UNIVERSIDAD NACIONAL SAN CRISTOBAL

DE HUAMANGA
ESCUELA DE FORMACION PROFESIONAL DE MEDICINA
HUMANA

PRÁCTICA N° 3
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS (COLORACIÓN GRAM Y ZIEHL
NEELSEN)

ALUMNA: FUENTES CRUZ, Giuliana

DOCENTE: APAYCO ESPINOZA Nilda
SERIE: 300
GRUPO: lunes de 9am – 11am
AYACUCHO- PERÚ
2021
OBJETIVOS
- Conocer el principio de la coloración GRAM Y ZIEHL NEELSEN
- Diferenciar la importancia de la aplicación de colorantes como métodos
microbiológicos.
INTRODUCCIÓN
Los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alta afinidad especifica por
componentes celulares. Muchos de los colorantes utilizados corresponden a
moléculas cargadas positivamente (colorantes catiónicos) como azul de metileno,
cristal violeta o safranina, y se combinan con gran afinidad con constituyentes
celulares cargados negativamente, tales como ácidos nucleicos y polisacáridos.
También existen colorantes aniónicos (moléculas cargadas negativamente), como
la eosina, que se combinan con componentes celulares cargados positivamente
como proteínas. Un tercer grupo de colorantes está formado por compuestos que
se combinan con los materiales lipídicos de las células y son utilizados para
localizar depósitos de grasa; por ejemplo, el colorante negro de Sudan (López-
Jácome, et ál., 2014). Existen sustancias químicas denominadas mordientes, que
son capaces de combinarse con algún constituyente celular y alterarlo de tal forma
que sea más vulnerable a un colorante, de manera que algunos colorantes teñirán
mejor solo después de que la célula haya sido tratada con esta sustancia. Los
mordientes no son colorantes por sí mismos, y algunos ejemplos de estas
sustancias son el ácido fénico y el ácido tánico (Arias y Gómez, 2001). Mediante
las tinciones especiales se pueden determinar morfología, agrupación, flagelos,
endosporas, etc. Aun así, es preciso tener en cuenta que todos los métodos de
tinción deberán usarse con precaución ya que pueden conducir a errores debido a
que las moléculas de colorantes forman en ocasiones precipitados o agregados
que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones artificiales
inducidas por el propio colorante (Luna, 2020).
Tinción Simple: consiste en la aplicación de un solo colorante al extendido
previamente fijado, con la cual se aumenta el contraste de la célula para poder
observarlas claramente. Uno de los colorantes más indicados es el azul de
metileno, que actúa rápida y suavemente sobre todas las células bacterianas y no
oscurece los detalles celulares. Además, es especialmente útil para detectar la
presencia de bacterias en muestras naturales puesto que la mayor parte del
material no celular no se tiñe. (Gamazo et al., 2005)
Tinciones compuestas o diferenciales: son aquellos en la que se emplea más
de un tipo de colorante, por lo que todas las células de la muestra no quedan
teñidas iguales. Esto permite poner en evidencia, aparte de la morfología de los
microorganismos y su agrupación, algunas estructuras como endosporas, flagelos,
depósitos de grasa y la reacción de las bacterias frente a un colorante específico.
Ejemplo tinción diferencia de Gram, Writz y Ziehl-Neelsen.
La tinción Gram La propiedad de teñirse o no de violeta oscuro según la tinción
introducida por Christian Gram (1884) es una característica taxonómica importante
con la que se correlacionan también otras propiedades de las bacterias. Este
procedimiento se inicia con una tinción de las células bacterianas fijadas mediante
el colorante básico cristal violeta. A continuación, se trata con una solución de
yodo (lugol), el cual forma una laca con el cristal violeta, que es insoluble en agua
y solo medianamente soluble en alcohol o acetona. Las células se tratan después
con alcohol acetona, de modo que las células Gram positivas retienen el complejo
colorante-yodo y quedan azules, y las células Gram negativas son decoloradas
por el alcohol acetona. Estas últimas se hacen visibles mediante una coloración de
contraste con otro colorante como la fucsina o safranina (Schlegel, 1997).
MATERIALES
- Microscopio compuesto
- Mechero de Bunsen
- Cepas microbianas
- Azul de metileno
- Set del colorante Gram
- Láminas portaobjeto
- Asa de siembra
- Agua destilada
- Regilla para tinción
- Bandejas
- Aceite de inmersión
- Encendedor
- Papel secante
- Papel lente

