Papel patogénico de los antígenos citrulinados circulantes y los anticuerpos peptídicos

citrulinados monoclonales anticíclicos en la artritis reumatoide.

Resumen
Examinamos si es posible detectar directamente antígenos citrulinados en el suero de
pacientes con artritis reumatoide (AR) utilizando un anticuerpo monoclonal (mAb)
diseñado para ser específico para péptidos citrulinados. Con el fin de confirmar el potencial
del mAb como sustancia inductora directa de artritis a través del modelo experimental de
AR, se generó un anticuerpo monoclonal (mAb) 12G1 mediante inmunización de ratones
con un péptido citrulinado cíclico desafiante. El análisis inmunohistoquímico del tejido
sinovial afectado por AR mostró que nuestro mAb 12G1 podía detectar proteínas
citrulinadas en tejidos diana. Posteriormente, se midieron los niveles séricos de colágeno
citrulinado tipo II y filagrina en voluntarios sanos, pacientes con AR, espondilitis
anquilosante (EA) y lupus eritematoso sistémico (LES) utilizando un ELISA tipo sándwich
basado en 12G1. Esto mostró que la filagrina citrulinada mostró una sensibilidad del 78,9%
y una especificidad del 85,9% para el diagnóstico de AR con un valor de densidad óptica
(DO) de corte de 1,013, comparable con los resultados de una prueba de anticuerpos anti-
proteína citrulinada (ACPA) de segunda generación. Se detectaron filagrina y colágeno
citrulinado circulante incluso en sueros de pacientes con AR que eran negativos tanto para
el factor reumatoide (FR) como para ACPA. Los resultados de ELISA también mostraron
que los títulos de RF y ACPA mostraron una correlación significativamente positiva con
los valores de DO de colágeno citrulinado y filagrina en sueros de pacientes con AR. El
desafío de 12G1 agravó la gravedad de la artritis murina. En resumen, mAb 12G1 puede
detectar directamente proteínas citrulinadas en tejido diana con AR y en sueros de pacientes
con AR y 12G1 mostró potencial artritógeno directo.in vivo . Esto, 12G1 podría ser útil
para el diagnóstico de AR, incluida la AR seronegativa, y puede ayudar a dilucidar el papel
fisiopatológico de la citrulinación en la AR.

Introducción
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria sistémica crónica caracterizada
por la inflamación de la membrana sinovial que recubre las articulaciones y daño articular
progresivo. Aunque la patogenia de la AR sigue siendo incierta, está cada vez más claro
que las respuestas inmunitarias celulares alteradas desempeñan un papel. La presencia de
linfocitos T autorreactivos y autoanticuerpos son las principales características de la AR, y
ambos son detectables en las primeras etapas de la enfermedad. Los autoanticuerpos,
incluido el factor reumatoide (FR), se pueden detectar en muestras de suero y líquido
sinovial (SF) de pacientes con AR.
La citrulinación es una modificación postraduccional realizada por la enzima peptidil-
arginina deiminasa (PAD), que convierte el aminoácido arginina en el aminoácido no
codificado citrulina. Esta modificación puede detectarse en las articulaciones inflamadas de
ratones y en el tejido sinovial afectado por AR en humanos. Las proteínas que albergan
epítopos citrulinados son los antígenos dominantes reconocidos por los autoanticuerpos en
el suero de los pacientes con AR. Por ejemplo, la filagrina contiene muchos residuos de
arginina, y los anticuerpos anti-filagrina citrulinados purificados de sueros con AR pueden
reconocer (pro) filagrinas sólo cuando las filagrinas están citrulinadas.
La presencia de anticuerpos anti-proteína citrulinada (ACPA) es un sello distintivo de la
AR. Después de que se reveló la presencia en la sangre de pacientes con AR y su
importancia clínica de ACPA, la importancia fisiopatológica de ACPA o citrulinación se ha
demostrado a través de numerosos estudios. Dado que la generación de antígenos
citrulinados y la ACPA resultante está directamente implicada en la patogénesis de la AR
en relación con el desarrollo o la progresión de la enfermedad, se han realizado estudios
sobre la expresión de las células B productoras de ACPA y sus características
inmunológicas. Estudios recientes mostraron un mecanismo de propagación del epítopo de
la respuesta ACPA contra antígenos citrulinados a través de repertorios de plasmablastos
ACPA. De hecho, el ACPA derivado de pacientes con AR puede reconocer
específicamente el residuo de citrulina en gran medida independiente de la secuencia del
epítopo del péptido. Un artículo reciente de Tilvawala et al. demostraron que proteínas
citrulinadas asociadas a AR en muestras de suero, líquido sinovial y tejido sinovial
mediante análisis proteómico. Identificaron más de 150 proteínas citrulinadas nuevas y
validaron el papel de la citrulinación en las proteínas diana identificadas en su estudio.
Con base en los informes anteriores de que los antígenos citrulinados están presentes en las
articulaciones, el líquido sinovial y los tejidos sinoviales de los pacientes con AR, es
posible que se puedan detectar autoantígenos citrulinados solubles en el suero o SF de los
pacientes con AR utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas tipo sándwich
(ELISA ). Algunos estudios previos han verificado un método para detectar la
citrulinación. Senshu y col. desarrolló un método para detectar proteínas citrulinadas
utilizando membranas de difluoruro de polivinilideno. Una década después de ese informe,
se desarrolló un anticuerpo monoclonal (mAb) IgM, denominado F95, utilizando tecnología
de hibridoma. La tinción con F95 reveló una mayor presencia de proteínas citrulinadas
intracelulares en el tejido sinovial afectado por la AR (53%) en comparación con el tejido
de control (5%), pero el patrón de tinción extracelular de F95 no era específico de la
AR. Se generó F95 contra un péptido decacitrulinado que comprende 10 residuos de
citrulina y una proteína portadora, y no fue concluyente si F95 podría distinguir residuos de
citrulina de residuos de arginina en las proteínas diana. Ningún estudio ha informado de la
detección de péptidos citrulinados intactos con un anticuerpo diseñado artificialmente
específico para péptidos citrulinados circulares (CCP).
El objetivo del presente estudio fue generar un mAb que reconozca diversas proteínas
citrulinadas y confirmar su capacidad para detectar autoantígenos citrulinados directamente
en muestras de AR. Generamos mAb, denominado 12G1, para detectar proteínas
citrulinadas directamente en tejido sinovial afectado por AR. Se desarrolló un ELISA tipo
sándwich basado en autoantígenos citrulinados detectados con 12G1 en sueros de pacientes
con AR. Los niveles de colágeno citrulinado y filagrina fueron significativamente más altos
en los sueros con AR que en los sueros de control sano, espondilitis anquilosante (EA) o
pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES). Curiosamente, se detectaron niveles más
altos de filagrina citrulinada en pacientes con AR que no tenían ni RF ni ACPA
(seronegativos) en comparación con los controles. Los valores de densidad óptica (DO) de
colágenos citrulinados y filagrina en pacientes con AR se correlacionaron positivamente
con los títulos del factor reumatoide (RF) y ACPA. 12G1 mostró potencial artritogénico en
un modelo murino de artritis inflamatoria en nuestro presente estudio.

