Tecnología de nanopartículas lipídicas para la traducción clínica de la terapia siRNA

La administración de terapias basadas en ácido nucleico a las células es un enfoque

atractivo para atacar la causa genética de varias enfermedades. A diferencia de los
fármacos convencionales de moléculas pequeñas que se dirigen a productos génicos (es
decir, proteínas), los fármacos genéticos inducen efectos terapéuticos al modular la
expresión génica. El silenciamiento de genes, el proceso por el cual la producción de
proteínas se previene mediante la neutralización de su plantilla de mRNA, es una estrategia
potente para inducir efectos terapéuticos de una manera altamente precisa. Es importante
destacar que el silenciamiento de genes tiene un amplio potencial ya que teóricamente
cualquier gen causante de enfermedades puede ser objetivo. Se demostró hace dos
décadas que la introducción de pequeños ARN sintéticos de interferencia (siRNAs) en el
citoplasma resulta en la degradación específica de Arnm complementario a través de un
proceso llamado interferencia de ARN (Rnai). Desde entonces, se han realizado
importantes esfuerzos e inversiones para explotar el Rnai terapéuticamente y llevar los
medicamentos siRNA a la clínica. Sin embargo, la utilización de siRNA (no modificado)
como terapia es difícil debido a su limitada biodisponibilidad tras la administración sistémica.
La actividad de la nucleasa y la filtración renal resultan en el rápido aclaramiento de siRNA
de la circulación y su administración induce (innata) respuestas inmunes. Además, las
características fisicoquímicas desfavorables de siRNA impiden en gran medida su difusión a
través de las membranas celulares, lo que impide su capacidad de alcanzar el citoplasma
donde puede enganchar la maquinaria de Rnai. Por lo tanto, la traducción clínica de la
terapia siRNA ha dependido de modificaciones químicas y el desarrollo de plataformas de
entrega sofisticadas para mejorar su estabilidad, limitar la activación inmune, facilitar la
internalización y aumentar la afinidad objetivo.

Estos acontecimientos han dado lugar a la aprobación del año pasado de la primera terapia
siRNA, llamado Onpattro (patisiran), para el tratamiento de amiloidosis hereditaria
transtiránica (TTR) amiloidosis. Esta enfermedad se caracteriza por una mutación en el gen
que codifica TTR, una proteína sérica que transporta retinol en la circulación después de la
secreción por el hígado. La mutación conduce a la producción de proteínas mal plegadas
que se depositan como fibrillas amiloides en múltiples órganos, resultando en
neurodegeneración progresiva. El efecto terapéutico de Patisiran se basa en el
silenciamiento del gen TTR mediado por siRNA, previniendo la producción de proteína
mutante y deteniendo o incluso revirtiendo el avance de la enfermedad. Para una eficaz
administración terapéutica de siRNA a los hepatocitos, el patisiran es críticamente
dependiente de la tecnología de nanopartículas lipídicas (LNP).
En esta Cuenta, ofrecemos una visión general de los avances clave que han sido cruciales
para el desarrollo de la tecnología de entrega de la PNL, y explicamos cómo estos avances
han contribuido a la traducción clínica de la terapia siRNA para la administración parenteral.
Discutimos la optimización de la formulación de LNP, centrándonos particularmente en el
diseño racional de lípidos catiónicos ionizables y lípidos de poli(etilenglicol). Estos
componentes han demostrado ser instrumentales para una encapsulación de siRNA
altamente eficiente, parámetros farmacocinéticos favorables de LNP e internalización de
hepatocitos. Además, prestamos atención al desarrollo de métodos basados en mezclas
rápidas que proporcionan procedimientos de producción de PNL robustos y escalables. Por
último, destacamos la traducción clínica del paciente y el potencial de la tecnología de
entrega de LNP para permitir el desarrollo de fármacos genéticos más allá del estado actual
de la técnica, como el Arnm y la terapia de edición genética.

INTRODUCCIÓN
La introducción de ácidos nucleicos exógenos en las células para modular la expresión
génica, como el silenciamiento de genes, es un enfoque atractivo para lograr efectos
terapéuticos altamente específicos y potentes. Tras el descubrimiento de la interferencia del
ARN (Rnai)1 y la demostración subsiguiente de que el ARN de interferencia pequeña
(siRNA)2 puede inducir transitoriamente ARN mensajero específico (mRNA) En las últimas
dos décadas se han realizado enormes esfuerzos para explotar terapéuticamente el
silenciamiento genético.