PROCEDIMIENTO
1. Preparar un frotis de la cepa bacteriana en un portaobjetos limpios y
desengrasados emulsionando con ayuda del asa de siembra una colonia del
crecimiento bacteriano sobre una gota de agua destilada.
2. Dejar secar a temperatura ambiente.
3. Fijar la muestra a la llama del mechero.
4. Cubrir la muestra con el colorante cristal violeta y dejar actuar por 1 minuto
5. Lavar con agua corriente de grifo o con agua destilada.
6. Cubrir el preparado con lugol y dejar actuar por 1 minuto.
7. Lavar con agua de grifo a chorro moderado.
8. Decolorar con alcohol-cetona, hasta que ya no se desprenda más colorantes de
la muestra.
9. Lavar con agua corriente de grifo.
10. Cubrir la preparación con el colorante de contraste (safranina) y dejar actuar
por 30 segundos.
11. Lavar con agua corriente de grifo.
12. Secar la preparación al medio ambiente, o utilizando la llama moderada del
mechero.
13. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión, utilizando una gota de
aceite de inmersión.
COLORACIÓN DE BACTERIAS ALCOHOL-ÁCIDO RESISTENTE: AAR
(coloración de Ziehl Neelsen).
Con la tinción de Ziehl-Neelsen, tanto las bacterias ácido alcohol resistentes como
el no ácido alcohol resistentes se tiñen con el colorante primario. Sin embargo, al
aplicar el agente decolorante, compuesto por una mezcla de alcohol ácido, éste no
solubiliza los lípidos de la pared de las bacterias ácido alcohol resistentes, y por lo
tanto no se decoloran fácilmente, por lo que se vuelven a teñir al aplicar el
colorante de contraste. Este grupo de bacterias está representado principalmente
por el género Mycobacterium.
Algunas especies de este género juegan un papel importante como agentes
etiológicos de la tuberculosis y otras enfermedades crónicas granulomatosas tanto
en el hombre como en los animales (Murray-Nuñez et al., 2017).
PROCEDIMIENTO
1. Extender, con ayuda de un baja lenguas, una porción del esputo (muestra de un
paciente sintomático) en una lámina portaobjetos limpia y desengrasada, en lo
posible utilizar una lámina nueva sin rayaduras.
2. Fijar el extendido a la llama el mechero.
3. Cubrir la muestra con fucsina fenicada y calentar la lámina, en forma moderada,
a la llama del
mechero, durante cinco minutos hasta el desprendimiento de vapores, no permitir
que se seque el
colorante, para evitar la sequedad se puede añadir más colorante.
4. Eliminar el exceso de colorante y lavar con agua corriente de grifo.
5. Decolorar con alcohol ácido hasta que ya no se desprenda más colorante.
6. Lavar con agua corriente de grifo.
7. Cubrir con algunas gotas del colorante azul de metilo y dejar actuar por 1
minuto.
8. Lavar con agua corriente de grifo.
9. Secar al medio ambiente, a la llama del mechero o utilizando papel filtro.
10. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

RESULTADOS:
Caso clínico: Un bebé de 2 semanas estaba bien después de dejar el hospital
hace diez días hasta ayer por la noche. cuando empezó a estar adormilado y
colorado. Su piel estaba caliente al tacto. En un examen físico, al bebé le costaba
mucho levantarse. Pero no había otras manifestaciones. Su temperatura era de 40
°C. En un cultivo de sangre crecieron cocos gram positivos en cadenas. Se
observó una zona de hemólisis clara (beta) alrededor de las colonias. La prueba
del hidrólisis del hipurato fue positiva.
diagnóstico: Sepsis neonatal causada por Estreptococos agalactiae
(estreptococos del grupo B). Los estreptococos del grupo B son la causa más
común de sepsis neonatal. Si se observan bacilos gramnegativos, posiblemente
sea Escherichia coli, y si se observan bacilos grampositivos, puede tratarse de
Listeria monocytogenes.