Materiales y métodos
Ratones
Se compraron ratones hembra BALB / c (6 semanas de edad) y ratones hembra DBA1 / J (5
semanas de edad) en OrientBio (Seongnam, Corea) y se alojaron en condiciones específicas
libres de patógenos. Todos los procedimientos que involucran animales se realizaron de
acuerdo con la Ley de Bienestar de los Animales de Laboratorio, la Guía para el Cuidado y
Uso de Animales de Laboratorio y las Pautas y Políticas para Experimentación con
Roedores provistas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la
Facultad de Medicina de la Universidad Católica. Universidad de Corea. Este protocolo de
estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Católica de
Corea (CUMC-2011-0062-03 y CUMC-2018-0338-01).

Inmunización de ratones y preparación del mAb

Se sintetizaron un CCP (HQCHQEST X GRSRGRCGRSGS; X = citrulina) y un péptido no
citrulinado (NCP: HQCHQEST R GRSRGRCGRSGS). El CCP sintético se mezcló con
adyuvante completo de Freund y se usó para inmunizar cuatro ratones BALB / c hembra de
6 semanas de edad mediante inyección en la cavidad abdominal. Para el refuerzo, los
ratones se inyectaron con CCP diluidos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 4 y
8 semanas después de la primera inmunización. Tres días después, las células B se aislaron
del ratón con la mayor reactividad de unión contra los PCC en el suero, medida por ELISA
(los detalles se proporcionan en el método descrito a continuación) y se fusionaron con
células de mieloma (Sp2 / 0-Ag14) usando polietileno. glicol (Roche, Basilea, Suiza).
Las células fusionadas se cultivaron luego en medio de cultivo de hipoxantina-
aminopterina-timidina (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.). Las células que mostraban una
señal positiva en el ELISA se transfirieron a una placa de 24 pocillos. Después de colocar
las células individuales en pocillos separados en placas de 96 pocillos, las células se
cultivaron durante 7 a 10 días en medio de cultivo de hipoxantina y timidina (Gibco /
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) En una incubadora de CO2 al 5% a
37ºC. ° C. Las células de hibridoma se cribaron mediante ELISA y se repitió el proceso de
clonación hasta que se seleccionó el clon secretor de anticuerpo final.

ELISA para detección de anticuerpos

Los CCP y los NCP (control negativo) se diluyeron a 5 μg / ml en tampón de recubrimiento
y se recubrieron 50 μl en pocillos separados de una placa ELISA durante la noche a 4 ° C o
durante 2 horas a 37 ° C. Las placas se bloquearon con leche desnatada al 2% en solución
salina tamponada con Tris con Tween 20 a 37ºC durante 1 hora. Se añadió a los pocillos
suero de ratones inmunizados o el sobrenadante de las células de hibridoma, y las placas se
incubaron durante 2 horas a TA. Las placas se lavaron y se añadieron 50 µl de IgG de cabra
anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) a cada pocillo durante 1
hora a TA. Finalmente, se agregaron 50 μl de sustrato cromogénico (SurModics, Eden
Prairie, MN, EE. UU.) A cada pocillo y las placas se incubaron durante 30 minutos, luego
de lo cual se agregaron 50 μl de solución de parada (H2SO4 1N). La absorbancia se leyó a
450 nm en un lector ELISA VERSAmax.

Extracción de ARN total y síntesis de ADNc de regiones variables de anticuerpos

Las células de hibridoma productoras de anticuerpos monoclonales se generaron como se
describe anteriormente ( 2.2 ), y el ARN total se extrajo usando el kit de extracción de ARN
total Easy-Blue (Intron Biotechnology, Sungnam, Corea) de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. Además, se utilizó un cebador oligo dT con transcriptasa inversa (Promega,
Madison, WI, EE. UU.) Para transcribir de forma inversa el ARN extraído en ADNc, y los
genes de las cadenas pesada y ligera de nuestro anticuerpo monoclonal sintético se
amplificaron a partir de ADNc usando la ADN polimerasa Ex-Taq. (Takara Bio, Shiga,
Japón) con cebadores específicos descritos y aminoácidos completos y nucleótidos
clonados para el anticuerpo usando como se describe.

Citrulinación in vitro
El colágeno humano de tipo II (Creative Biomart, Shirley, NY, EE. UU.), La fibronectina
(Sigma-Aldrich / Thermo Fisher Scientific) y la filagrina (Biomatik, Cambridge, Ontario,
Canadá) se sometieron a citrulinación in vitro con PAD derivada de músculo esquelético de
conejo. (Sigma-Aldrich) a 5 unidades / mg de proteína durante 3 horas a 48 ° C en tampón
de citrulinación que contiene Tris-HCl 100 mM (pH 7,4), CaCl2 10 mM y ditioeritritol 5
mM

Detección de proteínas citrulinadas in vitro por anticuerpo proteico anti-citrulinado

artificial
En el ELISA, se recubrieron placas de 96 pocillos con 10 μg / ml de proteínas citrulinadas y
no citrulinadas in vitro durante la noche a 4 ° C. Las placas se lavaron y bloquearon con
BSA al 1% durante 1 hora a TA, se lavaron de nuevo y se incubaron con 20 μg / ml del
mAb 12G1 durante 2 horas a TA seguido de incubación con IgG anti-ratón conjugado con
HRP durante 1 hora a TA . La DO a 450 nm se midió después del tratamiento con 3,3 ',
5,5'-tetrametilbencidina (sustratos de TMB; ebioscience / Thermo Fisher Scientific) y
solución de parada (H 2 SO 4 1 N ).