Estos esfuerzos han resultado en la aprobación del año pasado del primer medicamento de
siRNA, llamado Onpattro (patisiran), para el tratamiento de amiloidosis hereditaria
transtiránica (Attrv) amiloidosis. Esta enfermedad se caracteriza por la producción
hepatocítica de proteínas TTR mutantes, que se depositan como fibrillas amiloides en
múltiples órganos resultando en neurodegeneración progresiva.3 Patisiran es críticamente
dependiente de la nanopartícula lipídica (LNP) tecnología para administrar siRNA dirigida a
hepatocitos en el hígado e inhibir la producción de proteínas tras la perfusión sistémica. Los
Lnps protegen el siRNA de la degradación y aseguran su estabilidad en la circulación,
reducen la activación inmune, permiten la localización del tejido diana y facilitan la entrega
intracelular. Los sistemas de administración de LNP son típicamente de unos 50 nm de
diámetro y están compuestos por lípidos catiónicos ionizables, colesterol, fosfolípidos y
lípidos de poli(etilenglicol) (PEG) (Figura 1). Todos estos componentes han sido
optimizados para entregar eficientemente el siRNA en el citoplasma de los hepatocitos,
donde puede enganchar la maquinaria de Rnai y posteriormente inhibir la traducción
específica de Arnm.

En esta Cuenta, proporcionamos una visión general de los factores que han sido cruciales
para el desarrollo exitoso de la tecnología de la PNL y su aplicación clínica que resultó en la
aprobación de la primera terapia siRNA. Estos incluyen el diseño racional de los lípidos
catiónicos ionizables 4,5 y la comprensión de su relación de función estructural, la
aplicación de lípidos PEG difusibles, y el desarrollo de un proceso de fabricación auto-
ensamblado robusto y escalable.6,7 También discutimos nuestra comprensión actual del
proceso de formación de la PNL de autoensamblado y proporcionamos ejemplos de
estrategias de realización de funciones. Por último, destacamos las características
importantes del éxito clínico del paciente y el potencial para explotar la tecnología LNP para
el desarrollo de mRNA o terapias de edición genética. Cabe destacar que para otros
desarrollos importantes, tales como modificaciones químicas del ARN, y enfoques
alternativos de silenciamiento de genes, incluyendo conjugados de Galnac siRNA y
oligonucleótidos anti- sentido (ASO), el lector se refiere a varios excelentes artículos de
revisión reciente.

COMPOSICIÓN DE NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS

Los sistemas de LNP han evolucionado sustancialmente en los últimos 25 años a partir de
formulaciones iniciales compuestas principalmente de fosfolípidos y colesterol. Basándose
en los parámetros de diseño establecidos por la Policía Nacional de Liberia mientras se
desarrollan sistemas portadores basados en lípidos para la terapia con moléculas
pequeñas, la administración de ácido nucleico requiere funcionalidades adicionales. Estos
incluyen componentes para atrapar ácidos nucleicos eficientemente, mantener una carga
superficial neutra en circulación, y evadir el aclaramiento inmune para una entrega exitosa
in vivo. La síntesis de lípidos catiónicos ionizables, modificaciones en la composición lipídica
y el desarrollo de lípidos PEG difusibles se discuten en esta sección.

Desarrollo de lípidos catiónicos ionizables y composición de nanopartículas lípidos

Los lípidos catiónicos ionizables juegan varios papeles importantes en la entrega de Arns
basados en LNP. En primer lugar, en condiciones ácidas, el lípido se carga positivamente,
como se requiere para atrapar los polímeros de ácido nucleico cargados negativamente
dentro de la nanopartícula. En segundo lugar, el lípido tiene que producir Lnps con una
aparente constante de disociación ácida (pKa) de tal manera que a los valores fisiológicos
de pH la carga superficial total de LNP es casi neutral. En tercer lugar, el lípido debe
mostrar una carga positiva en un endosoma acidificado (pH 5 6) con el fin de interactuar con
los lípidos aniónicos endógenos. Finalmente, para desestabilizar eficientemente la
membrana endosomal y entregar la carga útil de ácido nucleico, el lípido debe exhibir una
forma física que promueve la formación de la fase lipídica hexagonal (HII).10 Como tal, El
diseño lipídico racional se combinó con un proceso iterativo de cribado para determinar la
combinación óptima de cadenas de acilo, enlazadores y grupos de cabezales ionizables

Un estudio inicial que comparaba análogos de 1,2-dioleyloxy-N,N-dimetil-3-aminopropano

(DODMA) con diversos grados de insaturación en las cadenas acil determinó que las
cadenas linoleyl (C18:2) ofrecían una combinación óptima de captación de partículas,
entrega intracelular y pKa aparente. 11 Las cadenas linoleyl fueron hipotetizadas para
producir un lípido con una geometría cónica invertida con una mayor propensión a adoptar
fases no bilaterales como la fase HII. Los primeros Lnps que resultaron en un silenciamiento
significativo del gen hepatocitario in vivo contenían 1,2- dilinoleyl-N, N-dimetil-3-
aminopropano (Dlindma, Figura 2A),12 pero las formulaciones mostraron una potencia
relativamente baja que requería altas dosis de siRNA.

