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TIPOS DE TINCIONES

INTRODUCCIN
En su mayor parte los microorganismos son demasiado pequeos para observarse a
simple vista: protozoos, algas, hongos, bacterias y virus.
Estos microorganismos difieren en caractersticas tales como forma de nutricin,
estructura, tamao, composicin entre otros aspectos; es por ello que se emplea el estudio
microscpico el facilita notablemente la observacin; principalmente en las bacterias se
facilita al tratarlas con colorantes o tintes los cuales facilitan tambin la observacin de
ciertas estructuras celulares.
En este informe vamos a distinguir la estructura intracelular de algunos
microorganismos, tal es el caso de la sarcina, !lecciela, "acilo #erium entre otros.
$esarrollamos los mtodos de tincin y damos a conocer un an%lisis de los resultados
obtenidos en la pr%ctica.
DESARROLLO:
Tcnicas de tincin. Fundamentos
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver
con el microscopio ptico. &a principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el
medio que la rodea, y el medio m%s simple de aumentar el contraste es la utilizacin de
colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para
revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas,
c%psulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
&as clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de
teirlas, proceso llamado fi'acin. (ara bacterias, la fi'acin por el calor es lo m%s corriente,
aunque tambin puede fi'arse con sustancias qumicas como formaldehido, %cidos y
alcoholes. $espus de la fi'acin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores
cambios estructurales en el protoplasma. &a fi'acin se realiza habitualmente en clulas que
han sido fi'adas sobre un portaob'etos, tratando despus ste con el agente fi'ador, y
siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. &a fi'acin produce habitualmente el
encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan
mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido
fi'adas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.
&a mayora de los colorantes son compuestos org%nicos que tienen alguna afinidad
especfica por los materiales celulares. )uchos colorantes utilizados con frecuencia son
molculas cargadas positivamente *cationes+ y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los %cidos nucleicos y los
polisac%ridos %cidos. E'emplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal
violeta y la safranina. ,tros colorantes son molculas cargadas negativameute *aniones+ y
se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas
protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina %cida y el ro'o -ongo. ,tro grupo
de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los
materiales lipdicos de la clula, us%ndose a menudo para revelar la localizacin de las
gotculas o depstos de grasa. .n e'emplo de colorante liposoluble es el negro #ud%n.
/lgunos colorantes teir%n me'or slo despus de que la clula haya sido tratada
con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se
denomina mordiente; un mordiente habitual es el %cido t%n0co. El mordiente se combina
con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr% atacar el colorante.
#i se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa,
son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen
colorante simple que act1a sobre todas las clulas bacterianas r%pidamente y que no
produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente 1til para
detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del
material no celular no se tie.
&a tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se
de'an sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. &o que se ve, por tanto,
es el perfil de las clulas. &a sustancia utilizada para la tincin negativa es un material
opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las
clulas, tal como la tinta china *que es una suspensin de particulas de carbono coloidal+ o
la nigrosina *un colorante negro insoluble en agua+. &a tincin negativa es un modo
satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su
m%2ima utilidad est% en revelar la presencia de c%psulas alrededor de las clulas
bacterianas.
&os mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con
precaucin, ya que pueden conducir a errores. &as molculas de colorante forman en
ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que
son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. 3ales
estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la
seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura
realmente e2istente.
Pe!aacin de un "otis
#obre un portaob'etos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que
se va a teir *si es lquido+ o se hace rodar el hisopo con que se tom la muestra. .na vez
que el hisopo ha tocado la superficie del portaob'etos, que no est% estril, ya no puede ser
empleado para inocular los medios de cultivo. (uede usarse una agu'a estril para transferir
una pequea cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaob'etos. Este material
es suspendido en una gota de agua o solucin salina previamente colocada sobre el
portaob'etos. -uando se trata de colonias muy pequeas que pueden perderse en una gota
de lquido se emplea una varilla delgada de madera estril con la cual se toca la colonia
obtenindose as una fraccin apreciable del desarrollo. El material se frota directamente
sobre el portaob'etos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el
portaob'etos se de'a secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de
un mechero de "unsen hasta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero no
queme.
Poceso de tincin:
#. (reparar los frotis bacterianos indicados.
$. 3eir con verde malaquita. -on unas pinzas de madera colocar la muestra
encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee durante 4
min.
Nota: evitar que la muestra hierva. /adir m%s colorante si ste
se evapora; es importante que la muestra no se seque.
%. &avar con abundante agua el e2ceso de colorante.
&. 3eir con safranina 5 min.
'. &avar con abundante agua el e2ceso de colorante.
(. #ecar la preparacin.
). ,bservar la preparacin al microscopio. /notar la disposicin
y la morfologa de las tres especies del gnero Bacillus.
*ecanismos de Co+oacin:
&a coloracin celular y te'idos son una combinacin de fenmenos fsicos y
qumicos de absorcin: los fenmenos fsicos de absorcin, capilaridad y smosis
participan en cierto grado. &a afinidad de colorantes b%sicos por los te'idos %cidos y
viceversa indican que hay reaccin qumica.
