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UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA


AGRICULTURA

MICROSCOPÍA

Nombre: Castillo Fabricio, Criollo Víctor, Melo Darío


Fecha: 16/01/2019 NRC: 3802

Observación en el microscopio electrónico de barrido (SEM) de


la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE.

1. Resumen
La microscopía es una ciencia que nos ayuda con el estudio de un amplio rango de muestras así
como tiene un amplio rango de aplicaciones que va desde el estudio de la composición de
muestras, pasando por el análisis de materiales y llegando incluso a la creación de nuevos
materiales con propiedades más útiles que los materiales existentes. Cuenta con una amplia
gama de herramientas para cumplir con su cometido, siendo la herramienta principal el uso del
microscopio. Existen diversos tipos de microscopios con características distintas y aplicaciones
únicas, en este ensayo hacemos hincapié en el microscopio de barrido llamado microscopio
SEM, este microscopio ocupa un haz de electrones sobre una muestra conductora midiendo la
fuerza aplicada por los mismos pudiendo devolver una imagen en 3D sobre la muestra que se
observa, su aplicaciones van desde la observación de la morfología hasta el análisis de la
composición de una muestra, para su uso solo se deben cumplir dos condiciones: que la muestra
sea conductora y que la muestra esté seca. En el caso de muestras biológicas existen protocolos
especiales para cada muestra que nos indican cómo mantener intactas las estructuras y obtener
óptimos resultados en su observación. En este ensayo hemos observado las estructuras de una
mosca, de una polilla, de polvillo de habitación y de un clip, bañando las muestras en oro antes
de ser observadas.
2. Introducción
MICROSCOPIO DE FUERZA ATÓMICA
El microscopio de fuerza atómica es un instrumento mecano-óptico capaz de detectar fuerzas
del orden de los nanonewtons. Al rastrear una muestra, es capaz de registrar continuamente su
topografía mediante una sonda o punta afilada de forma piramidal o cónica. La sonda va
acoplada a un listón o palanca microscópica muy flexible de sólo unos 200 µm. El microscopio
de fuerza atómica ha sido esencial en el desarrollo de la nanotecnología, para la caracterización
y visualización de muestras a dimensiones nanométricas
Algunas superficies parecen demasiado lisas al STM, la altura aparente o corrugación es de
1/100 a 1/10 diámetros atómicos. Entonces, para resolver átomos individuales la distancia entre
punta y muestra debe mantenerse constante a menos de 1/100 de diámetro atómico o hasta
0.002 nm., por ello el STM debe aislarse de las vibraciones.
Debe tomarse en cuenta que el resultado es una visualización que permite conocer
características de la muestra. No es una fotografía de los átomos en la superficie. Los átomos
parecen tener superficies sólidas en las imágenes de STM, pero en realidad no las tienen.
Sabemos que el núcleo de un átomo está rodeado de electrones en constante movimiento. Lo
que parece una superficie sólida es en realidad una imagen de un conjunto de electrones. Las
imágenes también dependen de ciertos mecanismos de interacción punta-muestra que no se
entienden bien hasta la fecha. Aun cuando no necesita alto vacío para su operación, es deseable
para eliminar contaminación y además una cámara de vacío aísla de vibraciones externas.

DIFRACTÓMETRO DE RAYOS X

Los rayos X son producidos mediante la aceleración de electrones desde un cátodo hacia un
blanco metálico (ánodo), por medio de alto voltaje. Los electrones acelerados chocan con los
átomos del metal utilizado como blanco, removiendo electrones de niveles internos y
ocasionando que electrones de niveles superiores cubran los lugares vacantes, emitiendo así,
fotones de rayos X. Debido a que los rayos X tienen una frecuencia correspondiente a la
diferencia de energía entre esos dos niveles, también son llamados radiación característica. Los
rayos X que se generan de esta forma, se utilizan para bombardear muestras cristalinas y así
obtener su patrón de difracción de rayos X.
En una muestra cristalina, los átomos se encuentran agrupados de forma periódica y ordenada,
por lo que al recibir esta radiación, son dispersados en todas direcciones, produciendo
fenómenos de interferencia, tanto constructiva como destructiva. La mayor parte de las
dispersiones son del tipo destructivo, cancelándose entre sí, pero en determinadas ocasiones,
debido a la periodicidad de los átomos, puede ocurrir que las ondas dispersadas se encuentren en
fase y se refuercen, dando origen al fenómeno de difracción. Esto se cumple cuando los rayos X
difractados por planos paralelos separados por una distancia “d”, presentan una diferencia de
camino recorrido igual a un entero de la longitud de onda del haz incidente. Lo cual se traduce
matemáticamente como la ley de Bragg: nl = 2dsenq. La probabilidad de que la interferencia sea
constructiva sería muy pequeña, si no existiera el hecho de que los átomos de los cristales están
ordenados de forma regular y repetitiva.