Western Blot e isotipado

Los péptidos sintéticos, CCP y NCP, son demasiado pequeños para ser detectados por
Western Blot, por lo que los conjugamos con BSA. Se cargaron proteínas citrulinadas y no
citrulinadas en geles SDS-PAGE. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron
a membranas de nitrocelulosa, que luego se incubaron con el anticuerpo de interés en
tampón de bloqueo (leche desnatada al 5% en PBS que contiene 0.05% de Tween 20 (PBS-
T)) durante 1 hora a temperatura ambiente o 12-14 horas a 4 ° C. Después de lavar con
tampón de bloqueo, los anticuerpos unidos se detectaron mediante incubación con
anticuerpos secundarios conjugados con HRP y se visualizaron mediante
quimioluminiscencia. El subtipo de mAb 12G1 se analizó utilizando el kit de isotipado de
anticuerpos monoclonales de ratón (Invitrogen / Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Inmunohistoquímica
Los tejidos sinoviales de pacientes con AR, pacientes con OA y donantes sanos se
incluyeron en parafina, se seccionaron, se montaron en portaobjetos y se hornearon a 60 ° C
durante 60 minutos. A continuación, las secciones se desparafinaron y rehidrataron a través
de una serie de alcoholes graduados, terminando con un enjuague con agua del grifo. Los
portaobjetos se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 minutos para
bloquear la peroxidasa endógena. A continuación, los portaobjetos se lavaron con agua del
grifo y se bloquearon con suero de caballo normal al 10% más BSA al 1% en PBS. Después
de lavar con PBS-T, los portaobjetos se incubaron con el mAb 12G1 (1:50) durante la
noche a 4 ° C. Se aplicó durante 40 minutos a RT, seguido por la RTU VECTASTAIN: Un
anticuerpo anti-ratón de caballo biotinilado IgG secundario (200 1) ®Reactivo Elite ABC
durante 10 minutos. La tinción del tejido se visualizó después de la incubación con la
solución de cromógeno de sustrato DAB (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.)
Durante 1 minuto y 30 segundos. Los portaobjetos se tiñeron por contraste con
hematoxilina durante 1 minuto, se deshidrataron y se montaron.
Para el tejido de ratón, las articulaciones se incrustaron en parafina, se seccionaron, se
desparafinaron en xileno y se hidrataron usando etanol diluido en serie, terminando con un
enjuague con agua del grifo. Para bloquear la peroxidasa endógena, las secciones se
incubaron en H 2 O 2 al 3% diluido en PBS durante 15 min y se lavaron con agua del
grifo. Los portaobjetos se incubaron con agente de bloqueo de IgG de ratón sobre ratón
(MOM) de un kit básico MOM durante 30 min para bloquear la unión de anticuerpos
inespecíficos. El mAb 12G1 (1: 100) se diluyó en tampón diluyente MOM y se incubó
durante la noche a 4ºC. A biotinilado reactivo anti-Ig de ratón se aplicó durante 10 minutos
a RT seguido por RTU VECTASTAIN ®Reactivo Elite ABC durante 10 min. A
continuación, las secciones se incubaron con solución de DAB durante 1 min. Los
portaobjetos se tiñeron por contraste con hematoxilina durante 30 segundos, se
deshidrataron y se montaron.
Para todos los casos, el control de isotipo (negativo) fue un mAb IgG2 de ratón (Cell
Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.) Y los portaobjetos se visualizaron
utilizando el sistema de imágenes Leica DM500B (Leica Microsystems Ltd., Wetzlar,
Alemania)

ELISA tipo sándwich para la detección de proteínas citrulinadas en suero humano

En resumen, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos con anticuerpos
policlonales anti-colágeno (Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-filagrina (Santa Cruz
Biotechnology, Dallas, Texas, EE. UU.) O anti-fibronectina (Abcam) (dilución 1: 100 ) en
100 μl de tampón de recubrimiento (eBioscience) y se incubó durante la noche a 4 ° C. Las
placas se lavaron siete veces con PBS-T y se incubaron con tampón de ensayo
(eBioscience) durante 1 ha temperatura ambiente (RT). Las placas se lavaron de nuevo siete
veces con PBS-T. Se añadieron muestras de suero (1:10 diluidas en PBS) a cada pocillo por
triplicado y las placas se incubaron durante 2 ha TA. Las placas se lavaron siete veces con
PBS-T, y luego se añadió el mAb 12G1 (1: 100 diluido en tampón de ensayo) y las placas
se incubaron durante 2 ha TA. Después de la incubación, las placas se lavaron siete veces
en PBS-T, Se añadieron 50 \ mu l de anticuerpo IgG anti - ratón conjugado con HRP (1:
3000, Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) y las
placas se incubaron durante 1 hora más a 37ºC. Finalmente, las placas se lavaron nueve
veces y se visualizaron los anticuerpos unidos mediante la adición de solución de sustrato
(eBioscience). Las reacciones se detuvieron después de 15 minutos añadiendo 50 µl de
solución de parada (eBioscience). La reacción colorimétrica se midió a 450 nm en un lector
ELISA VersaMax

Sujetos humanos
Se obtuvieron muestras de tejido sinovial de pacientes con AR y pacientes con OA en el
momento de la cirugía de reemplazo total de rodilla. Se obtuvieron muestras de suero de
148 pacientes con AR (106 mujeres y 42 hombres), 57 pacientes con EA (18 mujeres y 39
hombres) y 60 pacientes con LES (1 hombre y 59 mujeres) que acudieron al Servicio
Ambulatorio de la División de Reumatología. en el Hospital St. Mary de Seúl en la
Universidad Católica de Corea entre mayo de 2015 y agosto de 2018. Todos los pacientes
con AR que cumplieron con los criterios del American College of Rheumatology (ACR)
para la AR y los criterios de 2010 ACR / European League Against Rheumatism fueron
incluidos en el estudio. Pacientes con EA y LES que cumplieron con los criterios de
clasificación ASAS y los criterios SLICC SLE 2012, respectivamente. Se incluyeron como
controles setenta y un voluntarios sanos (62 mujeres y 9 hombres). La AR de inicio en la
vejez (EORA) se definió como la edad de inicio de la AR ≥ 60 años, y la AR de inicio
joven (YORA) se definió como los síntomas de la AR que se desarrollan entre las edades
de 18 y 59 años. La AR temprana (ERA) se definió como una duración de la enfermedad de
<6 meses.
Las muestras de suero se almacenaron a –80 ° C hasta el momento del análisis. Este estudio
fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital St. Mary de Seúl y se
realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Todos los pacientes procuraron su
consentimiento escrito.

Datos clínicos y medición de marcadores inflamatorios

Se obtuvieron datos sobre la edad, el sexo, la duración de la enfermedad, la velocidad de
sedimentación globular (VSG), el nivel de proteína C reactiva (PCR), el nivel de ACPA y
el título del factor reumatoide (FR) para cada paciente. El título de RF se midió usando un
ensayo inmunoturbidimétrico mejorado con partículas y un nivel> 15 U / ml se consideró
positivo. El título de ACPA se midió en un inmunoensayo de micropartículas
quimioluminiscentes (ensayo ARCHITECT anti-péptido citrulinado cíclico), que es una
prueba de segunda generación para ACPA; un nivel superior al valor de corte de 5 U / ml se
consideró positivo (según lo sugerido por el fabricante). La VSG se midió mediante el
método Westergren. La PCR se midió mediante un método inmunonefelométrico y los
valores> 5 mg / l se consideraron positivos.