DISCUSIÓN DE GRUPO 1
El estreptococo del grupo B (EGB) es una bacteria que puede ocasionar
enfermedades, particularmente en los recién nacidos. Es responsable de muchos
casos de meningitis, una inflamación de las membranas que rodean el cerebro y la
médula espinal, en bebés, así como casos de infecciones sanguíneas (asepsia) y
neumonía. (2)
CARACTERISTICAS producen cadenas cortas, Pares o diplococos de células
esféricas u ovoides, Gram positivas, Las colonias son mas grandes y la
betahemolisis es menos evidente, Producen capsulas de polisacaridos de nueve
tipos antigenicos, todos los cuales tienen acido sialico en la forma de residuos
terminales, De la cadena lateral.
S. agalactiae se caracteriza por ser anaerobio facultativo, crece bien en medios
enriquecidos con sangre a 36 o 37 ºC por 24 horas de incubación. Su crecimiento
se ve favorecido si son  incubados en una atmósfera con dióxido de carbono al 5-
7%.
En agar sangre inducen un halo de hemólisis completa alrededor de la colonia
(betahemólisis), gracias a la producción de hemolisinas, aunque la hemólisis
producida no es tan pronunciada como la de otros Streptococcus.
Por otra parte, S. agalactiae  es catalasa y oxidasa negativo. (3)