Se empleó un modelo del factor murino VII (FVII) 13 para seleccionar y cribar lípidos
ionizables progresivamente más potentes con un enfoque en la química de cabecera y
región del enlazador. FVII es una proteína de coagulación de la sangre producida por
hepatocitos y secretada en la circulación (como ocurre con TTR) con una semivida de 5 6
h.14 Por lo tanto, La potencia de las formulaciones LNP siRNA podría determinarse
midiendo los niveles de FVII en suero 24 h después de la administración sistémica con
formulaciones optimizadas que requieren dosis más bajas de siRNA para lograr un
silenciamiento génico del 50% (ED50). En un esfuerzo por variar la región del enlazador
para exhibir estabilidad química y enzimática diferencial, un lípido basado en enlaces
ésteres (1,2- dilinoleoil-3-dimetilaminonopropano; Dlindap) fue de tamaño sintético que
mostró una potencia de silenciamiento génico aún menor. Más tarde se sugirió que la
digestión de lipasa endógena de Dlindap resultó en transfección-incompetente Lnps.15 La
introducción de un anillo cetal en la región enlazadora del lípido para formar 2,2- dilinoleyl-4-
(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (KC2, figura 2A) mejora la estabilidad lipídica y la
potencia silenciadora de genes (ED50 de 0,02 mg/kg). Esto indicó que los lípidos catiónicos
ionizables con valores de pKa en el rango de 6,2 6,7 resultaron en el silenciamiento óptimo
del gen.4

El posterior cribado de un gran número de lípidos catiónicos ionizables con variados grupos
de cabeza y estructura de enlaces resultó en formulaciones de LNP que mejoraron la
potencia silenciadora del gen FVII en casi 4 órdenes de magnitud en comparación con
Dlindap (Figura 2B). Un avance clave fue la identificación de heptatriaconta- 6,9,28,31-
tetraen-19-il-4-(dimetilamino) butanoato (MC3, Figura 2A). MC3 permitió un silenciamiento
de genes hepáticos extremadamente potente con un ED50 tan bajo como 0,005 mg de Arns
por kilogramo de peso corporal para ratones y menos de 0,03 mg/kg para primates no
humanos.5
Además de la estructura lipídica catiónica ionizable, la composición general de la PNL
también evolucionó. Las generaciones anteriores de LNP se componían de lípidos
catiónicos ionizables, fosfolípidos, colesterol y lípidos PEG en una proporción de
20/25/45/10 mol %, respectivamente.16 (especialmente para blancos de hepatocitos). Las
modificaciones de las formulaciones dieron lugar a partículas con la composición molar de
40/10/40/10 mol %, lo que mejoró la acumulación hepática y la actividad silenciadora
génica.4 Otros ajustes de la composición a 50/10/38.5/1.5 mol % resultaron en un 6-mejora
de la reducción de la sensibilidad del gen hepatocitario,5

PEG-lípidos difusibles: Hepatocitos Endógenos Orientación y Reacciones Inmunes

Otro componente clave que determina la capacidad de transfección de los sistemas siRNA
de LNP es el lípido PEG. La optimización del PEG-lípido se ha beneficiado de trabajos
anteriores en sistemas de LNP para la entrega de plásmido y oligonucleótido antisentido. El
papel de estos lípidos en las formulaciones de LNP se encontró que es 2 veces. En primer
lugar, el contenido de lípidos PEG dictaminó el tamaño de las partículas, donde un mayor
contenido de PEG- disminuyó el tamaño de las partículas.6 En segundo lugar, PEG-lípido
fue necesario para prevenir la agregación durante la formación de partículas y en medio
biológico complejo. Sin embargo, a efectos de la transfección, los lípidos de PEG fueron
contraproducentes, inhiben la absorción en las células diana y previenen la
desestabilización endosométrica.19Estos lípidos se disociaron rápidamente de la LNP en
presencia de un reservorio de lípidos (como las lipoproteínas séricas), generando Lnps
competentes en transfección.20 Por lo tanto, el uso de PEG-difusiblelípidos dieron lugar a
sistemas de LNP que eran estables en almacenamiento y mantuvieron su capacidad de
transfección después de la administración.

En estudios preclínicos, se determinó que los LNP que contienen lípidos difusibles de PEG
se acumulan rápidamente en el hígado, con semividas de circulación de menos de 15
minutos (Tabla 1). 20 La acumulación de hepatocitos de LNP y la potencia de transfección
se derivan de la apolipoproteína E (Apoe) adsorción a la superficie de partículas’ , lo que
resulta en la absorción por Apoe-dependiente receptores de lipoproteína de baja densidad
(LDLR) en la superficie sinusoidal de hepatocitos. Esto es apoyado por la observación de
que la actividad del siRNA de la LNP fue comprometida en un modelo de knockout de Apoe
(Apoe / ), pero podría ser rescatado con la suplementación de Apoe antes de la
administración.21

Otro beneficio del componente difusible PEG-lípido es la abrogación de anticuerpos

inducidos por PEG que pueden afectar el comportamiento de aclaramiento. Se ha
observado un aclaramiento sanguíneo acelerado de nanopartículas pegiladas tras repetidas
administraciones. Esto resulta de una respuesta de anticuerpos frente al material pegilado
después de la primera dosis.22 Debe tenerse en cuenta que patisiran fue bien tolerado con
farmacocinética reproducible tras administración repetida en un entorno clínico.23 Por lo
tanto, Los lípidos difusibles de PEG desempeñaron un papel importante en la determinación
del éxito preclínico y clínico del siRNA de la LNP.