Inducción de modelos de ratón

Los ratones se organizaron en 4 grupos de 5 ratones cada uno: CIA (artritis inducida por
colágeno) como control normal; vehículo como control negativo; 12G1; y 12G1 con
lipopolisacárido (LPS). Para inducir la CIA, se administraron por vía intradérmica 2 mg /
ml de colágeno bovino tipo II (CII; Chondrex, Redmond, WA, EE. UU.) Emulsionado con
2 mg / ml de adyuvante completo de Freund (Chondrex) por vía intradérmica a ratones
DBA1 / J de 6 semanas de edad. Después de 21 días, se inyectó la misma concentración de
CII emulsionada con adyuvante incompleto de Freund (IFA; Chondrex) en los ratones
CIA. Para inducir artritis usando el mAb 12G1, se inyectó mAb 12G1 diluido con PBS (1,5
mg por ratón) en lugar de la mezcla de CII e IFA. Después de 7 días, se inyectó de nuevo la
misma concentración de mAb 12G1 o se administró LPS a 50 µg / µl. La misma
concentración de 12G1 mAb se combinó con perlas quelantes de CCP (Santa Cruz
Biotechnology) durante 4 ha 4 ° C, seguido de centrifugación (250 g, 30 s); los
sobrenadantes resultantes se recogieron y se inyectaron en los ratones como vehículo.
El desarrollo de artritis se controló y puntuó de forma ciega. La gravedad de la enfermedad
se puntuó tres veces por semana. La gravedad de la artritis en cada pata delantera y trasera
se puntuó de 0 a 4 (0, normal; 1, hinchazón leve confinada a los tarsales; 2, hinchazón de
dos o más dedos o articulaciones, o aumento de la hinchazón; 3, hinchazón moderada que
se extiende desde el tobillo hasta las articulaciones metatarsianas y 4, hinchazón intensa
que abarca el tobillo, el pie y los dedos). Se determinó una puntuación de artritis
representativa sumando las puntuaciones de las cuatro patas
Análisis histológico
Los tejidos de las articulaciones de las patas traseras se fijaron en paraformaldehído al 4%,
se descalcificaron en solución descalcificadora de huesos con EDTA al 10% y se
embebieron en parafina. Se prepararon secciones de parafina de 4 μm de espesor y se
tiñeron con H&E, safranina O y azul de toluidina.
Las puntuaciones de inflamación y destrucción articular se midieron microscópicamente
utilizando el procedimiento de Huckel et al. por tres investigadores individuales de forma
ciega. La puntuación de inflamación se midió utilizando la gravedad de la infiltración y la
formación de pannus. La puntuación de destrucción se midió en función de la destrucción
de cartílago y hueso 
Análisis de citometría de flujo
Las muestras de bazo se disociaron en suspensiones unicelulares y se transfirieron 2 x
10 6 células a tubos de poliestireno de fondo redondo (BD Biosciences, CA, EE.
UU.). Después de lavar con PBS suplementado con FBS al 2%, las células del bazo de
ratón se tiñeron con un anticuerpo de rata anti-CD4 de ratón (2 μg / ml) conjugado con
aloficocianina (APC) (eBioscience, CA, EE. UU.). A continuación, las células se
permeabilizaron usando tampón de fijación y permeabilización de citometría de flujo
(eBioscience) y se tiñeron con un anticuerpo anti-humano / ratón RORγt (2 µg / ml)
conjugado con ficoeritrina (eBioscience). El análisis de citometría de flujo se realizó
utilizando un analizador de células BD LSR Fortessa (BD Biosciences). Para analizar los
datos, se utilizó el software de análisis de celda única FlowJo V10 (TreeStar Inc., OR, EE.
UU.).

Análisis estadístico
Los datos se analizaron utilizando el software SPSS versión 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL,
EE. UU.) Y se expresan como la media ± SEM o número (%). Los valores medios se
compararon entre múltiples grupos utilizando un análisis de varianza de una vía seguido de
la prueba de Tukey. La prueba de Shapiro-Wilk y la prueba de Levene se utilizaron para
evaluar las distribuciones gaussianas y la igualdad de varianza, respectivamente. Los datos
cualitativos se compararon mediante la prueba de ji cuadrado. Las curvas ROC se
construyeron calculando la especificidad y sensibilidad de cada valor de DO en diferentes
puntos de corte, y se calculó el área bajo la curva. La sensibilidad se definió como el
porcentaje de sujetos con enfermedad (AR o AR seronegativo) que mostraron un resultado
positivo para antígenos citrulinados en el ELISA. La especificidad se definió como el
porcentaje de sujetos sin AR que tuvieron un resultado de ELISA negativo. El VPP se
calculó como el número de verdaderos positivos (resultado de ELISA positivo más AR
confirmado) dividido por el número de sujetos con un resultado de ELISA positivo. El
VPN se calculó como el número de verdaderos negativos (resultado de ELISA negativo y
sin AR) dividido por el número de sujetos con un resultado de ELISA
negativo. TodosLos valores de p fueron de dos colas. Los valores de p <0,05 se
consideraron significativos.