CONCLUCIONES:
La tinción de Gram permite realizar un tratamiento rápido a las infecciones por
bacterias pues se puede determinar en la brevedad que tipo de membrana recubre
la bacteria y que espécimen de bacteria es la que está generando alguna
afectación.
El conocimiento de la composición bioquímica de las diferentes estructuras
bacterianas, junto al conocimiento del metabolismo bacteriano, permite hoy la
comprensión del mecanismo de acción de los diferentes antibióticos.
estreptococcos, son bacterias cocos gram – positivos, que tienen una gran
importancia para la medicina veterinaria, ya que estas bacterias se consideran
patógenas y causan un gran número de enfermedades e infecciones en animales
domesticos. En ejemplo Streptococcus pyogenes es una bacteria importante en el
área de investigación, ya que se transmite fácilmente de animal a animal través
respiración directa o en las heridas de la piel por contacto con un animal infectado,
y esta bacteria es la causante de infecciones o enfermedades como la faringitis,
abscesos, septicemias y fiebre. Concluyo, que es necesario utilizar distintos
métodos experimentales, acerca de Streptococcus para identificar distintas
especies de géneros bacterianos ya que cada bacteria puede o no reaccionar
igual a una misma prueba.
CUESTIONARIO:
1. Coloración Gram
Principios de la técnica
Esta es una técnica que presenta 4
pasos fundamentales: tinción, fijación
con el mordiente, decoloración y contra
tinción. Por tanto, esta técnica además
de colorear a las bacterias, también
permite diferenciarlas.
El cristal violeta es el primer colorante
utilizado. El mismo tiene afinidad por el
peptidoglicano y teñirá de morado a
todas las bacterias presentes,
posteriormente se coloca el Lugol, que
actúa como mordiente, es decir,
inducirá a la formación de complejos
insolubles de cristal violeta-yodo –
proteínas ribo nucleares dentro de la
célula.
Las bacterias Gram positivas, al tener
una pared gruesa de peptidoglicano,
forman más complejos (cristal violeta-
yodo), por tanto, retienen el colorante.
Además, también influye que la pared
de las bacterias Gram positivas
contienen mayor cantidad de ácidos no
saturados, los cuales muestran gran
afinidad por los agentes oxidantes
(Lugol).
Mientras, las bacterias Gram negativas
poseen una capa delgada de
peptidoglicano, lo que hace que las
bacterias formen menos complejos que
las Gram positivas. Posteriormente
viene el paso de la decoloración,
donde las bacterias Gram positivas y
Gram negativas se comportan de
manera diferente. Es así como luego
es contra teñida con la safranina o
fucsina básica, tomando el color rojo.
(1)
Utilidad principal
Esta técnica permite distinguir las
diferencias morfotintoriales de la
mayoría de las bacterias.
Las levaduras también se distinguen
con esta coloración. Ellas toman el
cristal violeta, es decir, se tiñen de
Gram positivo.
Por otra parte, se pueden distinguir
bacilos Gram positivos formadores de
esporas, en el que se observa un
espacio claro dentro del bacilo, donde
se formó la endospora, aunque las
esporas no se tiñen bien. Para teñir
esporas se usa otras técnicas como
Shaeffer-Fulton.
Cabe destacar que esta tinción no
sirve para colorear todo tipo de
bacterias, es decir, existen casos en el
que la tinción no funciona.
En este caso se pueden mencionar las
bacterias que carecen de pared
celular. Por ejemplo: género
Mycoplasma, esferoplastos,
Ureaplasma, formas L y protoplastos.
Además, tiñe muy mal a las bacterias
con paredes ricas en ácidos micólicos,
como las Mycobacterias y a las
bacterias intracelulares como
Chlamydias y Rickettsias.
Igualmente es ineficaz para teñir a la
mayoría de las bacterias
espiroquetales.
 2. Coloración de Zielh Neelsen
Principios de la técnica Utilidad principal
El fundamento de esta técnica de
tinción se basa en las propiedades de Ayuda a la identificación de
la pared celular de estos microorganismos patógenos como,
microorganismos. La pared está por ejemplo: Mycobacterium
formada por un tipo de ácidos grasos tuberculosis que provoca la
llamados ácidos micólicos; estos se enfermedad de la tuberculosis.
caracterizan por presentar cadenas
muy largas.
Cuando los ácidos grasos presentan Algunos microorganismos ácido-
estructuras muy largas, estos pueden alcohol resistentes
retener los colorantes con mayor
facilidad. Algunos géneros de  Mycobacterium: fuertemente
bacterias son muy difíciles de teñir ácido-alcohol resistentes.
mediante tinción de Gram, debido al
alto contenido de ácidos micólicos de
la pared celular.  Nocardia y Actinomices:
En la tinción de Ziehl-Neelsen se débilmente ácido-alcohol
utiliza el compuesto fenólico carbol resistentes.
fucsina, un colorante básico. Este
tiene la capacidad de interactuar con  Parásitos coccídeos
los ácidos grasos de la pared celular, (Cryptosporidium) de
la cual es de textura cerosa a muestras fecales. (2)
temperatura ambiente.
La tinción con carbol fucsina es
mejorada en presencia de calor,
debido a que la cera se derrite y las
moléculas de colorante se mueven
con mayor rapidez hacia el interior de
la pared celular.
El ácido que se usa posteriormente
sirve para decolorar las células que
no fueron teñidas porque su pared no
era lo suficientemente afín al
colorante; por lo tanto, la fuerza del
decolorante ácido es capaz de
eliminar el colorante ácido. Las
células que resisten esta
decoloración se llaman ácido-
resistentes.
3) MENCIONE 5 DIFERENCIAS ENTRE LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y
GRAM NEGATIVAS. DURANTE LA COLORACIÓN O TINCIÓN DE GRAM.
SUSTENTE, MEDIANTE REFERENCIA(S) BIBLIOGRÁFICA(S)
EN UN CUADRO MENCIONA 5 ESPECIES O GÉNEROS DE BACTERIAS
GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS QUE CAUSAN ENFERMEDAD EN
HUMANOS. SUSTENTE, MEDIANTE REFERENCIA(S) BIBLIOGRÁFICA(S).

BACTERIAS GRAM POSITIVAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Estafilococo áureo Meningococo

Estreptococo Coli
Clostridium Veilonella
Neumococo Campylobacter
Mycobacterium Espiroquetas

¿CUÁLES SON LAS CAUSAS POR LAS QUE SE ALTERA LA TINCIÓN

GRAM? SUSTENTE, MEDIANTE REFERENCIA(S) BIBLIOGRÁFICA(S).