PEG-lípidos persistentes y objetivos extrahepáticos

Mientras que la tecnología de LNP ha sido optimizada para el silenciamiento de genes

hepáticos mediado por siRNA, la capacidad de derribar genes diana en tejidos
extrahepáticos se ha perseguido mediante la modulación del componente lipídico de la
formulación PEG. Por ejemplo, un estudio preliminar demostró el silenciamiento de SOST
en hueso compacto.24 A una dosis de 15 mg/kg (3000 veces mayor que para los
hepatocitos; acercándose a la dosis máxima tolerada) con LNP que contiene PEG-C14, sólo
se alcanzó una caída modesta. Tras la administración intravenosa, las formulaciones
clínicas de siRNA de la LNP están muy arraigadas en la vía de la LDLR de Apoe. Como tal,
la modificación de la biodistribución de la LNP a objetivos extrahepáticos requirió cambios
en su tamaño y composición.

Así pues, el objetivo era aumentar el tiempo de circulación y la acumulación en los tejidos
diana sin pérdida de eficacia. Un acontecimiento clave fue la incorporación de lípidos
persistentes de PEG (compuestos de cadenas de acilo C18 en lugar de C14) a
proporciones molares más altas que las utilizadas anteriormente, aunque se consideró que
se trataba de una espada de doble filo. No obstante, el mero hecho de sustituir 1,5 mol %
de PEG-C14 por PEG-C18 no alteró suficientemente el silenciamiento del gen hepático o
las propiedades farmacocinéticas de los Lnps. 20 Sin embargo, el aumento del contenido de
PEG-C18 a 2,5 o 5 mol % resultó en tiempos de circulación drásticamente mejorados, hasta
10 12 h (Tabla 1). Si bien este enfoque mejoró la circulación de la LNP, la funcionalidad de
las partículas se vio comprometida con una caída de 10 veces en la potencia (ED50 de 0,8
mg/kg). 20,25 El rescate parcial del rendimiento de dichas partículas requirió un aumento de
la cantidad de lípidos ionizables de 50 a 60 mol % y un aumento de la relación amina-
fosfato de 3 a 6. Esto permitió una mejora 3 veces de la ED50 a 0,3 mg/ kg.20

Aunque la potencia de transfección de estos sistemas no ha alcanzado niveles que

justifiquen la traducción clínica, estudios preliminares han establecido su potencial en
modelos tumorales distales. Sistemas que contienen 2,5 5 mol % PEG-lipid se han utilizado
para derribar el receptor andrógeno en un modelo de xenograft cáncer de próstata con
reducción efectiva de los niveles séricos de antígeno prostático específico.26 Otro estudio
combinado LNP siRNA contra clusterin con oligonucleotides antisenticos contra el receptor
andrógeno para tratar una enzalutamidamodelo resistente de cáncer de próstata.27

PRODUCCIÓN, CARACTERIZACIÓN Y FUNCIONALIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS

LIPÍDICAS

Producción: Aparición de técnicas de mezcla rápida

Aplicación clínica de los sistemas LNP siRNA necesarios para los procesos de mulación
que permitían un control riguroso de la fabricación, altas eficiencias de atrapamiento,
síntesis de alto rendimiento y reproducibilidad.10 Como tal, los métodos de generación de
formulaciones de ácido nucleico de la LNP han experimentado mejoras significativas.
Comenzando con los métodos de volcado y mezcla en una tube28 de prueba o la técnica de
detergente-diálisis, varias iteraciones sugirieron tecnologías de mezcla rápida como
propensas a cumplir todos los criterios. Los procedimientos de mezcla rápida actualmente
utilizados han evolucionado (junto con la composición lipídica) para mejorar el atrapamiento
de ácidos nucleicos, limitar las tediosas etapas de fabricación y mejorar las propiedades
fisicoquímicas de la LNP manteniendo y mejorando la potencia de la LNP.