Resultados
Generación de un mAb contra PCC
Para identificar la presencia de autoantígenos circulantes que podrían inducir la producción
de ACPA, generamos un mAb específico para antígenos citrulinados. Primero, sintetizamos
un CCP y un péptido de control de NCP (péptido de arginina cíclico) en el que la citrulina
se reemplazó con arginina (Figura 1A). Este péptido sintético incluía citrulina en una
región particular de la subunidad de filagrina que se cicla a través de un enlace disulfuro y
forma una estructura que favorece el reconocimiento por autoanticuerpos de AR
( 29 ). Luego usamos la tecnología de hibridomas para generar mAbs de alta calidad con
reactividad para el CCP pero no para el NCP (Figura 1B). Se inmunizaron cuatro ratones
con el CCP y se examinó la reactividad de sus anticuerpos séricos al CCP y NCP (Figura
1C). Seleccionamos el ratón número 2 porque sus muestras de suero mostraron una fuerte
reactividad de unión al CCP y una unión débil al control NCP (Figura 1C). Se generaron
clones de hibridoma fusionando una línea celular de mieloma con células B derivadas del
ratón inmunizado con CCP seleccionado. Luego, realizamos un ELISA para identificar
clones secretores de anticuerpos que producían anticuerpos anti-CCP (Figura 1Dy Figura
complementaria 1 ). Este proceso se repitió hasta que aislamos un solo clon (designado
12G1) que secretaba un mAb con alta reactividad al CCP pero no al péptido de control
(asterisco en Figura 1D, selección final). Se confirmó la afinidad de unión de 12G1
( Figura complementaria 2A ). El isotipo del anticuerpo artificial anti-proteína citrulinada
(12G1) fue IgG1, y se secuenciaron las regiones V de las cadenas ligera y pesada de 12G1
( Figura complementaria 2B ).
Figura 1
Generación de un anticuerpo monoclonal (mAb) específico del péptido citrulinado cíclico
(CCP). (A) Secuencias de los dos péptidos sintéticos utilizados como antígenos. Ambos
péptidos compartían la misma secuencia, excepto que el CCP se generó reemplazando un
residuo de arginina con un residuo de citrulina (X = citrulina). La barra indica un enlace
disulfuro entre las dos cisteínas, lo que genera un péptido circular. (B) Diagrama
esquemático que muestra la estrategia para seleccionar clones de hibridoma. Los clones de
hibridoma que secretaban anticuerpos específicos de CCP se obtuvieron mediante selección
repetida. (C)Selección de ratones que muestran serorreactividad frente al PCC. Después de
la primera inyección del CCP, se examinó la reactividad de unión al CCP y al péptido de
arginina cíclica (NCP) usando ELISA (muestras de suero diluidas 1: 100 a 1:
100000). (D) ELISA de clones de hibridoma fusionados que secretaban mAb al
CCP. Después de la fusión, se seleccionaron los clones de hibridoma que secretaban
anticuerpos anti-CCP específicos para el CCP pero no para el NCP. Los clones reactivos al
CCP se aislaron y evaluaron repetidamente hasta que se seleccionó un solo clon que
secretaba anticuerpos anti-CCP de alta reactividad. (MI)El mAb 12G1 se purificó del
sobrenadante del cultivo de hibridoma usando una columna de agarosa Proteína G. Después
de que se cargó el sobrenadante (entrada) en la columna, se eluyó el mAb 12G1 unido en el
tampón de elución (elución). El anticuerpo purificado se confirmó mediante SDS-PAGE y
tinción con azul brillante de Coomassie. (F) La especificidad del mAb 12G1 para el CCP se
examinó mediante transferencia Western. Los conjugados CCP-BSA y NCP-BSA se
procesaron en un gel SDS-PAGE y luego se inmunotransfirieron con el mAb
12G1. (G) Ensayo de isotipado de inmunoglobulina mAb 12G1 (absorbancia de respuesta
positiva ≥ 0,2). (H – J) El sistema ELISA basado en mAb 12G1 detectó eficazmente
colágeno citrulinado (H) , filagrina citrulinada (I)y fibronectina citrulinada (J) . * P
<0,05; ** P <0,01; *** P <0,001.

El mAb 12G1 es específico para la citrulina

Para confirmar que la línea celular de hibridoma seleccionada podría secretar 12G1 intacto,
purificamos el anticuerpo del sobrenadante del cultivo usando perlas de unión al anticuerpo
(Figura 1E). La electroforesis posterior en geles de SDS-PAGE confirmó que el 12G1
purificado tenía una estructura de anticuerpo normal; es decir, una cadena pesada y una
cadena ligera (Figura 1E, carriles 4, 5). Además, para asegurarnos de que el 12G1
reconociera la citrulina, realizamos un ensayo de inmunotransferencia utilizando el CCP y
el NCP como antígenos diana (Figura 1F). Debido a que el CCP y el NCP eran demasiado
pequeños para detectarlos usando geles SDS-PAGE, los conjugamos con albúmina de suero
bovino (BSA). El mAb 12G1 detectó el CCP específicamente y de una manera dependiente
de la dosis (Figura 1F, carriles 1-4). Como era de esperar, el mAb 12G1 no reaccionó con
el NCP (Figura 1F, carriles 5-8). Estos datos demuestran claramente que el mAb 12G1 era
específico para el péptido citrulinado. El ensayo de isotipado de inmunoglobulinas mostró
que la cadena pesada y la cadena ligera de 12G1 se identificaron como IgG1 y cadena
kappa, respectivamente (Figura 1G). A continuación, examinamos si el mAb 12G1 podría
estar disponible en el sistema ELISA tipo sándwich. De ser así, razonamos que nuestro
aACPA tendría uso clínico en el diagnóstico de diversas enfermedades autoinmunes y
autoinflamatorias que involucran citrulinación. Se realizaron experimentos de
citrulinación in vitro usando PAD. Se probaron seis antígenos diana sin tratamiento previo
(colágeno humano tipo II, filagrina, enolasa, BiP, vimentina y fibronectina) y sus
correspondientes antígenos citrulinados para determinar si el aACPA podía detectar las
formas citrulinadas de los antígenos diana. Entre ellos, el colágeno citrulinado, la -filagrina
y la -fibronectina podrían ser detectados por el 12G1 en el sistema ELISA tipo sándwich
(Figuras 1H-J). Estos resultados confirman tanto que nuestro mAb 12G1 es específico
para antígenos citrulinados como que se puede utilizar en un sistema ELISA tipo sándwich.

12G1 detecta autoantígenos citrulinados en tejidos sinoviales de pacientes con AR

Debido a que las proteínas citrulinadas se pueden detectar en el tejido sinovial inflamado de
la AR, a continuación examinamos si 12G1 podría detectar específicamente tales proteínas
en tejidos sinoviales aislados de pacientes con AR. La tinción inmunohistoquímica del
tejido sinovial mostró que 12G1 podría detectar proteínas citrulinadas en los tejidos de la
AR, como esperábamos (Figura 2A). La tinción de control de los mismos tejidos con un
anticuerpo primario de isotipo coincidente irrelevante dio resultados negativos (Figura 2A,
paneles superiores). 12G1 reconoció proteínas citrulinadas en tejido sinovial de tres
pacientes con AR diferentes. Para confirmar que 12G1 era específico para la citrulinación,
también examinamos tejidos sinoviales aislados de tres pacientes con OA (Figura 2B). No
se detectó tinción positiva en los tejidos OA. Estos hallazgos sugieren que los
autoantígenos citrulinados detectados por 12G1 existen en el tejido sinovial afectado por la
AR pero no en los tejidos afectados por la OA. En conjunto, los datos obtenidos hasta ahora
sugieren que el 12G1 podría detectar proteínas citrulinadas en el tejido sinovial de la AR y
que tiene potencial para el diagnóstico de la AR. A continuación, se utilizó 12G1 para la
tinción de tejidos para determinar si las articulaciones de los ratones CIA tenían proteínas
citrulinadas. Los resultados mostraron que las articulaciones afectadas por la CIA contenían
proteínas citrulinadas en la membrana sinovial, pero los ratones de tipo salvaje no (Figura
2C).
Figura 2
El mAb 12G1 es específico para proteínas citrulinadas en el tejido sinovial de la
AR. Imágenes representativas que muestran tinción inmunohistoquímica (IHC) de proteínas
citrulinadas en AR y OA. (A) El análisis IHC se realizó utilizando el mAb 12G1 en
muestras de tejido sinovial articular de tres pacientes con AR (pacientes con AR 1-3). Para
determinar si el mAb 12G1 podía detectar algún antígeno en tejidos sinoviales no
inflamatorios, los tejidos sinoviales de tres pacientes con OA (B) se tiñeron con mAb 12G1
al mismo tiempo. Se utilizó un anticuerpo de control de isotipo como control
negativo. (C)Se tiñó una articulación con artritis inducida por colágeno (CIA) con el mAb
12G1. El recuadro negro muestra el tejido sinovial teñido con un aumento mayor. La
ampliación se indica para cada imagen en esta figura. Todas las barras de escala
representan 100 µm.

