Bioquímica Metabólica Medicina-UNPSJB

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TP de laboratorio Nº 1: Metabolismo de hidratos de carbono

Objetivos:
- Tomar conocimiento e interpretar los análisis de laboratorio que permiten el diagnóstico y
seguimiento de los pacientes diabéticos.
- Determinar los niveles de glucosa en sangre (glucemia).
- Determinar los valores de hemoglobina glicosilada (HbA1c) y fructosamina.
- Interpretar y correlacionar los resultados.

Introducción:
Tras la ingestión de hidratos de carbono, las amilasas y disacaridasas liberadas por las glándulas
salivales y el páncreas hidrolizan las moléculas de almidón y disacáridos dando origen a los
monosacáridos que serán absorbidos en el intestino delgado. Estos monosacáridos son transportados
por la circulación portal, siendo captados principalmente por el hígado, pero también por los músculos
y otros tejidos. Monosacáridos como galactosa y fructosa son convertidos en glucosa en el hígado.
La glucosa puede seguir diferentes caminos: ser oxidada para producir energía mediante la glucólisis,
convertirse en glucógeno (glucogénesis) y almacenarse en el hígado, o transformarse en ácidos grasos
y triglicéridos constituyendo el tejido adiposo. En estado de ayuno, cuando el organismo necesita
glucosa, recurre a los depósitos de glucógeno y mediante la glucogenolisis la obtiene. Otra fuente de
glucosa la constituyen precursores no glucosídicos (lípidos y proteínas), proceso que se conoce como
gluconeogenesis.
El hígado es un órgano esencial en el mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre (glucemia).
Cuando los niveles de glucosa son superiores a la demanda (estado post-prandial) la almacena en
forma de glucógeno y lípidos; y degrada estas formas de reserva cuando los niveles de glucosa en
sangre disminuyen (ayuno).
La glucemia se encuentra finamente regulada, sus valores debe mantenerse constante dentro de ciertos
límites ya que en condiciones normales, es el principal combustible utilizado por el cerebro.
Una concentración elevada de glucosa provocaría la liberación de agua de los tejidos como
consecuencia de su efecto osmótico. Los tejidos se deshidratarían y su funcionamiento se afectaría,
por ej. en el cerebro se podría producir un coma hiperosmolar. Por otro lado, si la glucemia continuara
bajando luego de una ingesta, los tejidos que dependen de glucosa sufrirían por la falta de energía. Si
la glucemia cayera abruptamente, el cerebro no podría producir cantidades adecuadas de ATP. Se
producirían mareos, seguidos de adormecimiento y eventualmente, coma. Los glóbulos rojos se

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verían afectados por falta de energía, disminuyendo el transporte de oxígeno a los tejidos. Por ello los
niveles de glucemia están finamente regulados.
Cuando la concentración de glucosa en sangre se aproxima al valor normal del ayuno de 70 a 110
mg%, alrededor de 2 horas después de la ingesta, se activa la glucogenolisis en el hígado. El
glucógeno hepático es la fuente principal de glucosa plasmática durante las primeras horas del ayuno
y luego, la gluconeogénesis empieza a ser importante como fuente de glucosa. Los precursores
utilizados en la glucogeneogénesis hepática son aportados por otros tejidos, la degradación de
proteínas en el músculo provee aminoácidos y el tejido adiposo aporta glicerol cuando se movilizan
los depósitos de triacilglicéridos (TAG). Aún durante el ayuno prolongado, la glucemia no cae
dramáticamente. De hecho, aún después de 5 a 6 semanas de ayuno, la glucemia es de alrededor de
65 mg%.
Dentro de los mecanismos homeostáticos que permiten regular la disponibilidad de moléculas
combustibles, el control hormonal es uno de los más importantes. La insulina (sintetizada en las
células β del páncreas) y el Glucagón (sintetizada en las células α del páncreas) son las principales
hormonas que regulan el almacenamiento y la utilización de combustibles. La Insulina es una
hormona anabólica que promueve el almacenamiento de combustibles, mientras que el Glucagón es
la hormona que estimula la movilización de combustibles. Otras hormonas como la adrenalina, son
liberadas como respuesta del SNC a la hipoglucemia, al ejercicio y a otros tipos de estrés fisiológico,
junto con otras hormonas del estrés (glucocorticoides), la adrenalina aumenta la disponibilidad de
combustibles.
La insulina es sintetizada por el páncreas ante niveles elevados de glucemia. En particular, la insulina
promueve a) el descenso de los niveles de glucosa en sangre b) el almacenamiento de glucosa como
glucógeno en hígado y músculo c) la conversión de glucosa en TAG en hígado y su almacenamiento
en el tejido adiposo d) el transporte de aminoácidos y la síntesis de proteínas en músculo e) la síntesis
de proteínas en el hígado (por ej. la albúmina) f) el transporte de glucosa al músculo y al tejido adiposo
f) la incorporación de glucosa al interior de las células mediante la interacción con receptores (GLUT)
d) La oxidación de la glucosa principalmente mediante la glucólisis.
El Glucagón por su parte 1) estimula la liberación de glucosa a partir del glucógeno hepático 2)
estimula la gluconeogénesis hepática a partir de lactato, glicerol y aminoácidos 3) moviliza los ácidos
grasos de los TAG del tejido adiposo como fuente alternativa de combustible. Es decir tiene un efecto
opuesto a la insulina.
Otras hormonas cuyos efectos son opuestos a los efectos de la Insulina son la Adrenalina, la
Noradrenalina y el Cortisol. Sólo la Insulina y el Glucagón se liberan como respuesta directa al