La primera iteración de formulaciones de LNP para encapsular el ácido nucleico se basó en

la diálisis con detergente. Esto resultó en 70% plásmido ADN atrapamiento, pero el uso de
detergentes limitada traducción. Otros desarrollos mostraron que podrían generarse
partículas similares utilizando una técnica de carga de etanol. Esto implicó mezclar
liposomas preformados con oligonucleótidos (a pH 4) en presencia de altas concentraciones
de etanol ( 40% en volumen).30 Partiendo de este conocimiento, y una técnica más antigua
introducida por Batzri y Korn31 que implicaba la formación de vesículas mediante la
introducción de lípidos disueltos en etanol en un medio acuoso, se desarrollaron procesos
de alto rendimiento. Estos procedimientos, generalmente denominados de mezcla rápida,
reúnen dos corrientes de fluido en las que uno contiene lípidos en una fase orgánica, y la
segunda corriente contiene el ácido nucleico en una fase acuosa. Al principio, se empleó un
aparato de unión en T.32 Posteriormente, los estudios sugirieron que también se pueden
utilizar tratamientos microfluídicos (también basados en la mezcla rápida) para generar LNP
compuesto de triglicerides7 y luego de siRNA.6,En todos los casos, la formación de LNP se
basa en la dilución de la fase orgánica en la fase acuosa.

El factor determinante del éxito de esas técnicas de mezcla era el control del entorno local
de mezcla. Mientras que los métodos de mezcla macroscópica resultaron en partículas
heterogéneas con amplias distribuciones de tamaño, los métodos de mezcla rápida
proporcionaron un enfoque de alto rendimiento y continuo para sintetizar nanopartículas
desde la escala de banco a volúmenes clínicos (mediante paralelización de mezcladores).
Estos avances tecnológicos culminaron con el primer informe de éxito de Rnai en primates
no humanos en 2006.

Characterization: Studies on LNP Morphology

Los estudios iniciales sobre la estructura de las formulaciones de la Policía Nacional de
Liberia revelaron que las partículas se observan como estructuras electrón-densas bajo
microscopía criogénica de transmisión electrónica (cryo-TEM) como en la Figura 1B.33Las
estructuras densas se atribuyeron a un montaje ascendente de las partículas (en
comparación con la fabricación tradicional descendente). 6 Una propuesta inicial sugería
que la eficiencia de mezcla que ofrecen estos métodos resulta en un aumento de la
polaridad del medio logrando un estado de sobresaturación de monómeros lipídicos.Tales
eventos conducen a la nucleación y a la formación de partículas homogéneneas en escalas
temporales que son mucho más rápidas que las requeridas para la agregación.6,33 La
partícula resultante fue hipotetizada para contener un núcleo nanoestructurado de
estructuras micelares invertidas que encierran el siRNA, y la propuesta se extendió más
tarde a mRNA, ADN plásmido y nanopartículas de oro (Gnps).

Estudios recientes han sugerido que mientras que el atrapamiento y la formación de

partículas ocurren inicialmente durante la mezcla de una fase lipídica orgánica con el ácido
nucleico en tampón acuoso, la estructura final de la LNP sólo se forma después de la
neutralización del pH.35,36 Más importante aún, un proceso de fusión está involucrado en
la formación de tales nanopartículas, y un componente (es decir, el PEG-lípido) dicta en
gran medida el tamaño final de las partículas. Este trabajo también sugiere que la estructura
de la LNP incluye un núcleo de aceite hidrofóbico que consiste principalmente de lípidos
ionizables neutrales rodeados por Arnsied complejo a lípidos en un arreglo bilayer. Además
de estas observaciones, dos estudios separados determinaron que la cantidad de colesterol
en una formulación típica de LNP es superior a la cantidad que es soluble dentro de la
membrana, resultando en cristales de colesterol

El mecanismo propuesto de formación de LNP y la estructura resultante se muestra en la

Figura 3. Este mecanismo de formación se ha extendido desde entonces a la formación de
partículas que contienen Arnm, ADN minicírculo, o ADN plásmido y a Gnps.36 Cabe señalar
que esta nueva propuesta es coherente con todos los datos empíricos generados
anteriormente, excepto los enfoques de modelado molecular (Figura 3).

Funcionalización: Modificaciones para proporcionar utilidad adicional

Dados sus sencillos procesos de fabricación y diseño, los sistemas LNP son particularmente
susceptibles a modificaciones para diversas aplicaciones. Aquí, ofrecemos una visión
general de las modificaciones establecidas de la Policía Nacional de Liberia para añadir
funcionalidades y aplicaciones de imagen o seguimiento. Nos centramos en el uso de
fluoróforos, radioetiquetas y diversas cargas útiles. Los LNP fluorescentes pueden
generarse utilizando lípidos conjugados con fluoróforos, incorporación de fluoróforos
(hidrofóbicos) o atrapamiento de una carga útil fluorescente (siRNA) (Figura 4A). Las
etiquetas fluorescentes ofrecen varias ventajas, como permitir métodos de imagen39
rutinarios y proporcionar perspectivas estructurales y mecánicas. Los marcadores
hidrofóbicos más utilizados son los derivados de la dialquilarbocianina (Dio, Dii, Did, Dir).
Estos trazadores cubren una amplia gama de longitudes de onda de excitación (484 750
nm) y emisión (501 780 nm). Un beneficio clave de estos colorantes es que se observa muy
poca disociación de la LNP (incluso en medios complejos) por lo que las herramientas de
seguimiento de gran alcance.26,39 Fosfolípidos conjugados fluoróforos (cianina, roddamina,
nitrobenzoxadiazol-a base) también se asocian fácilmente con Lnps aunque su estabilidad
dentro de las partículas ha sido menos bien caracterizada. Una alternativa es etiquetar el
siRNA con colorantes a base de cianina, fluoresceína o Alexa-Fluor para evaluar la eficacia
de la transfección o la entrega intracelular. El uso de Arnsifluorescentemente marcado siRA
ha sido esencial en la comprensión del procesamiento celular de ArnsiRA LNP.15 Estudios
anteriores sugieren que hasta 70 80% de ArnsiRA internalizado es exocitosis.41,42
Utilizando Förster transferencia de energía de resonancia, siRNAs marcados se utilizaron
para supervisar el desmontaje de LNP siRNA dentro de la célula también.