12G1 detecta antígenos citrulinados circulantes en suero de pacientes con AR

La citrulinación de los epítopos diana se produce en las articulaciones reumatoides.
Estudios previos han demostrado que las proteínas citrulinadas como el colágeno, la
filagrina y la fibronectina están implicadas en la patogénesis de la AR. Desarrollamos un
ELISA sándwich basado en 12G1 para detectar solo las proteínas citrulinadas en sueros de
pacientes con AR (Materiales y métodos yFigura 3A). Se obtuvieron muestras de suero de
148 pacientes con AR y 71 controles sanos emparejados por edad y sexo. Para determinar si
la presencia de antígenos citrulinados circulantes en sangre era una observación específica
de AR, se realizó ELISA simultáneamente en los sueros de pacientes con EA y LES
(Figura 3B).
figura 3
Análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC) que compara la
sensibilidad y la especificidad del ELISA para medir los niveles de colágeno citrulinado y
filagrina citrulinada en el suero del paciente. Se recubrieron placas con anti-colágeno y
anti-filagrina para capturar los antígenos candidatos. La citrulinación fue detectada por el
12G1. (A) Diagrama esquemático que muestra el método para el ELISA sándwich
utilizando un anticuerpo anti-proteína diana y 12G1. (B) Antígenos citrulinados circulantes
en muestras de suero de pacientes con AR (n = 148), LES (n = 60), AS (n = 57) y sujetos de
control (n = 71) (fila superior) y la curva ROC para cada diana antígeno (fila
inferior). (C)Antígenos citrulinados circulantes en el suero de AR seronegativo (n = 20) y
sujetos de control (n = 71) (fila superior) y la curva ROC para cada antígeno diana (fila
inferior). La especificidad (tasa negativa verdadera [el porcentaje de pacientes con AR
correctamente predicho]) se representa en el eje x, y la sensibilidad (el porcentaje de
pacientes con AR correctamente predicho) se representa en el eje y. Los cálculos se basaron
en la probabilidad predicha de que cada sujeto estuviera por encima de los valores límite de
DO. Los valores de p se calcularon utilizando la prueba U de Mann-
Whitney . * P <0,05. (D) Valores de DO de tres autoantígenos citrulinados circulantes para
los sujetos de control, AR negativo para ACPA y AR positivo para
ACPA. (MI)Correlaciones entre colágeno citrulinado circulante y valores de DO de
filagrina y títulos de RF (n = 146, r = 0.644 para colágeno, r = 0.535 para
filagrina, P <0.0001) y títulos de ACPA (n = 143, r = 0.228 para colágeno, r = 0,251 para
filagrina, P <0,01) en pacientes con AR (coeficiente de correlación de Pearson). ** P
<0,01.

Las características clínicas y de laboratorio basales de los pacientes y controles se presentan

en tabla 1. La mayoría de los pacientes con AR fueron seropositivos para RF (71%) o
ACPA (79%). Cincuenta y dos de los pacientes con AR (35,1%) tenían ERA (duración de
la enfermedad <6 meses) y 43 (26,1%) tenían EORA (edad de inicio de la AR ≥ 60
años). Entre los pacientes con AR que tomaban medicamentos (n = 106), sesenta y seis
(62%) pacientes con AR habían recibido prednisolona (dosis media <5 mg / día).
Los datos se expresan como media ± DE o número (porcentaje).
una
 AR, artritis reumatoide; b ESR: velocidad de sedimentación globular; c CRP, proteína C
reactiva; d FR, factor reumatoide; e ACPA, anticuerpo anti-péptido cíclico
citrulinado; f ERA, artritis reumatoide temprana; g EORA, artritis reumatoide de inicio en la
vejez; h Tx, tratamiento. NS significa No significativo.

Se analizaron los valores de DO del ELISA para todos los sujetos incluidos en nuestro
estudio. Los valores medios de DO para el colágeno citrulinado y la filagrina fueron
significativamente más altos en los pacientes con AR que en los controles, los pacientes
con LES y EA (Figura 3B, Panel superior). Por el contrario, los valores de DO de la
fibronectina en el suero de los pacientes con AR no aumentaron en comparación con los
pacientes con HC, LES y AS (datos no mostrados). Completamos un análisis de la curva de
características operativas del receptor (ROC) y usamos las áreas bajo la curva para calcular
la precisión diagnóstica de estos dos antígenos diana (Figura 3B, panel inferior). Los
valores medios de DO de colágeno citrulinado y filagrina en controles sanos y sueros con
AR se muestran en la Tabla complementaria 1 . El análisis de la curva ROC y las AUC se
utilizaron para calcular la precisión diagnóstica de los antígenos diana ( Figuras 3B,
Cy Cuadro complementario 2 ). La sensibilidad, especificidad, razón de verosimilitud,
valor predictivo positivo (VPP), valor predictivo negativo (VPN) y precisión del
diagnóstico de AR según la presencia de filagrina citrulinada fueron 78,9%, 85,9%, 5,6,
92%, 66,3% y 80,8%, respectivamente, cuando se utiliza un valor de corte de DO de
1,013. El cambio del valor de corte de la DO cambió la sensibilidad, la especificidad, el
VPP, el VPN y la precisión ( Tabla 2). La interferencia por RF que podría haber causado
una actividad adicional de falsos positivos no estaba presente en nuestro sistema ELISA
basado en 12G1 (datos no mostrados). En conjunto, estos resultados sugieren que los
niveles de colágeno citrulinado y filagrina en suero podrían ser un biomarcador útil para el
diagnóstico de AR.
Los antígenos citrulinados circulantes también se detectan en pacientes con AR
seronegativa
Debido a que los criterios del ACR de 1987 para el diagnóstico de AR tienen baja
sensibilidad y especificidad, especialmente para pacientes con ERA ( 32 ), se ha
desarrollado un nuevo sistema de clasificación para la AR ( 22). Aunque los nuevos
criterios junto con las pruebas de ACPA han mejorado el diagnóstico precoz de AR, un
resultado negativo para los autoanticuerpos (negatividad tanto para RF como para ACPA)
no descarta un diagnóstico de AR. Aproximadamente el 20% de los pacientes con AR son
seronegativos, lo que significa que no se pueden detectar fácilmente marcadores
serológicos en el suero de estos pacientes. No obstante, el diagnóstico precoz de la AR
seronegativa es clínicamente importante para prevenir la progresión del daño articular. Por
tanto, se necesitan métodos de diagnóstico novedosos para detectar la AR seronegativa. En
este estudio, el nivel circulante de colágeno citrulinado y filagrina fue significativamente
mayor en el suero de pacientes con AR seronegativa (n = 20) que en los controles, aunque
el número de muestras de pacientes con AR seronegativo fue pequeño (Figura
3Cy Cuadro complementario 1 ).
Los niveles de colágeno citrulinado y filagrina en sueros de pacientes con AR ACPA
positivos fueron significativamente más altos que los de pacientes con AR ACPA negativos
o controles sanos. Curiosamente, los valores medios de DO tanto del colágeno citrulinado
como de la fibronectina en el suero de pacientes con AR negativo para ACPA mostraron un
nivel más alto estadísticamente significativo que en los controles sanos (Figura 3D).
Estos resultados sugieren que algunos pacientes con AR podrían tener antígenos
citrulinados circulantes pero no ACPA. Por lo tanto, el uso de 12G1 en un sistema ELISA
podría detectar antígenos citrulinados circulantes y, por lo tanto, ayudar al diagnóstico de
AR. Es necesaria la confirmación de estos resultados en una gran cohorte de pacientes con
AR seronegativa para determinar si se trata de un nuevo método de diagnóstico de AR
negativo para RF y ACPA negativo.

