Aislamiento e identificación de Listeria

monocytogenes

A. Características generales de Listeria monocytogenes.

Listeria monocytogenes es un germen de forma bacilar, no esporulado, móvil gracias a que tiene flajelos
peritricos, Gram positivo, anaerobio facultativo, catalasa positivo y que crece bien a temperatura de
refrigeración. Es un bacilo corto y con extremos redondeados, a veces adopta forma de cocobacilo. Se presenta
aislado, en parejas, cadenas cortas o agrupados en V.

Listeria monocytogenes es un patógeno que se encuentra ampliamente distribuido en el medio ambiente, en

plantas, suelo, animales, agua.

Debido a esto, su presencia en los alimentos es inevitable, y puede ser continuamente introducida en el entorno
de procesamiento. El patógeno puede provenir por contaminación cruzada en superficies en contacto con
alimentos, equipos, suelos, drenajes, agua estancada y los trabajadores.

Además, el patógeno puede crecer en ambientes húmedos y se puede establecer un nicho y biopelículas en el
entorno de procesamiento que son difíciles de eliminar durante la limpieza y desinfección.

Otras características de L. monocytogenes que hace que sea un patógeno, cuyo control es dificil, son su
tolerancia al calor ya la sal y su capacidad de crecer a temperaturas de refrigeración y sobrevivir a temperaturas
de congelación.

B. Material

o Stomacher 400 y bolsas de stomacher.

o Pipetas estériles de 10 mL, 1 mL y 0,1 mL.
o Gradillas. Tubos de ensayo de 16 x 160 mm.
o Asa de cultivo.
o Placas de Petri de 90 mm.
o Estufa de cultivo.

C. Medios de cultivo y reactivos

  Caldo FRASER
 Agar nutritivo
 Solución salina
 Placas ALOA
 Listeria monoconfirm test

D. Fases del aislamiento e identificación de Listeria monocytogenes.

1. Enriquecimiento en medio líquido.

2. Aislamiento diferencial sobre medio sólido selectivo (ALOA).
3. Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas, mediante el test Listeria monocofirm .

E. Fase 1.-Preparación de la muestra y Enriquecimiento en medio líquido (Ver vídeo de Preparación de

la muestra y Enriquecimiento)

En condiciones asépticas, se pesan 25 gramos del

alimento que queremos analizar en una bolsa de
Stomacher.

Se añaden 225 mL de Caldo Fraser a concentración 1/2 .

Se homogeniza la mezcla en el Stomacher durante 1 a 4

minutos (el tiempo varía segun el tipo de alimento)
(defectivamente realizarlo por trituración en un vaso
esterilizado de una trituradora de cuchillas -tipo batidora-
a  una velocidad aproximada de 14.000 rpm y en un
tiempo medio de 60-90 segundos).

Incubar a 30ºC, durante 24 horas.

F. Fase 2.-Aislamiento diferencial en medio sólido selectivo, AGAR ALOA.

En esta etapa se utilizan placas ALOA este medio de cultivo es un medio selectivo utilizado para la diferenciación,
aislamiento y enumeración de Listeria monocytogenes en muestras patológicas, leche, queso y otros alimentos o
muestras ambientales sin considerar la contaminación de fondo.

Por su composición permiten que las colonias de Listeria monocytogenes crezcan con un aspecto característico
(colonias típicas).

A partir del cultivo obtenido en la fase de

enriquecimiento selectivo, sembrar por agotamiento en
estría, por duplicado, con asa de cultivo sobre:

Agar ALOA

Principio

- Las peptonas y factores de crecimiento (extracto de levadura,

piruvato sódico y sulfato magnésico) favorecen un crecimiento
excelente de Listeria monocytogenes.
- El extracto de levadura es también una buena fuente del
complejo vitamínico B.
- El cloruro sódico mantiene el equilibrio osmótico del medio.
- Listeria hidroliza el X-glucósido. El producto resultante sufre
una dimerización oxidativa que forma un precipitado azul en el
centro de las colonias.
- El Fosfatidil-inositol se utiliza como sustrato para la
detección de la fosfolipasa C de Listeria monocytogenes.
Cuando se degrada, se forma un precipitado opaco alrededor
de las colonias.
- La microflora secundaria, incluyendo Listeria ivanovii, se
inhibe por la asociación del cloruro de litio y una mezcla de
agentes selectivos.

Resultados

Las colonias azul verdoso pero sin halo, son propias de

las especies del género Listeria porque poseen la enzima
b-glucosidasa.