MICROSCOPIO TEM

Un microscopio electrónico de transmisión es un microscopio que utiliza un haz de electrones


para visualizar un objeto, debido a que la potencia amplificadora de un microscopio óptico está
limitada por la longitud de onda de la luz visible. Lo característico de este microscopio es el uso
de una muestra ultrafina y que la imagen se obtenga de los electrones que atraviesan la muestra.
Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de
veces.
Debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz visible,
pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas.
Las partes principales de un microscopio electrónico de transmisión son:
Cañón de electrones, que emite los electrones que chocan o atraviesan el espécimen, creando
una imagen aumentada.
Lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las
lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con los electrones.
Sistema de vacío es una parte muy importante del microscopio electrónico. Debido a que los
electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, se debe hacer un vacío casi total en
el interior de un microscopio de estas características.
Placa fotográfica o pantalla fluorescente que se coloca detrás del objeto a visualizar para
registrar la imagen aumentada.
Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser un
ordenador.
El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto
que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y
otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra.

MICROSCOPIO SEM
El microscopio electrónico de barrido es una técnica de microscopía electrónica capaz de
producir imágenes de alta resolución de la superficie de una muestra utilizando las interacciones
electrón-materia. Utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz para formar una
imagen.1
Apoyándose en los trabajos de Max Knoll de los años 1930 fue Manfred von Ardenne quien
logró inventar el MEB en 1937 que consistía en un haz de electrones que barría la superficie de
la muestra a analizar, que, en respuesta, reemitía algunas partículas. Estas partículas son
analizadas por los diferentes sensores que hacen que sea posible la reconstrucción de una
imagen tridimensional de la superficie.
Los trabajos realizados en la década de 1960 en el laboratorio de Charles William Oatley, en la
Universidad de Cambridge, contribuyeron en gran medida al desarrollo del MEB, y dieron lugar
en 1965 a la comercialización, por parte de Cambridge Instrument Co., de los primeros
microscopios de barrido.2 Hoy en día, la microscopía electrónica de barrido se utiliza en
campos que van desde la biología a la ciencia de los materiales, pasando por la arqueología, y
muchos fabricantes ofrecen aparatos de serie equipados con detectores de electrones
secundarios y cuya resolución se sitúa entre 0, 4 y 20 nanómetros.3
Los MEB poseen una gran profundidad de campo, que permite enfocar a la vez gran parte de la
muestra. También producen imágenes de alta resolución, de forma que las características más
ínfimas de la muestra pueden ser examinadas con gran amplificación. La preparación de las
muestras es relativamente fácil ya que la mayoría de los MEB sólo requieren que estas sean
conductoras. La muestra generalmente se recubre con una capa de carbono o una capa delgada
de un metal, como el oro, para darle carácter conductor.4 Posteriormente, se barre la superficie
con electrones acelerados que viajan a través del cañón. Un detector formado por lentes basadas
en electroimanes, mide la cantidad e intensidad de los electrones que devuelve la muestra,
siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones mediante imagen digital.

3. Metodología
RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA
Para la recolección de la muestra se deben cumplir dos condiciones: que sea conductora y que
fina, en el caso de muestras orgánicas debemos llevar a cabo un proceso de secado, ya que el
agua contenida se podría evaporar en el microscopio dañando los sensores y entorpeciendo los
resultados
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Se debe tener mucho cuidado al manipular la muestra ya que podemos entorpecer el resultado
final.
Para preparar la muestra para su observación se siguen los siguientes pasos:
1. Fijación. - este paso busca detener los procesos biológicos de muestras orgánicas para
poder preservar la muestra lo más fiel posible a la realidad, en este ensayo se usó
glutaraldehido.
2. Post Fijación. - este paso nos ayuda a preservar de mejor manera las partes lipídicas de
la muestra, en este ensayo se usó tetraóxido de osmio
3. Deshidratación. - este paso busca eliminar la mayor cantidad de la muestra, en este
ensayo se usó un bagaje de etanol desde 70 hasta 40%.
4. Secado. - el proceso de ayuda eliminar todo rastro de soluto de la muestra, puede ser
por medios físicos o químicos, el método por preferencia es el liofilizador.
Una vez que hayamos preparado la muestra debemos poner la muestra en una cinta doble faz
conductora y la colocamos en el pin del microscopio. En el caso de muestras biológicas al
finalizar debemos colocar las muestras en un evaporador de oro durante 60s el cual pondrá una
capa de 20nm sobre la muestra volviéndola conductora
OBSERVACIÓN DE LA MUESTRA
El microscopio SEM está puesto en una mesa anti vibraciones para obtener resultados más
óptimos, por lo que se debe tener cuidado con la manipulación del equipo, cuenta con varios
sensores, como por ejemplo un sensor de electrón secundario que alcanza un aumento máximo
de 150000 aumentos con condiciones de astringencia óptimas. Se puede realizar un análisis
EBS para poder identificar la composición de una muestra, también se puede realizar un
mapping para poder observar la distribución de los elementos que componen una muestra.
4. Resultados

