama Biología
Celular.
Sin embargo, al problema del pequeño tamaño celular hay que
sumarle una dificultad técnica adicional: las células son
traslucidas y casi sin color, con lo cual si las observamos
directamente al microscopio no vemos prácticamente nada. Por
ello fue necesario desarrollar también en paralelo toda una serie
de tinciones que selectivamente tiñeran distintos tipos celulares,
estructuras dentro de ellas, etc. para hacerlas visibles. Del mismo
modo, el propio microscopio óptico, que usa luz visible, también
tiene sus limitaciones técnicas que solo pudieron ser superadas a
principios de 1940 con la aparición del microscopio electrónico.
Para que nos podamos imaginar el gran salto que fue el paso de
un microscopio a otro, esta es una escala con distintos tamaños:
un pulgar tiene un grosos de unos 20 mm, mientras que si
queremos ver sus células hay que bajar a un tamaño cien veces
menor (0´2 mm). Con un microscopio óptico podemos ver las
células e incluso podemos llegar a ver estructuras celulares
internas como las mitocondrias (que de media son unos 2 µm),
pero ver elementos más pequeños, como ribosomas o (0´2 µm)
proteínas (unos 2 nm), es imposible con un microscopio de este
tipo. Esto se debe a que una de las limitaciones técnicas de un
microscopio es la radiación que usa para “ver” las cosas, ya que
una radiación no puede ser usada para conseguir detalles
estructurales mucho más pequeños que su propia longitud de
onda. En el caso de los microscopios ópticos se usa la luz visible,
lo cual coloca el límite de resolución de estos aparatos en una
longitud de onda que va desde unos 0´4 µm (violeta), a 0´7 µm
(rojo profundo). Esto significa que estructuras celulares como las
mitocondrias (unos 2 µm) o seres vivos como las bacterias (que
de media son 0´5 µm), son normalmente los elementos más
diminutos visibles con estos aparatos. Si queremos ver cosas más
pequeñas necesitamos utilizar un microscopio electrónico, el cual
usa electrones en vez de luz visible, aunque esta herramienta
también tiene desventajas como que es necesario procesar mucho
el tejido que se quiere observar antes de poder estudiarlo con el
microscopio electrónico.
 Microscopio electrónico
Un microscopio electrónico usa electrones en lugar
de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos
diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar
amplificaciones mayores antes que los mejores microscopios
ópticos, debido a que la longitud de onda de los electrones es
bastante menor que la de los fotones.
El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst
Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1932, quienes se basaron en los
estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades
ondulatorias de los electrones.

Limitaciones del microscopio electrónico

 La limitada apertura no permite que la información detallada
alcance la imagen, limitando de este modo la resolución.
 El contraste de amplitud (que radica en la naturaleza
corpuscular de los electrones) se debe al contraste de
difracción, provocado por la pérdida de electrones del rayo.
Es un contraste dominante en especímenes gruesos.
 El contraste de fase (que radica en la naturaleza ondulatoria
de los electrones) se debe al contraste de interferencia
provocado por los desplazamientos en las fases relativas de
las porciones del rayo. Es un contraste dominante en
especímenes finos.
 Existen también distintas aberraciones producidas por los
lentes: astigmática, esférica y cromática.
 El problema de la función de transferencia de contraste
(CTF en inglés): la CTF describe la respuesta de un sistema
óptico a una imagen descompuesta en ondas cuadráticas.
 Microscopio electrónico de 1964.
El material biológico presenta dos problemas fundamentales: el
entorno de vacío y la transferencia de energía. Para resolverlos, se
utilizan distintas técnicas dependiendo del tamaño de la muestra:
 para muestras grandes como órganos, tejidos o células, se
utilizan tres técnicas:
1. la fijación química o la criofijación;
2. la inclusión en resinas (criosustitución);
 3. la réplica metálica.
 para muestras pequeñas como complejos macromoleculares
se utilizan las siguientes técnicas:
1. la tinción negativa: los agentes de tinción más usados son
el molibdato amónico, el fosfotungstato sódico y sales de
uranio como acetato y formiato. Todos ellos presentan las
siguientes propiedades: interactúan mínimamente con la
muestra y son estables en la interacción con los electrones,
son altamente solubles en agua, presentan una alta densidad
que favorece el contraste, tienen un punto alto de fusión,
tienen un tamaño de grano pequeño;
2. la réplica metálica: para construir la réplica metálica se
evapora el metal (estaño), que se deposita sobre la muestra a
la vez que esta, por el vacío, se disuelve;
3. la criomicroscopía.

Tipos de microscopios electrónicos

(1) carcasa, (2) emisor de electrones, (3) electrones, (4) cátodo,
(5) ánodo, (6) Lente condensador, (7) muestra analizada, (8)
Lente objetivo, (9) Lente proyector, (10) Detector (sensor o
película fotográfica).
Existen dos tipos principales de microscopios electrónicos: el
microscopio electrónico de transmisión y el microscopio
electrónico de barrido.

Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

El microscopio electrónico de transmisión (TEM en inglés) emite
un haz de electrones dirigido hacia el objeto cuya imagen se desea
aumentar. Una parte de los electrones rebotan contra la muestra,
formando así una imagen aumentada. Para utilizar un microscopio
electrónico de transmisión debe cortarse la muestra en capas
finas, no mayores de unos 2000 ángstroms. Los microscopios
electrónicos de transmisión pueden aumentar la imagen de un
objeto hasta un millón de veces.
Microscopio electrónico de barrido (MEB)

Imagen de una hormiga tomada con un MEB (microscopio

electrónico de barrido).
En el microscopio electrónico de barrido (SEM en inglés) la
muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida
con electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la
cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la
zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres
dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolución
está entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite
obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos,
metálicos y orgánicos. La luz se sustituye por un haz de
electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen
conductoras metalizando la superficies. Apoyándose en los
trabajos de Max Knoll de los años 1930 fue Manfred von Ardenne
quien logró inventar el MEB en 1937 que consistía en un haz de
electrones que barría la superficie de la muestra a analizar, que, en
respuesta, reemitía algunas partículas. Estas partículas son
analizadas por los diferentes sensores que hacen que sea posible
la reconstrucción de una imagen tridimensional de la superficie.

Otros tipos de microscopios electrónicos[editar]

 Microscopio electrónico de reflexión (REM) 1
  Microscopio de efecto túnel (STM)
 Microscopio de sonda de barrido (SPM)
 Microscopía electrónica de transmisión de alta resolución
(HRTEM)

Aplicaciones en distintas áreas

En el estudio de los circuitos integrados se suele utilizar el
microscopio electrónico debido a una curiosa propiedad: Como el
campo eléctrico modifica la trayectoria de los electrones, en un
circuito integrado en funcionamiento, visto bajo el microscopio
electrónico, se puede apreciar el potencial al que está cada
elemento del circuito.
La cristalografía de electrones es un método utilizado para
determinar la disposición de átomos en sólidos a través de un
microscopio electrónico de transmisión. Este método se utiliza en
muchas situaciones donde no se puede usar cristalografía de rayos
X y fue inventado por Aaron Klug.

Microscopio Electrónico de Transmisión

Han pasado más de 340 años desde que Antony Van
Leeuwenhoek con la invención de su microscopio simple realizó
el descubrimiento de las células espermatozoides en 1677, años
en los que se ha ido perfeccionando el sistema de lentes del
microscopio compuesto de luz (óptico o de fotones, hasta lograr
microscopios tan sofisticados como el de contraste de fases o de
fluorescencia; pero en 40 años o un poco más, los científicos
lograron perfeccionar el MET. El mundo de las ciencias
biológicas se amplió con la invención de la microscopía
electrónica y la experiencia fue excitante al lograr ver imágenes
del interior de una célula o de partículas de virus amplificadas
miles de veces
Keith Porter y colaboradores en 1945 demostraron de manera
contundente que el MET podía ser utilizado para observar los
detalles del interior de las células con el descubrimiento de lo que
años más tarde designaran como retículo endoplásmico (ER).
En la actualidad el microscopio electrónico se ha convertido en
una herramienta fundamental en la investigación científica en
diferentes áreas de la biología, medicina, materiales y
nanopartículas.
 ¿Por qué utilizar
electrones en vez de luz (fotones)?
El poder de resolución es la capacidad de observar con claridad
dos objetos extremadamente cercanos, por ejemplo, dos puntos,
con total nitidez. Para el ojo humano normal, el máximo poder de
resolución sería distinguir claramente dos puntos que se
encuentren separados entre sí por la décima parte de 1 mm [100
micrómetros o micras (µm)], el grosor de un cabello humano. El
microscopio simple (de una sola lente) de Van Leeuwenhoek,
producía una ampliación de hasta 275 veces (275x) con un poder
de resolución de 1.4 µm, mayor al poder de resolución de los
microscopios compuestos (de varias lentes) de su época.
Para un microscopio óptico compuesto, el poder de resolución
máximo es de 0.2 µm o 200 nanómetros (nm), siendo un
nanómetro la millonésima parte de 1 mm. Con la ayuda del
microscopio compuesto es posible observar células humanas,
células vegetales, levaduras, protozoarios, y bacterias logrando
aumentos hasta de 1000x. En contraste, con el MET podemos
observar objetos más pequeños que 200 nm como los coronavirus.
Pero existen virus aún más pequeños como el bacteriófago (Fig.
4), que infecta bacterias. El tamaño de los fagos oscila entre 20 y
200 nm. Sin embargo, existen partículas como los rotavirus
causantes de la gastroenteritis que miden aproximadamente entre
70-90 nm, los cuales son aún más pequeños que 100 nm ¡Más
pequeños que la longitud de onda más corta de la luz visible
(color violeta, 400 nm) y por debajo de los 200 nm!

¿Cómo observar cosas más pequeñas por debajo de los 200

nm, de lo que se alcanza a ver con un microscopio compuesto
actual?
El Físico Ernes Abbe (1872) quien trabajaba para la compañía
Carl Zeiss realizó avances fundamentales tanto en el diseño de los
microscopios de luz como en el campo de la óptica teórica, y
predijo desde aquel entonces que para mejorar el poder de
resolución de los microscopios compuestos se necesitaba de
longitudes de onda mucho más cortas que las de la luz visible.