Los niveles de colágeno citrulinado en suero se correlacionan con los títulos de

autoanticuerpos
A continuación, examinamos las relaciones entre las características clínicas y los niveles de
autoantígenos citrulinados en pacientes con AR para determinar si la presencia de antígenos
citrulinados tiene importancia clínica. Los niveles de ninguno de los antígenos citrulinados
examinados se correlacionaron con la actividad de la enfermedad de AR medidos utilizando
una puntuación de actividad de la enfermedad de 28, velocidad de sedimentación globular
(VSG) y proteína C reactiva (PCR) (datos no mostrados). Los niveles de colágeno
citrulinado y filagrina citrulinada en suero no difirieron entre AR establecida (> 6 meses de
duración) y ERA o AR de inicio a edad temprana (edad de inicio <60 años) y
EORA. Curiosamente, los valores de DO para el colágeno citrulinado y la filagrina se
correlacionaron significativamente con los títulos de autoanticuerpos tanto para RF como
para ACPA (Figura 3E).

Otra aplicación para el mAb 12G1: como modelo de ratón para RA

Organizamos un nuevo modelo animal utilizando la aACPA (Materiales y Métodos
y Figura 4A). Esperábamos que el mAb 12G1 fuera tan eficaz como el modelo CIA porque
investigaciones anteriores informaron que la citrulinación podría aumentar la potencia de
un ligando inmune innato endógeno ( 33 ). La perla quelante de CCP se utilizó para crear
un control negativo en nuestro modelo de artritis inducida por mAb 12G1. Después de unir
perlas quelantes de CCP a la proteína A y G del sitio de unión de IgG de mAb 12G1, solo
se inoculó el sobrenadante en ratones. Medimos la puntuación de artritis una vez cada 3
días durante 55 días después de la primera inmunización. La puntuación en el día 55 fue la
más alta en el grupo CIA, el modelo animal estándar de AR más comúnmente utilizado,
seguido por el grupo 12G1 mAb con LPS y el grupo 12G1 mAb solo. El grupo tratado con
vehículo mostró solo una respuesta inflamatoria menor en las articulaciones (Figura 4B).

Figura 4
Se construyó un nuevo modelo animal usando 12G1 mAb, y su función se confirmó por
comparación con el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA). (A) Diagrama
esquemático del modelo animal CIA (un modelo estándar de artritis reumatoide) y el
modelo animal que utiliza el aACPA. (B) Puntuaciones promedio de artritis para los
modelos animales. Esta puntuación se expresa en una escala de 0 a 4 como la suma de las
puntuaciones de gravedad de la artritis para las cuatro patas de cada animal. (C)Análisis
histológico de los tarsales de las patas traseras de cada grupo teñidos con hematoxilina y
eosina (H&E), safranina O y azul de toluidina. Las secciones teñidas con H & E se
ampliaron 50x y 100x; Las muestras de safranina O y azul de toluidina se muestran con un
aumento de 200x. Las puntuaciones histológicas se calcularon como puntuaciones de
destrucción articular (D) y puntuaciones de inflamación (E) por tres observadores de forma
ciega. (F) Tinción inmunohistoquímica (IHC) de proteínas citrulinadas en los tarsales,
magnificada 100x. (G) Medición del área de células positivas para 12G1 mAb por área
total de la articulación tarsal mediante el programa de escáner Slide (3D Histech Ltd,
Budapest, Hungría). (H)Análisis de citometría de flujo de la expresión de CD4 y RORγt en
los bazos de cada grupo. Los porcentajes de CD4 + RORγt + divididos por el total de CD4
+ indican la frecuencia de las células Th17. Todas las barras de escala son de 200 µm y
todos los gráficos se expresan utilizando la media ±
SEM. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001.
Para analizar la infiltración de células inflamatorias, medimos la forma del cartílago y la
destrucción articular en los tarsales mediante un análisis histológico. En el grupo CIA y
12G1 mAb con grupos LPS, observamos más infiltración de células inmunes y destrucción
articular que en el grupo 12G1 mAb solo, aunque el grupo 12G1 mAb con LPS tuvo una
erosión del cartílago ligeramente mayor que los otros grupos con la misma puntuación de
artritis (Figura 4C). Tanto la puntuación de inflamación como la puntuación de destrucción
articular fueron más altas en los grupos CIA y 12G1 con LPS que en los otros grupos, con
pequeñas diferencias entre ellos (Figuras 4D, E ) .
En los ensayos de tinción inmunohistoquímica e inmunofluorescencia, utilizamos el mAb
12G1 para comprobar la cantidad de proteína citrulinada en las articulaciones. El grupo
12G1 mAb con LPS tenía más proteína citrulinada que el grupo CIA (Figura 4F). Este
resultado fue consistente cuando lo verificamos con el programa visor del escáner de
diapositivas (Figura 4G).
Para comparar la respuesta Th17, la población Th17 determinada por la expresión de CD4
+ RORγt + se analizó mediante citometría de flujo. Los resultados mostraron que las
poblaciones de células Th17 eran más altas en los grupos tratados con CIA y 12G1 que en
el grupo de vehículo (Figura 4H).
Discución

El mAb artificial 12G1 descrito en el presente documento mostró una alta reactividad para
péptidos y proteínas citrulinados. El 12G1 detectó proteínas citrulinadas en los tejidos
sinoviales de la AR y se utilizó en un ELISA para detectar autoantígenos citrulinados
circulantes en el suero de la AR. Entre los posibles objetivos de autoantígenos citrulinados
examinados, la filagrina citrulinada mostró la mayor sensibilidad, especificidad, VPP, VPN
y precisión diagnóstica para la AR, lo que sugiere su potencial como marcador serológico
de diagnóstico para la AR.