Los LNP también pueden incorporar radioetiquetas, que ofrecen ventajas significativas que
hacen que estas etiquetas sean irremplazables (Figura 4B). El radioetiquetado ofrece una
sensibilidad sin precedentes, permite una cuantificación robusta (independientemente del
entorno) y permite el seguimiento de cada componente de la PNL sin modificar
drásticamente la estructura o composición química. Dado el bajo volumen acuoso de LNP,
sólo se utilizan marcadores hidrofóbicos o anfipatos. Como la remodelación de lípidos o la
disociación se produce en el entorno biológico complejo, es importante verificar que el
trazador permanece asociado con el PNL durante el período de tiempo de interés. El
tritiated-cholesteryl hexadeciyl éter (3 H-CHE) se ha utilizado ampliamente, ya que cumple
dos requisitos esenciales: no es intercambiable y no biodegradable. En los sistemas de
LNP, 3 H-CHE no muestran disociación mientras que otros componentes radiomarcados
como MC3, DSPC y PEG-lípido se disocian a tasas variables.20 Un beneficio adicional es
que sólo cantidades trazas de 3 H-CHE (<0,2 mol %) son necesarios para estudiar los
parámetros farmacocinéticos de las Lnps y la biodistribución tras la administración
parenteral. Otras estrategias de marcado por radioisótopos que implican positrones o
emisores de γ, tales como 111In-, 99mTc-, o 68Ga- ligado dietiletriamina pentaacetato
(DTPA) fosfolípidos conjugados, 44 son útiles para la imagen de radionucleidos no
invasivos. Además, la carga útil de siRNA también puede ser radiomarcada. El método más
común es etiquetar el extremo del ARN 5 con 32P a través de una transferencia de fosfato
con 32P-ATP. Estructuralmente, el Arnm permanece inalterado. Otros métodos de
radiomarcaje siRNA requieren la conjugación de quelantes tales como 1,4,7,10-
tetraazaciclodeecana-1,4,7,10-ácido tetraacético (DOTA) o DTPA.

Por último, los LNP pueden atrapar una variedad de cargas útiles que van desde
compuestos hidrofóbicos hasta macromoléculas aniónicas (Figura 4C). Las pequeñas
moléculas hidrofóbicas pueden formularse convenientemente en LNP, similares a las
etiquetas fluorescentes antes mencionadas. Para los compuestos que no son
suficientemente hidrofóbicos, podría utilizarse una estrategia de profármaco modificado en
lípidos para mejorar la asociación de LNP.45 Además, la composición y fabricación de LNP
permiten la simple sustitución del siRNA por ácidos nucleicos más grandes (mRNA,34
minicircle DNA,36 y plásmido DNA34,46) o carga negativa GNP. ADN,36 y plásmido
DNA34,46) o carga negativa GNP. El atrapamiento de ácidos nucleicos alternativos ha
demostrado su utilidad preclínica en aplicaciones de reemplazo de proteínas, vacunas y
edición de genes. Las nanopartículas metálicas con propiedades ópticas y electrónicas
únicas permitían que la PNL se utilizara para la obtención de imágenes y aplicaciones
terapéuticas. El atrapamiento del PNB permitió la caracterización estructural y mecanicista
del LNP34,36 pero también mejoró la entrega intracelular del PNB para mejorar la
radioterapia
APLICACIÓN CLÍNICA DE LNP siRNA: ONPATTRO (PATISIRAN)

El año pasado, la FDA aprobó el paciente para el tratamiento de la amiloidosis hereditaria

de Attrv. Patisiran es el primer fármaco de siRNA aprobado y proporciona un tratamiento
para una enfermedad hereditaria por lo demás fatal que afecta a unos 50.000 pacientes en
todo el mundo. La TTR es una proteína sérica producida en el hígado que es responsable
del transporte del retinol en la circulación. La enfermedad se caracteriza por la deposición
de TTR mutado como fibrillas amiloides en múltiples órganos, particularmente el tejido
nervioso, dando lugar a la neurodegeneración progresiva. Patisiran, que detiene e invierte
esta neurodegeneración, proporciona la primera esperanza definitiva para los pacientes que
sufren de amiloidosis TTR hereditaria con polineuropatía.