Sin embargo,
para que esto hubiese sido posible, pasaron muchos años; primero
tuvieron que existir toda una serie de conocimientos científicos
fundamentales que llevaron al descubrimiento del electrón, y de
que éste tiene comportamiento de partícula y de onda, y que al
pasar a través de un campo electromagnético los electrones
desvían su trayectoria igual que los fotones lo hacen a través de
una lente de cristal para formar una imagen. Ya en la primera
mitad del siglo pasado, fue Louis De Broglie (1924) quien
demostró que el electrón tenía propiedades de onda que
sustancialmente son de longitud de onda más corta que la luz
visible y Busch (1926) que demostró que un haz de electrones
podía ser desviado por lentes magnéticas al igual que la luz es
desviada por una lente de vidrio. Esta serie de hallazgos
científicos permitió el desarrollo del primer tipo de microscopio
electrónico, el MET, en un principio inventado para análisis de
materiales.
 
¿Entonces qué es el MET y cómo funciona?
Es un instrumento científico con un peso aproximado de una
tonelada y con una columna de alrededor de 1.5 metros de altura

donde se utiliza  alto

voltaje para producir y enfocar un haz de electrones acelerados en
alto vacío que al impactar en una de las caras de una muestra de
tejido ultradelgada forman una imágen al emerger por la cara
contraria. Con este instrumento que alcanza aumentos de 1000
000x hoy en día es posible ver desde los cromosomas y las
moléculas de ADN (ácido desoxiribonucleico) hasta átomos con
un poder de resolución de 0.2 nm.
La adaptación del MET para la observación de muestras
biológicas trajo consigo el desarrollo de equipos y accesorios
especiales para el procesamiento de las mismas como el
ultramicrotomo y la cuchilla de diamante para poder obtener
cortes de tejido ultrafinos que soporten el haz de electrones y el
alto vacío, así como procedimientos histológicos con fijadores
químicos y agentes contrastantes especiales para la preparación de
las muestras.

El MET está compuesto por la columna que genera el haz de

electrones, un sistema de alto vacío, un sistema de enfriamiento,
corrientes de alimentación y un sistema de registro de la imagen.
La imagen formada por los electrones es proyectada en dos
dimensiones sobre una pantalla fluorescente y puede ser obtenida
finalmente a través de una película fotográfica o de una cámara
digital en una computadora..
La Unidad de Microscopía Avanzada del Clúster Científico y
Tecnológico BioMimic® del INECOL cuenta con un
Microscopio Electrónico de Transmisión JEOL JEM 1400Plus.
Brinda el Servicio de Microscopía Electrónica de Transmisión y
la asesoría técnica para la preparación y estudio de muestras
biológicas.
 
Figuras
Fig 1. Microscopio simple. Utiliza una sola lente para ampliar las
imágenes de los objetos observados. Se le atribuye al holandés
Anton Van Leeuwenhoek haber introducido el microscopio a la
atención de los biólogos. B) Comparación del microscopio
compuesto con el MET. A) Imágenes obtenidas de internet. B)
Imagen de la Unidad de Microscopia Avanzada, INECOL
(Lorena ML López Sánchez).
Fig. 2 Imágenes de bacteriófagos que son virus que infectan
exclusivamente a las bacterias. A) Representación de distintos
bacteriófagos que atacan a una bacteria, ilustración en 3D. B)
Gamma-fago a través de un microscopio electrónico de
transmisión. C) Bacteriófago atacando a una bacteria. (Imágenes
obtenidas de internet).
Fig 3. Imagen de células de la levadura de pan (Saccharomyces
cerevisiae) que es un hongo unicelular obtenida de un
microscopio de luz aumentada 630X. B) Imagen de una célula de
la levadura de pan (Saccharomyces cerevisiae) obtenida en un
microscopio electrónico de transmisión aumentada 1500 X. PC=
pared celular; V= Vacuola; N= Núcleo; X= aumentos. Imágenes
obtenidas por Lorena ML López Sánchez.
Fig 4.  Esquema interno del Microscopio Electrónico de
Transmisión (obtenido de internet).
Fig. 5 (carrousel) Imágenes de partículas de rotavirus causante de
gastroenteritis o infección intestinal. Magnificación 85,000 X.
Barras equivalen a 90nm. Imágenes obtenidas por Lorena ML
López Sánchez.
Fig. 6 Imágenes de partículas de rotavirus causante de
gastroenteritis o infección intestinal. Magnificación 85,000 X.
Barras equivalen a 90nm. Imágenes obtenidas por Lorena ML
López Sánchez.
 
Palabras clave
Microscopía electrónica de Transmisión, poder de resolución,
tamaño de virus.
 
Resumen
Gracias a los grandes avances en óptica y al descubrimiento del
electrón y sus propiedades, se pudo generar la Microscopía
Electrónica de Transmisión (MET) y con ella se ampliaron las
puertas al mundo de las ciencias.