MOSCA
a) Vista superior. Se observa el ala, b) Ojo de la mosca (formas
pata, cabeza y cuerpo de la mosca. hexagonales) con presencia de
bacterias.

c) Cuerpo de la mosca. Imagen brillosa


pues existe una mala adhesión de los d) Extremo final de la pata de la mosca.
átomos de oro debido a que la
muestra es irregular.

e) Enfoque selectivo delantero debido a f) Enfoque selectivo trasero debido a la


la profundidad de campo y distancia profundidad de campo y distancia de
de trabajo. trabajo.
POLILLA
a) Polvo de las alas de la polilla. b) Ala de la polilla.

CLIP
b) Parte del clip en el que fue cortado.
a) Vista superior de un clip.
POLVO DE HABITACIÓN
a) Fibras y otros elementos desconocidos del polvo de habitación.

5. Discusión
Para que sea posible el reconocimiento de muestras al microscopio de barrido electrónico
(SEM) deben cumplir dos condiciones: deben estar secas y ser conductoras que se cumplen en
las muestras que se pusieron en la prueba como el clip que es seco y al estar compuesto por
aleaciones de metales es conductora caso contrario es la mosca, escamas de polilla, y polvo de
casa que al estar secas no más son conductoras (Raspolini, 2018). En el caso de las muestras no
conductoras es necesario el recubrimiento con un metal conductor que facilita su observación en
el microscopio el método usado es el recubrimiento bajo vacío el “ssputtering” de oro que
genera micras de films que recubren las muestras haciéndolas conductoras que generan mejores
condiciones de imagen (Autrata & Henja, 1991).
Para un mejor trabajo con SEM es necesario aplicar alto vacío, haz de electrones móviles,
electrones secundarios, tubo de Brown lo que permite tener una imagen de hasta 10 nm como en
los resultados obtenidos que se realizaron fotografías de 500 nm todo esto con un debido a que
las señales emitidas por los ES son captadas por los detectores permitiendo generar imágenes
tridimensionales (Joy, 1992). Para una correcta interpretación de la imagen es necesario tener
presente cuál es la posición del foco luminoso y cuál es la del ojo observador que mediante un
capturadora de computacional se obtiene imágenes claras a blanco y negro. Las muestras de
mosca comparada con Raspolini (2018) son correspondientes a las obtenidas y con la misma
resolución permitiendo establecer que la distancia de trabajo (WD) y la profundidad de campo
permiten obtener excelentes imágenes.
6. Conclusiones

● Con la preparación adecuada de las muestras orgánicas se permitió que estas pueden
interactuar con los electrones emitidos por la fuente del SEM. Concluyendo que unas
adecuadas preparaciones de las muestras permiten ser visualizadas en el microscopio.
● Las muestras de metal pueden ser usadas sin preparación ya que son capaces de
desprender los electrones, que permiten ser utilizados en estudios balísticos.
● El adecuado manejo de las WD y de la profundidad de campo permitieron generar
imágenes con excelente resolución estableciendo que estos parámetros son
fundamentales para el manejo del SEM.

7. Bibliografía
Autrata, R., & Henja, J. (1991). Detectors for low voltage SEM. Scanning. Thermo Scientic,
275-288.
Joy, D. (1992). Resolution limit of the SEM. In: Electron Microscopy. EUREM 92, 735-739.
Raspolini, L. (30 de Noviembre de 2018). The revolution in asbestos analysis. Obtenido de
Thermo Scientics: http://blog.phenom-world.com/