Practica No. 5. Cuantificación de proteínas.

Nombres:
Seidy Patricia Agámez Bedoya patyagamez1991@gmail.com
Ximena forero Ximenaforero14@gmail.com
Gladys Sierra Gaitán glacosi@hotmail.com
Silvia Deisy Chilito Pérez s.deisy83@hotmail.com

Objetivos
- Relacionar las propiedades estructurales de las proteínas, a través de medidas
experimentales físicas y químicas.
- Conocer métodos de cuantificación de proteínas y aplicar los conceptos de
curva de calibración.

Fundamentación teórica
Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos
métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en
el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las
proteínas de formar complejos.
Entre los métodos que se basan en la formación de complejos colorimétricos entre las
proteínas y reactivos específicos se encuentran: Bradford, Lowry y Biuret.
Método de Bradford
Está basado en el cambio de color del colorante azul brillante de Coomassie en
respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona
con aminoácidos básicos (especialmente arginina) y aromáticos. Esta unión del
colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del
colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del
Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores
diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une
a la proteína. Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y
465 nm.
Método de Lowry:
Este método consta de dos etapas: 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a
las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces
peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además,
provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína,
exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda
etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su
complejo con tartrato. 2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-
Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la
mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal
constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de
color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de
color azul intenso.
Método de Biuret:
Es un método más rápido y menos engorroso que el de Lowry. La reacción debe su
nombre al Biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-
CONH2), que es la más sencilla que da positiva la reacción. Bajo condiciones
alcalinas, sustancias conteniendo dos o más uniones peptídicas forman un complejo
púrpura con sales de cobre, al igual que en la primera etapa del método de Lowry.
Preguntas:

1. Explique la ley de Beer-Lambert

R/. La ley de BOUGUER-LAMBERT-BEER también se conoce como ley de Beer-

Lambert-Bouguer. Esta ley trata de un medio o método matemático, el cual es utilizado
para expresar de que modo la materia absorbe la luz. En óptica (Rama de la física que
se encarga del estudio de la luz) La ley de Beer afirma que la totalidad de luz que
emana de una muestra puede disminuir debido a tres fenómenos de la física, que
serían los siguientes:
1. El número de materiales de absorción en su trayectoria, lo cual se denomina
concentración
2. Las distancias que la luz debe atravesar a través de la muestra. Denominamos a
este fenómeno, distancia del trayecto óptico
3. Las probabilidades que hay de que el fotón de esa amplitud particular de onda
pueda absorberse por el material.
Esto es la absorbencia o también coeficiente de extinción. La relación anterior puede
ser expresada de la siguiente manera:

Donde,
A = Absorbencia
e = Coeficiente molar de extinción
d = Recorrido (en cm)
c = Concentración molar
A medida que la luz atraviesa un medio que la absorbe, la cantidad de luz absorbida
en cualquier volumen corresponde a la intensidad de luz que incide, luego se multiplica
por el coeficiente de la absorción. Frecuentemente la intensidad de un haz de luz
incidente declina significativamente a medida que pasa a través del medio absorbente.
Cuando esta relación se expresa como Ley de BOUGUERLAMBERT-BEER, tenemos
que:
 -ecd o T= -10
Donde,
T = Transmitancia
ε = Coeficiente molar de extinción
c = Concentración molar del absorbente
d = Recorrido en c

Resultados

Los tubos con la muestra 2 y 5 obtuvieron resultados erróneos, por encima de 1, por
ende, si se toman en cuenta estos resultados no se encontrarían dentro de la gráfica.

Tubo No. Solución * absorbancia Proteína (mg) Concentración

1 3 ml NaCl al 0.9%, 0 0 0
3 0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl 0,3475 -0,1 0,06
4 0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl 0,615 -0,1 0,13
6 1 ml BSA y 2 ml NaCl 0,9975 1,49 0,3

Grafica 1.
Análisis de resultados
Al realizar el análisis de los tubos con muestra 3,4 y 6 podemos encontrar que la
ecuación de la recta para la regresión fue y=0.3251x-0,324 y el coeficiente de
correlación, R2 = 0,9958, lo que indica que este valor es lo más cercano a 1,
pudiendo inferir que hay una relación lineal entre la absorbancia y la concentración
(variables).
El R2 calculado indica que el 99 % de la información está ajustada a la variable Y
(absorbancia), confirma además que el grado de relación entre las variables es alto
(Pateiro & González, 2006).

Tubo Solución * Absorbanc Proteína (mg) Concentración

No. ia caseína
7 0.25 ml caseína y 2.75 ml NaCl 0,229 -0,1 0,004366812
8 0.5 ml caseína y 2.5 ml NaCl 0,494 -0,1 0,002024291
9 0.25 ml sobrenadante y 2.75 ml NaCl 0,292 -0,1 0,003424658
10 0.5 ml sobrenadante y 2.5 ml NaCl 0,442 -0,95 0,002262443
11 0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl 1,46 x x
12 0.5 ml leche diluida y 2.5 ml NaCl 1,61 x x

Se descartan los tubos de ensayo 11 y 12 debido a que su absorbancia fue mayor a

1, esto fue debido a que está muy concentrado la solución y se nos salen del rango.
Conclusiones
Durante la práctica se pudo identificar y cuantificar la proteína utilizando el método
de Bradford que se caracteriza por dar un color azul, ser sensible, simple, rápida y
económica para cuantificar proteínas.
Referencias bibliográficas
Herrera, A. (2014). Ley de Bouguer Lambert Beer. Consultado el 15 de noviembre
de 2019. Disponible en https://www.uv.mx/personal/aherrera/files/2014/05/L.-Ley-de-
Bouguer-Lambert-Beer-0.pdf