Las colonias de azul a azul verdoso rodeadas de un halo

opaco, son características de Listeria monocytogenes que
posee ambas enzimas: b-glucosidasa y fosfolipasa C.

Resiembra de colonias sospechosas

Las colonias típicas aisladas se transfieren a agar nutritivo para su confirmación. Incubar a 31 ± 1 ºC durante 24
horas.

Placas de ALOA con crecimiento típico de Listeria monocytogenes.

Ejemplo 1 Ejemplo 2

COLINIAS NO TIPICAS NINGUN CRECIMIENTO DE COLONIA

Ejemplo 3 Ejemplo 4

COLONIAS DE LISTERIA TIPICAS

COLONIAS DE LISTERIA TIPICAS

G. Fase 3.-Identificación Bioquímica mediante Listeria monoconfirm test ( Ver vídeo del test de
confirmación )
Esta identificación se basa en 4 pruebas bioquímicas para
la identificación de Listeria spp. y la diferenciación entre
Listeria monocytogenes de otras especies de Listeria.

Los sustratos de las reacciones están desecados dentro de

unos micropocillos:

A, E: Producción de Ácido de arabitol

B, F: Producción de Ácido de a-metil-D-glucósido
C, G: b-glucosidasa
D, H: D-aminopeptidasa

METODOLOGÍA
Aislar, resembrando en agar no selectivo tipo agar nutritivo, al menos, dos colonias con aspecto típico de Listeria
monocytogenes.

A partir de los cultivos en agar nutritivo, procedentes de

las colonias 1 y 2, obtener una suspensión bacteriana
equivalente a una turbidez de McFarland Nº2 en solución
salina.

A partir de la suspensión bacteriana de la colonia#1 se

inoculan los pocillos A-D y a partir de la suspensión
bacteriana de la colonia#2 se inoculan los pocillos E-H.
Para ello, echar 3 gotas de suspensión bacteriana en cada
pocillo.

Incubar a 37ºC, durante 24 horas.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Las tres primeras reacciones tienen resultados inmediatos
siendo positivas o negativas según el color.

Cuando las 3 primeras reacciones son positivas:

Género Listeria

Para leer la 4ª prueba hay que añadir 1 gota de

dimetilaminobenzaldehido al 5%.

Cuando esta prueba es negativa:

Listeria monocytogenes

REACCIONES POSITIVAS DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS:

Test Reacción Positiva Reacción Negativa
Producción de Ácido de arabitol Crema / Amarillo pálido Azul / Azul verdoso
Producción de Ácido de a-metil-D-
Crema / Amarillo pálido Azul / Azul verdoso
glucósido
b-glucosidasa Azul / Azul claro Sin color
D-aminopeptidasa Amarillo Azul verdoso / Sin color
Lectura de resultados del test monoconfirm (confirmación bioquímica) pata práctica
Listeria monoconfirm test Contestación
Colonias
Preguntas
3. Esta colonia se confirma como:

Colonia 1 a) Listeria spp

b) Listeria monocytogenes
c) No pertenece al género Listeria

4. Esta colonia se confirma como:

Colonia 2 a) Listeria spp

b) Listeria monocytogenes
c) No pertenece al género Listeria

5. Esta colonia se confirma como:

Colonia 3 a) Listeria spp

b) Listeria monocytogenes
c) No pertenece al género Listeria
 6. Esta colonia se confirma como:

Colonia 4 a) Listeria spp

b) Listeria monocytogenes
c) No pertenece al género Listeria

H. Expresión de los resultados

Criterios
Si la confirmación bioquímica ha resultado positiva para alguna de las cepas:

Expresar los resultados como: Presencia de Listeria monocytogenes en 25 g de muestra

En casi contrario, expresar los resultados como: Ausencia de Listeria monocytogenes en 25 g de muestra

I. Resumen

25 gramos de alimento + 225 mL de Caldo

Fraser 1/2
1º Enriquecimiento en medio líquido.
Incubar 30ºC/ 24 horas
- Placas ALOA
2º Aislamiento diferencial sobre medio sólido selectivo
(ALOA).
Seleccionar colonias típicas
-Producción de Ácido de arabitol
3º Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas, - Producción de Ácido de a-metil-D-glucósido
mediante Listeria monocofirm test. - b-glucosidasa
- D-aminopeptidasa
Expresar los resultados como:

Presencia de Listeria monocytogenes en 25

4º Expresión de los resultados gramos de alimento

Ausencia de Listeria monocytogenes en 25

gramos de alimento