Tras la optimización y evaluación preclínica de los sistemas de siRNA de LNP, se evaluaron

dos formulaciones en un ensayo de fase I controlado con placebo para el tratamiento de
amiloidosis de Attrv para determinar su seguridad y eficacia.17 Una dosis única de ALN-
TR01 a base de Dlindma (0,01 a 1 mg/kg) se administró por vía intravenosa a 32 (24:8)
pacientes con amiloidosis de Attrv, mientras que a 17 voluntarios sanos se les administró
ALN-TR02 (0,01 a 0,5 mg/kg) a base de MC3.

Los resultados mostraron que ALN-TTR01 a una dosis de 1 mg/kg fue capaz de suprimir
significativamente los niveles de TTR mediante una reducción media del 38% en
comparación con placebo después de 7 días. La formulación ALN-TTR02 fue más eficaz y a
dosis de 0,15 y 0,3 mg/kg de TTR suprimido >80% en comparación con placebo, con
reducciones >50% después de 28 días.

En un estudio de fase II, un total de 29 pacientes con amiloidosis de Attrv recibieron 2

perfusiones sistémicas de patisiran (ALN-TTR02) a una dosis de 0,01 0,3 mg/kg cada 4
semanas o 0,3 mg/kg cada 3 semanas (Q3W). Las múltiples administraciones de pacientes
fueron generalmente bien toleradas, siendo la mayoría de los acontecimientos adversos
relacionados con la perfusión. Se alcanzó un nivel medio de eliminación de TTR >85%
después de la segunda dosis para el protocolo Q3W

En el estudio APOLLO fase III aleatorizado, doble ciego y controlado con placebo, 148
pacientes recibieron patisiran a una dosis de 0,3 mg/kg Q3W y 77 pacientes recibieron
perfusiones de placebo. El punto final primario fue el cambio desde el valor basal en la
Puntuación de Deterioro de la Neuropatía+7 (mNIS+7), usada para cuantificar la
polineuropatía, después de 18 meses. Los resultados indicaron que en pacientes que
recibieron patisiran, la reducción mediana de los niveles de TTR séricos durante los 18
meses fue >80%. La reducción sostenida de los niveles de TTR resultó en un cambio del
valor basal en el mNIS+7 significativamente menor para el grupo de tratamiento de
pacientes comparado con el grupo de tratamiento de placebo, indicando un efecto
beneficioso con respecto a la polineuropatía y detener la progresión de la enfermedad.
Estos efectos se observaron después de 9 meses de tratamiento. Es importante destacar
que también se observaron diferencias favorables significativas en el tratamiento con
pacientes pacientes en comparación con placebo para todos los puntos finales secundarios,
como la calidad de vida (Norfolk Quality of Life Diabetic Neuropathy questionnaire),
velocidad de marcha, estado nutricional y síntomas autonómicos reportados por el paciente.
Ambos grupos de tratamiento notificaron acontecimientos adversos que fueron en su
mayoría de gravedad leve o moderada. La frecuencia de reacciones adversas graves y
graves en ambos grupos de tratamiento fue comparable.

Una consideración crítica durante la traducción clínica de patisiran fue el papel de las
reacciones relacionadas con la perfusión (Irss), que son bien conocidos para fármacos
macromoleculares como complejos micelares, anticuerpos monoclonales, y Lnps.48 Irss
son más comunes después de la primera dosis, con pacientes cada vez más tolerantes a
las dosis posteriores. Notablemente, no hay modelos preclínicos para predecir con precisión
los IRS en humanos. En la clínica, se usan regímenes específicos de pretratamiento que
involucran corticosteroides, antihistamínicos y acetaminofén para mitigar estas reacciones.

Además, los IRS se reducen significativamente simplemente retrasando la velocidad de

infusión. En el caso del paciente, los pacientes son premedicados antes de la perfusión con
dexametasona, acetaminofeno/paracetamol oral, un bloqueador H2 y un bloqueador H1.49
Los principales síntomas incluyen enrojecimiento, dolor de espalda, dolor abdominal y
náuseas, todos los cuales fueron descritos como leves a moderado en los ensayos con
pacientes, y la frecuencia de las reacciones disminuyó con el tiempo como se esperaba.
Aunque esto suele estar asociado con la administración de nanopartículas, ya se están
desarrollando estrategias para superar estos efectos secundarios. Chen et al. han
demostrado recientemente que una versión profármaco hidrofóbica de dexametasona
puede incorporarse fácilmente a los LNP que contienen ácidos nucleicos y proporcionar una
inmunosupresión eficaz.