Aunque no es fácil detectar proteínas citrulinadas (completas o fragmentadas), estudios

previos han identificado la presencia de autoantígenos citrulinados en suero, sinovial y SF
de pacientes con AR. Curiosamente, hubo otros dos intentos similares para detectar
residuos de citrulina de autoantígenos. El primer estudio no fue diseñado para identificar
proteínas citrulinadas directamente y se utilizó la modificación química inducida por la
incubación de muestras con diacetil monoxima y antipirina en una mezcla de ácido fuerte
para reconocer la citrulina. Hace unos 20 años, Nicholas y Whitaker generaron un mAb, al
que denominaron F95, que reconocía epítopos citrulinados en un péptido deca-citrulina. Por
el contrario, aquí generamos el mAb 12G1 para detectar directamente proteínas citrulinadas
vírgenes. La capacidad del mAb 12G1 para detectar tres autoantígenos citrulinados
potenciales (colágeno, filagrina y fibronectina) se verificó en nuestro sistema ELISA
sándwich.

Nuestro mAb se generó contra un péptido sintético que comprende un péptido cíclico que
alberga un único residuo de citrulina, que debería permitir la generación de un mAb de alta
reactividad. Nuestro presente estudio mostró que el mAb 12G1 tiene el potencial de
detectar directamente antígenos citrulinados en tejidos diana mediante
inmunohistoquímica. Generar un mAb cambiando solo un residuo de citrulina (CCP versus
NCP sustituido con arginina) podría proporcionar un mejor método para detectar proteínas
citrulinadas de origen natural que usar el péptido decacitrulinado. La principal ventaja de
nuestro mAb 12G1 es que puede detectar la citrulinación en el suero y la sinovia de los
pacientes con AR sin una modificación previa de las muestras de prueba.

Para investigar la concordancia entre la presencia de autoantígenos citrulinados circulantes

y ACPA, utilizamos una prueba de ACPA de segunda generación disponible
comercialmente para examinar los sueros de 115 pacientes con AR positivos para
ACPA. La mayoría de los pacientes cuyas muestras exhibían proteínas citrulinadas que
alcanzan el mAb 12G1 también dieron positivo para ACPA (datos no mostrados).

Curiosamente, el ELISA basado en mAb 12G1 reveló que algunos pacientes con AR
negativo para ACPA también tenían proteínas citrulinadas circulantes. Usamos el ELISA
basado en mAb 12G1 para medir los niveles de proteínas candidatas, incluyendo colágeno,
filagrina y fibronectina. Creemos que la sensibilidad y la especificidad del mAb 12G1
como herramienta de diagnóstico de AR podría aumentarse ampliando el rango de proteínas
diana y eligiendo diferentes valores de corte óptimos para cada ensayo serológico.

Nuestro hallazgo, que los antígenos citrulinados circulantes pueden ser detectados por el
sistema ELISA basado en 12G1 en pacientes con AR en concentraciones más altas que las
detectadas en sujetos sanos, es consistente con un informe reciente que
implica la citrulinación in vivo y la posterior producción de ACPA en la patogénesis de la
AR. La tinción inmunohistoquímica detectó reactividad en la sinovia afectada por AR,
mientras que no se encontró ninguna señal positiva en los tejidos sinoviales afectados por
OA o sanos. Nuestro estudio preliminar también muestra que la concentración de colágeno
citrulinado circulante en pacientes con AR se correlacionó positivamente con los títulos de
 autoanticuerpos (RF y ACPA). Estos resultados sugieren que el mAb 12G1 podría ser una
herramienta útil en el diagnóstico de AR.

Respuestas actividad:
1.- El objetivo de la investigación es confirmar si es posible detectar antígenos citrulinados
directamente en el suero de pacientes con artritis reumatoide, haciendo uso un anticuerpo
monoclonal creado específicamente para péptidos citrulinados.

2.- Nos permiten observar de forma gráfica los resultados obtenidos de las pruebas
realizadas para poder obtener el anticuerpo monoclonal mAb y también nos muestra como
este anticuerpo logró cumplir con el propósito para el cual fue hecho al mostrar el resultado
de la ELISA donde demuestran que mAb 12G1 detectó eficazmente colágeno citrulinado,
filagrina citrulinada y fibronectina citrulinada.

3.- Se hizo uso de una perla quelante de CCP para crear un control negativo en el modelo
de artritis inducida por mAB 12G1. Se unieron estas perlas a la proteína A y G del sitió de
unión IgG de mAb 12G1. Se midió la puntución de artritis una vez cada 3 días durante 55
días después de la primera inmunización. La puntuación en el día 55 fue la más alta en el
grupo CIA, el modelo animal estándar de AR más comúnmente utilizado, seguido por el
grupo 12G1 mAb con LPS y el grupo 12G1 mAb solo. El grupo tratado con vehículo
mostró solo una respuesta inflamatoria menor en las articulaciones

4.- En base a los resultados obtenidos se sugiere que el mAB 12G1 podría ser una
herramienta útil en el diagnóstico de AR, ya que mostró una alta reactividad para péptidos y
proteínas citrulinados; se confirmo que la herramienta tiene el potencial de detectar
directamente antígenos citrulinados en tejidos diana mediante inmunohistoquímica. Se
realizó una prueba de ACPA para poder comparar los resultados y así medir de cierta
manera la sensibilidad y especificidad; al dar ambas metodologías los mismos resultados y
además al ver que en el ELISA algunos pacientes con AR negativo para ACPA también
tenían proteínas citrulinadas circulantes, se confirmó que la herramienta presenta una alta
sensibilidad y especificidad, lo cual permitirá identificar correctamente la enfermedad en el
paciente e incluso en un menor margen de tiempo de lo que usualmente se considera.

5.- Discute sobre la generación de modelos in vivo y herramientas biológicas

para el estudio de respuestas inmunes contra antígenos endógenos

Dejar que la placa, la

1.Dejar estabilizar la
hCG muestra y los controles
bolsa sellada antes de
alcancen la temperatura
abrirla. Extraer la placa
ambiente.
y usarla lo antes posible
4. Esperar
3.Deposite 3 gotas de 2.Coloque la placa en
que aparezca
muestra en el pocillo de una superficie limpia y
una o dos
la placa (S) y activar el nivelada. Mantener el
líneas
cronómetro. Evitar cuentagotas en posición
coloreadas
formación de burbujas vertical

Los resultados deberán

leerse a los 3 min
cuando sea orina y a los
5 cuando la muestra sea
de suero.