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cambio de combustibles en la sangre. La liberación de las otras hormonas es mediada por señales
neurales.
La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad caracterizada por estados de hiperglucemia.
Dependiendo de la causa de la DM, los factores que contribuyen a la hiperglucemia pueden ser
deficiencia de la secreción de insulina, decremento del consumo de glucosa o aumento de la
producción de esta.
Los síntomas principales de la diabetes mellitus son emisión excesiva de orina (poliuria), aumento
anormal de la necesidad de comer (polifagia), incremento de la sed (polidipsia), pérdida de peso sin
razón aparente, pérdida de la agudeza visual, entre otros.
Con el tiempo, el exceso de glucosa en la sangre puede dañar los ojos, los riñones y el sistema nervios,
causar enfermedades cardíacas, derrames cerebrales, complicaciones en la piel, predisposición a
infecciones, entre otros.
Los dos grandes grupos en que se clasifica la Diabetes mellitus son:
Diabetes tipo I: es el resultado de la deficiencia completa o casi total de insulina.
Es una enfermedad consecuencia de interacciones de factores genéticos, ambientales e inmunológicos
que culminan en la destrucción de las células beta del páncreas y la deficiencia de insulina.
La causa de esta enfermedad es un proceso auto inmunitario que ataca a las células beta de los islotes
de Langerhans, llevando a una deficiencia total en la síntesis de insulina.
Diabetes tipo II: es un grupo heterogéneo de trastornos que se caracterizan por grados variables de
resistencia a insulina, menor secreción de dicha hormona y una mayor producción de glucosa.
La mayor parte de los estudios se inclinan a favor de que la resistencia a dicha hormona precede a los
defectos en su secreción, y que solo cuando esto se produce se manifiesta la enfermedad.
Otros tipos de Diabetes:
Diabetes del joven de inicio en la madurez (MODY): Es un subtipo de Diabetes Mellitus
transmitida por herencia autosómica dominante que se caracteriza por manifestación precoz de la
hiperglucemia (antes de los 25 años) y alteración de la secreción de insulina.
Diabetes gestacional
Durante el embarazo se puede desarrollar y descubrir por primera vez intolerancia a la
glucosa. Aparece en el periodo de gestación en 3 a 5% de las embarazadas. La placenta
produce una serie de hormonas que son necesarias para el crecimiento y desarrollo del feto,
pero que inducen resistencia a la insulina. El páncreas produce y libera más insulina para
compensar esta situación en el 95% de los casos, pero en un 5% restante no puede producir

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la cantidad de insulina adecuada y aparece hiperglucemia y diabetes gestacional, situación
muy parecida a la diabetes tipo 2.
La mayoría de las mujeres recuperan una tolerancia a la glucosa normal después del parto, pero
tienen un riesgo sustancial (30 a 60%) de padecer diabetes en etapas posteriores de la vida.

Criterios diagnósticos de la diabetes mellitus

1. Síntomas de diabetes más una glucemia casual mayor o igual a 200 mg/dl. Casual es
definido como en cualquier momento del día sin respetar el tiempo desde la última ingesta.
2. Glucosa plasmática en ayuno igual o mayor a 126 mg/dl. El ayuno es definido como la no
ingesta calórica de por lo menos 8 horas.
3. Glucosa plasmática mayor o igual a 200 mg/dl a las 2 horas durante la prueba de tolerancia
oral a la glucosa. Este test debería ser realizado como fue descrito por la OMS, usando una
carga de glucosa que contenga un equivalente a 75g de glucosa anhidra disuelta en agua 375
ml de agua.
Si no aparecen las manifestaciones clínicas clásicas, el diagnóstico se puede efectuar cuando
hay sendas pruebas sanguíneas anormales o una misma prueba anormal en dos días
diferentes.

Existen 2 parámetros que nos indican la “memoria glucémica del paciente”, ellos son: la
Hemoglobina glicosilada (HbA1c) y la Fructosamina.

Hemoglobina Glicosilada (HbA1c)

En condiciones normales el eritrocito vive en la circulación un promedio de 120 días. El mayor
componente del eritrocito, es hemoglobina que en el adulto el 97% corresponde a la HbA. El contacto
permanente del eritrocito con glucosa, hace que la HbA una glucosa a su estructura molecular
denominándose entonces HbA1 (hemoglobina glicosilada). La glicosilación no enzimática de la HbA
es proporcional a la concentración de estas sustancias en el torrente sanguíneo durante el lapso de
vida de la célula. En este sentido una fracción HbA1, la HbA1c es utilizada como marcador para el
seguimiento del historial de glucemia del paciente. La HbA1c nos va a informar de la media de los
valores de glucemia durante las 6 u 8 semanas anteriores a la extracción de sangre.
Se consideran normales valores de HbA1c entre 4,5-6%. Valores superiores al 6,0% indican elevados
niveles de glucemia durante 6-8 semanas previos al análisis.