Los Co+oantes:
#on compuestos, org%nicos que contienen radicales cromforos esto es que
producen color y grupo de an2ocromos que forman sales los grupos nitrito *67,8+ y azo *6
7 9 7+ son cromforos. &os radicales hidro2ilo *6,:+ y amino *67:8+ son grupos
an2ocromos. &os cromforos imparten la propiedad cromgena al colorante y los
an2ocromos permiten que el colorante se una con la fibra o te'ido.
TIPOS DE TINCIN:
Tincin de ,am.
3ambin puede utilizarse a menudo un mtodo que no tie igualmente todas las clulas, un
proceso denominado tincin diferencial. &a tincin de este tipo m%s e2tensamente utilizada
es la tincin de ;ram, denominada as por el bacterilogo dans :ans -hristian ;ram,
quien la desarrollo. #obre la base de su reaccin a la tincin de ;ram, las bacterias pueden
dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas.
$ebido a su importancia en ta2onoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales
de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con cierto detalle la tincin
de ;ram. &as clulas fi'adas al calor sobre un portaob'etos se tien primero con una
solucin de cristal violeta *otros colorantes b%sicos no son tan efectivos+ y son lavadas
despus para quitar el e2ceso de colorante. En este estado todas las clulas, tanto las
gramnegativas como las grampositivas, est%n teidas de azul. El portaob'etos se cubre
entonces con una solucin de yodo *<
8
+ = yoduro pot%sico *!<+. El ingrediente activo es aqu
el yodo, el yoduro pot%sico simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las
clulas y forma un comple'o insoluble en agua con el cristal violeta. $e nuevo tanto las
clulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin. #e
lleva a cabo despus de la decoloracin, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en
las que es soluble el comple'o yodo = cristal violeta. /lgunos organismos *grampositivos+
no se decoloran mientras que otros *gramnegativos+ lo hacen. &a diferencia esencial entre
esos dos tipos de clulas est%, por lo tanto, en la resistencia a la decoloracin. $espus de la
decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son
incoloras. (ara poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de
contraste. :abitualmente es un colorante de color ro'o, como la safranina o la fucsina
b%sica. $espus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son ro'as mientras
que las grampositivas permanecen azules.
$eben destacarse dos aspectos cruciales de la tincin de ;ram:
5. El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento de yodo. El yodo por
s solo tiene poca afinidad con las clulas.
8. &a decoloracin debe realizarse con poco agua para evitar que pierdan la tincin las
clulas grampositivas. El proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un
c%lculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.
>inalmente, el car%cter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada.
/lgunos organismos son m%s grampositivos que otros y algunos son gramvariables, es
decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos. &a tincin de ;ram es uno de los
mtodos de tincin m%s importantes en el laboratorio bacteriolgico.
*todo de co+oacin de -ie.+ nee+sen
&a tincin de ?iehl 7eelsen fue desarrollada inicialmente por (aul Ehrlich para
poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de la tuberculosis en muestras
clnicas de pacientes.
Esta tcnica es capaz de diferenciar los bacilos /cido /lcohol @esistentes *"//@+.
&a tcnica de ?67 fuerza la penetracin de la fucsina b%sica en la pared celular mediante la
accin combinada del fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la capa de %cidos
miclicos: el calor AderriteB el componente ceroso y el fenol act1a a modo de disolvente,
permitiendo el paso del colorante b%sico que se une a los %cidos miclicos con carga
negativa. -uando cesa la aplicacin de calor yCo se elimina el e2ceso de fenol mediante un
lavado con agua, la pared recupera su consistencia cerosa, pero las molculas de fucsina
quedan atrapadas en su espesor.
-on la coloracin de ?iehl 7eelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente
curvos, ro'o fucsia, destac%ndose claramente contra el fondo azul.
Tincin /cido esistente:
Esta tincin sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que
tienen un alto contenido en lpidos y en %cidos miclicos y que no pueden ser calificadas
por la tincin de ;ram. (ara empezar se hecha sobre el portaob'etos una mezcla de fucsina
= fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. &as clulas se
tien de rosa, tanto el %cido = alcohol sensible como las resistentes. $espus se usa un
decolorante org%nico que hace que las bacterias %cido = alcohol sensibles se decoloren
mientras que las %cido = alcohol resistentes se quedan rosa. -omo en la tincin de ;ram se
utiliza un colorante de contraste que en este caso es el azul de metileno que tie las clulas
%cido = alcohol sensible de color azul quedando las clulas %cido = alcohol resistente de
color rosa.
>igura 8: &a tincin %cido = alcohol resistencia.
Tincin de es!oas:
#e utiliza para teir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas.