 Edad de la bacteria.
 Errores del operador.
 Uso de antibióticos

A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser valorado
con precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células
(cultivos viejos de bacterias gram positivas pueden perder capas de
peptidoglicanos y teñirse como gram negativos) y la técnica empleada (al
decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias
gram positivas se tiñan como gram negativas). Por esta situación, junto a la
muestra deben teñirse controles con bacterias gram positivas (por ejemplo
Staphylococcus aureus) y gram negativas (por ejemplo, Escherichia coli). (5)

¿QUÉ DIFERENCIA EXISTE ENTRE LAS DOS TÉCNICAS DE COLORACIÓN

UTILIZADAS? SUSTENTE LOS PRINCIPIO, MEDIANTE REFERENCIA(S)
BIBLIOGRÁFICA(S)

COLORACION GRAM COLORACION DE ZIELH NEELSEN

Tinción utilizada para separar las Esta tinción demuestra la capacidad
bacterias en Gram (+) y Gram (-). de ciertas bacterias de resistir a la
-Se fija la muestra en un portaobjetos decoloración por ácidos y alcoholes, lo
mediante calentamiento o tratamiento cual se correlaciona con su alto
con alcohol. contenido en lípidos en la pared
-Se expone a la muestra a violeta de celular y presencia de ácidos
cristal. -Se añade yodo para formar el micólicos que aumentan el carácter
complejo con el colorante principal. hidrófobo.
-en la decoloración con alcohol o -Una de las bacterias que presentan
acetona el complejo: esta característica es Mycobacterium
- Queda retenido en las bacterias tuberculosis Principal causante de la
Gram positivas y se pierde en las tuberculosis.
Gram negativas. -Los microrganismos -se utiliza para teñir micobacterias y
Gram (-) retienen la colorante otros microorganismos acido
safranina (color rojo).(6) resistentes. (7)
-el grado en el que un microrganismo -se tiñen con carbolfucsina básica.
conserva el colorante depende de: del -resisten a la descoloración con
microorganismo, de las condiciones soluciones de acido-alcohol.
del cultivo, habilidades tintoriales del -Se realiza contra tinción del fondo
microscopista. con azul de metileno.
-Los microorganismos aparecen de
 color rojo sobre un fondo azul claro.

Explique cómo se realiza la obtención de esputo, cuando se pide un cultivo

de Baciloscopía y que otras técnicas se puede realizar para la identificación
del bacilo de Koch. Sustente los principios
Principios generales:
 Una buena muestra es aquella que proviene del árbol bronquial. Y se
obtiene después de un esfuerzo de tos.
 La muestra suficiente es de 5 a 10 ml.
 La hora de obtención puede ser a cualquier hora del día, pero de
preferencia será el primer esputo de la mañana y antes del desayuno.
 El ambiente donde se obtiene el esputo debe tener buena ventilación y
debe prohibirse la presencia de otras personas. (8)
Expectoración espontánea:
1. Indicar al paciente que se ponga de pie
 2. Solicitar que haga un movimiento inspiratorio profundo, llenando de aire los
pulmones.
3. Indicar al paciente que vacíe los pulmones con una sola espiración,
tosiendo al mismo tiempo tan fuerte y profundamente como pueda.
4. Solicitar que escupa en el interior del recipiente rotulado.
5. Tapar el recipiente en una bolsa plástica y llevarla al laboratorio
inmediatamente.
Expectoración inducida:
Se realiza cuando el paciente no logra expectorar.
1. Acostar al paciente boca abajo sobre una camilla, haciendo que su cabeza
rebase el borde de la camilla.
2. Colocar una almohada doblada debajo del tórax para lograr un plano
inclinado, de modo que la base del tórax quede más alta que la boca,
asimismo pedir que deje caer ambos brazos y la cabeza y la cabeza hacia
el piso.
3. Indicar al paciente que inspire, retenga el aire y luego lo expulse con fuerza
hasta obtener la expectoración.
4. Escupirá en el recipiente rotulado que deberá estar sobre un papel
periódico en el piso.
Recipientes para recolectar el esputo: Deben ser de boca ancha (5cm de diámetro
aproximadamente) y 5cm de altura.
• Frascos de vidrio con tapa rosca.
• Envases desechables de material plástico con tapa
• Pequeñas cajas de cartón con tapa
Técnicas para detectar la tuberculosis:
Existe la prueba cutánea de la tuberculina o Mantoux, que consiste en inyectar vía
intradérmica la tuberculina, y al cabo de 2-3 días regresará al establecimiento de
salud para que el personal médico pueda ver si existe alguna reacción a la prueba.
(9)
El individuo infectado con el bacilo tuberculoso reacciona a la prueba de
tuberculina con una respuesta de hipersensibilidad retardada mediada por células
(sobre todo linfocitos T), apareciendo a las 48-72 horas de la inyección, una
induración en la zona. Esta respuesta de hipersensibilidad permanece de por vida,
aunque en el anciano, así como en ciertas alteraciones clínicas puede verse
disminuida. El hecho de realizarse PT de repetición en un individuo no
sensibilizado, no desencadena por sí mismo la respuesta inmunitaria.
¿Qué puede manifestar usted, respecto a la ley N° 30287 sobre la prevención
y control de la TBC en el Perú? redacte en 10 líneas.
La tuberculosis es una infección que aún no está erradicada en nuestro país, me
parece que esta ley es muy buena debido a que establece derechos que un
paciente con tuberculosis y en la mayoría en situaciones de pobreza puede gozar,
pero también presenta los deberes que un paciente debe cumplir para volver a
gozar de salud y así evitar la propagación del virus. Los personales de salud no
estamos exentos de contagiarnos con la tuberculosis por lo que esta ley establece
también establece beneficios durante el tiempo de descanso que nos podemos
tomar para sanarnos. También establece sobre la atención sanitaria en pacientes
de otros ámbitos como la policía nacional y fuerzas armadas, e incluso para
estudiantes, otorgándolos facilidades académicas para que puedan cumplir su
tratamiento y no perjudicarse en la culminación del año académico. (10)