Fructosamina

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Al igual que ocurre en el caso de la hemoglobina del eritrocito, las diferentes proteínas séricas
también sufren glicosilación no enzimática como consecuencia de los elevados niveles de
glucosa. El enlace covalente de la glucosa con los residuos lisina de las proteínas da origen
a bases de Schiff que en una segunda etapa se convierten irreversiblemente en cetoaminas
(Fructosaminas). El término "fructosamina" se refiere de manera general a las proteínas
glicosiladas del suero, pero en la práctica este refleja básicamente la concentración de
albúmina glicosilada (la más abundante de las proteínas séricas). Existen diferentes
metodologías para su medición, pero uno de los métodos más utilizados se basa en la
habilidad de estas cetoaminas de reducir al colorante azul de nitrotetrazolio (NBT) en medio
alcalino, y su posterior medición espectrofotométrica.
Sus valores normales son de 1.8 a 2.8 mmol/l, valores superiores indican alteraciones en los
niveles de glucemia del paciente 2-3 semanas antes de la determinación.

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El resto de los análisis antes mencionados utilizados en el monitoreo y seguimiento del estado de un
paciente diabético (colesterol y triglicéridos, creatininemia, uremia, electrolitos plasmáticos,
microalbuminuria,) serán considerados y desarrollados en los trabajos prácticos de lípidos y función
renal respectivamente.
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Parte experimental
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Debido a que se trabajará con muestras biológicas de diferentes pacientes deben usarse los
elementos de protección personal y seguirse las medidas de seguridad indicadas en el TP Nº1
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A- Determinación de glucemia en muestras de suero y plasma por el método enzimático
-Analizar los niveles de glucemia en dos muestras diferentes mediante el método
enzimático/colorimétrico siguiendo el protocolo del kit comercial utilizado (ver anexo A).
- Realizar las mediciones de absorbancia de las muestras y el estándar en el espectrofotómetro a
λ 505 nm, llevando previamente a 0% A con el balnco de reactivo.
-Realizar en base a la absorbancia del estándar y de la muestras el cálculo de la concentración de
glucosa en ésta últimas.
Muestras: Suero o plasma. En el caso de que la muestra a emplear sea plasma, deberá utilizarse
anticoagulante. En el caso de trabajar con suero debe realizarse la determinación de glucemia dentro
de los 30 minutos.
B- Determinación de HbA1c
-Preparación del hemolizado: A una alícuota de sangre entera se le adicionará el reactivo de lisis
(Ftalato de potasio 50 mmol/l, detergente 5g/l, Azida de sodio 0,95g/l, pH=5,0) con el objetivo de
generar la hemólisis de los eritrocitos y la liberación de la hemoglobina.
-Dicho hemolizado será filtrado a través de una columna de intercambio catiónico, en la cual quedarán
retenidas las diferentes fracciones de hemoglobina glicosilada (HbA1a,b,c).
-Mediante sucesivos lavados de la columna con buffer fosfato 30 mmol/L serán eluidas las fracciones
HbA1a,b, quedando retenida la fracción HbA1c.
-La fracción HbA1c será eluida utilizando buffer fosfato 30 mmol/L. La misma será recolectada en
un tubo de ensayo, procediendo a la lectura de la absorbancia (λ 415 nm) utilizando como blanco
agua destilada.
- Posteriormente se calculará el % de HbA1c respecto a la Hb-Total, comparando las absorbancias de
la fracción eluida con la absorbancia del total de las hemoglobinas presentes en el hemolizado.
- Deberá seguirse cuidadosamente los pasos descriptos en el kit comercial utilizado (ver anexo B)

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Muestra: Sangre total recogida mediante procedimientos estándares. Puede utilizarse EDTA o
heparina como anticoagulante.

C- Determinación de Fructosamina
-Serán determinados los niveles de fructosaminas (cetoaminas) en muestras de suero o plasma
empleando un método colorimétrico, basado en la capacidad del grupo cetoamino de reducir las sales
de tetrazolio (NTB) en medio alcalino a Formazán (compuesto coloreado).
-El método empleado es un método cinético, donde la velocidad de formación del Formazán es
directamente proporcional a la concentración de fructosamina en la mustra. Por ello se procederá a la
medición de las absorbancias λ 530 nm (muestra + reactivo colorimétrico) a los 10 y 15 min de
reacción respectivamente.
-Los valores de fructosamina en la muestra serán calculados por comparación de la absorbancia
obtenida con la de un estándar de concentración conocida.
- Deberán seguirse cuidadosamente los pasos descriptos en el kit comercial utilizado (ver anexo C)

D- Informar los resultados obtenidos y los valores de referencia para cada determinación.
Indicar:
- Si los resultados serían indicativos de Diabetes
- Si existe correlación entre los diferentes análisis
- ¿El paciente tuvo controlada la glucemia las últimas 6 semanas?.