CONCLUSIONES

El desarrollo de la tecnología de entrega de LNP ha demostrado ser instrumental para

traducir el primer Arn terapéutico a la clínica,3 20 años después del descubrimiento de
Rnai.1 Patisiran aprobación demuestra claramente que la tecnología de LNP se puede
aplicar para lograr Rnai-robustoefectos terapéuticos mediados para los trastornos causados
por la producción de proteínas patológicas en el hígado. Con los parámetros de diseño de
LNP, métodos de producción escalables, y la relación de función de la estructura ahora bien
establecida, se espera que se desarrollen terapias adicionales de siRNA de LNP para
silenciar genes causantes de enfermedades en hepatocitos, por ejemplo, eliminación de la
proproteína convertasa subtilisina/kexin tipo 9 para el tratamiento de la hipercolesterolemia.
Un reto considerable que queda por hacer es lograr niveles de silenciamiento genético
clínicamente relevantes en tejidos no hepáticos, lo que aumentaría significativamente el
rango de indicaciones que se pueden tratar con la terapia de siRNA.

Al mismo tiempo, se está explotando la tecnología de la Policía Nacional de Liberia para

desarrollar tratamientos que expresen proteínas terapéuticas o editen genes mediante la
entrega de mRNA o componentes del sistema CRISPR/Cas9, respectivamente.
Aprovechando la eficaz transfección de hepatocitos mediada por Apoe, el mRNA de LNP se
puede emplear para convertir el hígado en un biorreactor « para producir proteínas
terapéuticas. Por ejemplo, una sola administración intravenosa de la codificación de Arnm
de la LNP para la eritropoyetina (EPO) resultó en altos niveles séricos de EPO, aumento de
los niveles de reticulocitos y elevación del hematocrito en cerdos y primates no humanos.51
La entrega de Arnm mediada por la LNP está ganando particular tracción para el desarrollo
de la vacuna, dadas sus ventajas en comparación con las vacunas virales o basadas en el
ADN: es no infecciosa, no integradora, y sólo requiere la entrega citoplasmática. Como
ejemplo, Pardi et al. mostraron recientemente que una sola administración intravenosa de
LNP mRNA codificando un anticuerpo anti-HIV-1 ampliamente neutralizante resultó en
suficientes niveles de producción de anticuerpos para proteger a los ratones humanizados
del desafío del VIH.52 Alternativamente, La tecnología de la LNP se utiliza para la
inmunización mediante la administración de antígenos codificadores de Arnm a las células
inmunes tras la administración subcutánea, intramuscular o intradérmica.

Este enfoque ha mostrado un potencial considerable para desarrollar un virus de la gripe

ampliamente protector vaccine53 e indujo una protección completa contra el desafío del
virus Zika en ratones y primates no humanos.54 En particular, estrategias comparables
también se utilizan para desarrollar vacunas para la inmunoterapia del cáncer. Por ejemplo,
Oberli et al. mostraron efectos antitumorales potentes después de administrar por vía
subcutánea antígenos tumorales codificadores de Arnm de LNP en un modelo de ratón
melanoma. Demostrando el potencial para desarrollar vacunas personalizadas contra el
cáncer, Kreiter et al. mostraron en tres modelos tumorales murinos que las mutaciones no
sinónimo de cáncer son inmunogénicas y queLas vacunas de base inhibieron
significativamente el crecimiento tumoral o incluso indujeron el rechazo completo de los
tumores establecidos tras la administración intravenosa.

Debido a la capacidad de los PNL para soportar cargas útiles mayores que, por ejemplo, los
sistemas virales, la tecnología es la más adecuada para desarrollar terapias de edición
genética. Recientemente, Finn y sus colegas informaron del diseño de una formulación de la
Policía Nacional de Liberia para la coencapsulación de Cas9 mRNA y ARN guía única. Una
única inyección intravenosa de Lnps dirigida al gen TTR en ratones resultó en la edición del
70% del ADN hepatocitario y reducción >90% de los niveles de TTR séricos que
persistieron durante un año

Si bien la tecnología de la Policía Nacional de Liberia permite rápidamente silenciar,

expresar o editar genes en pacientes humanos, cabe señalar que en el futuro habrá que
abordar cuestiones importantes, como la relación costo-eficacia, los efectos fuera del
objetivo y la toxicidad. La experiencia adquirida con el desarrollo y uso del primer
medicamento siRNA de la LNP en la clínica proporciona información valiosa para mejorar la
tecnología para aplicaciones futuras.

Relacionado con esto, otros enfoques como los conjugados de Galnac siRNA o
oligonucleótidos antisenticos pueden resultar opciones alternativas atractivas para silenciar
genes terapéuticos.8,9 Está claro, sin embargo, que las características ventajosas de la
tecnología de LNP, como la posibilidad de encapsular varios (grandes) cargas útiles de
ácido nucleico, probablemente permitirá que una gama de medicamentos genéticos se
incorporen en los regímenes de tratamiento convencionales.