REFERENCIA BIBLIOGRAFICA:
1. Beveridge, T.J. 2001. Uso de la mancha de óxido del gramo en la
microbiología, Biotechnic e histoquímica, 76, págs. 111-118
2. Artículo S. Agalactiae. (2021). Retrieved October 18, 2021, from Scribd
website: https://es.scribd.com/document/295702882/Articulo-S-Agalactiae

3. Utili, R. 2001. Infecciones bacterianas grampositivas resistentes al

tratamiento antibiótico, Annali Italiani Di Medicina Interna, 16, págs. 205-
219.

4. Crespo, M. P., & Diego, J. (1996). Importancia clínica del Streptococcus

agalactiae como causante de infección. Retrieved October 18, 2021, from
ResearchGate website:
https://www.researchgate.net/publication/279653408_Importancia_clinica_d
el_Streptococcus_agalactiae_como_causante_de_infeccion

5. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Essentials of Practical Microbiology (1st

ed.). Jaypee Brothers Medical Publishers.
6. Bauman, R. (2014). Microbiology with Diseases by Body System (4th
ed.). Pearson Education, Inc.

7. Antonio G, Tobón J, Hoyos A. Microbiología. MEDICINA & LABORATORIO

[Internet]. 2012;18. Available from:
https://www.medigraphic.com/pdfs/medlab/myl-2012/myl1211-12d.pdf

8. Noheding M. Tincion gram [Internet]. Slideshare.net. 2014 [cited 2021 Oct

18]. Available from: https://es.slideshare.net/noheding/tincion-gram-
42074172

9. Tinción ácido-alcohol resistente (Ziehl-Neelsen) [Internet]. Biología de andar

por casa. Biología de andar por casa; 2014 [cited 2021 Oct 18]. Available
from: https://zapatillasdelaciencia.wordpress.com/2014/01/14/tincion-acido-
alcohol-resistente-ziehl-neelsen/

10. Manual procedimientos de laboratorio. Instituto Nacional de Salud.

[Consultado el 13 de Octubre del 20121]. Disponible en:
http://bvs.minsa.gob.pe/local/minsa/3187.pdf

11. Centro para el Control y Prevención de enfermedades. Tuberculosis.

[Consultado el 13 de Octubre del 20121]. Disponible en:
https://www.cdc.gov/tb/esp/publications/factseries/skintest_es.htm

12. Cascante J. A., Pascal I., Eguía V. M., Hueto J.. Diagnóstico de la
infección tuberculosa. Anales Sis San Navarra  [Internet]. 2007  [citado 
2021  Oct  18] ;  30( Suppl 2 ) 49-65. Disponible en:
http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1137-
66272007000400005&lng=es.