#obre el portaob'etos con la preparacin se echa verde malaquita que tie las clulas de
verde. &uego se lava con agua destilada con lo que las clulas se quedan incoloras y las
endosporas permanecen verde. >inalmente se usa la safranina para obtener bacterias de
color rosa mientras que las endosporas contin1an con su color verde del verde malaquita.
Tincin de ,iensa:
El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de
protozoos en la sangre para observar materias n1cleos de las clulas.
Tincin de C/!su+a:
-olorante nigrosuna, aqu se observa microorganismos encapsulados creando
resistencias.
Tincin de F+a0e+os:
#e usa mordiente el cual aumenta el tamao del microorganismo.
Ends!oas:
#on unos cuerpos resistentes que se producen en el interior de la clula los cuales
contienen los componentes necesarios para conservar la vida.
&as esporas pueden situarse en el centro de la clula o en situaciones e2cntricas
cerca de un e2tremo de la misma.
Le1aduas:
#on esfricas, elpticas y cilndricos, su tamao vara notablemente. #on hongos
cuya forma corriente y dominante de crecimiento es unicelular.
Las C/!su+as:
#on estructuras grueso viscosas gelatinosas que rodean las clulas de algunas
especies.
#arcina:
#on anaerobios obligados y son e2tremadamente %cido = tolerantes que pueden
fermentar az1cares y crecer a p: inferior a 8.
Este gnero comprende 8 especies de bacterias que se dividen en tres planos
perpendiculares para producir paquetes de D en una clula.
AN2LISIS DE RESULTADOS:
Tincin Sim!+e:
Estudia levaduras, en este e2perimento se usa un solo colorante que fue azul de
metileno, donde observamos que las levaduras tenan cocos. Estas clulas bacterianas
difieren desde el punto de vista qumico de su medio e2terior y por eso se tien
contrastando con su alrededor.
Tincin de Es!oas:
&a bacteria es una estructura muy pequea, sin embargo, por medio de esta tincin
pudimos observar la estructura interna de la clula bacteriana, particularmente las
endosporas, en este e2perimento se utiliza una tincin simple debido a que la misma
permite que se coloree toda la clula e2cepto la espora que se observa de un tamao bien
aceptable.
Otas tinciones de uso .a3itua+
RODA*INA4AURA*INA
&os %cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los
fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fi'an a las bacterias, que aparecen
de color amarillo o naran'a brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio,
empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecfica. 3odos los microorganismos
%cido6alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios par%sitos, se tien con estos
colorantes.
.n aspecto importante de la coloracin rodamina6auramiria es que luego los frotis pueden
ser reteidos con la coloracin de ?iehl67eelsen o !inyoun directamente sobre la tincin
con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. $e esta forma, los resultados
positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que adem%s permiten
la diferenciacin morfolgica.
NARAN5A DE ACRIDINA
El fluorocromo naran'a de acridina se une al %cido nucleico ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones de naran'a de acridina, el color de la
fluorescencia puede variar, dependiendo del p: y de la concentracin. El naran'a de
acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el
microorganismo est% vivo y ro'a si est% muerto. $e todos modos, como el colorante se
intercala en el %cido nucleico, el germen viable se inactivar% poco tiempo despus de la
tincin.
El uso de naran'a de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha
sido ampliamente aceptado. $e hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la
tincin de hemocultivos con naran'a de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego
para la deteccin inicial de hemocultivos positivos.
6LANCO DE CALCOFL7OR
&as paredes celulares de los hongos fi'an el colorante blanco de calcofl1or aumentando
considerablemente su visibilidad en los te'idos y otras muestras. #eg1n fue descrito por
:ageage y :arrington, este colorante se emplea en lugar de !,: al 5EF para el e2amen
inicial de los materiales clnicos. 3ambin se emplea para aumentar la visualizacin de los
elementos morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratoros ha
suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. &os organismos fluorescen con luz
blanco6azulada o verde manzana, seg1n la fuente luminosa que se utilice.
Tincin de es!oas 89it-4con:+in;
/lgunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su
interior formas de resistencia denominadas endosporas. #e producen cuando las
condiciones ambientales son desfavorables *agotamiento de los nutrientes, temperaturas
e2tremas, radiaciones, compuestos t2icos, etc.+ form%ndose una espora por cada forma
vegetativa. /l finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la
espora al e2terior. -uando el ambiente es favorable, la espora germina generando una
nueva forma vegetativa. &a capacidad de germinar perdura durante aos. /lgunas de las
bacterias productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo que su estudio y
observacin son de enorme inters.
REFERENCIAS 6I6LIO,RAFICAS.
http:CCdemostraciondelbacilodeGoch.blogspot.comC8E55CEHCmetodo6de6coloracion6
de6ziehl6neelsenIEJ.html.
http:CCKKK.microinmuno.qb.fcen.uba.arC#eminario3inciones.htm .
http:CCKKK.monografias.comCtraba'osHLCtincion6esporas6bacterianasCtincion6
esporas6bacterianas.shtml.
http:CCacuanatura.galeon.comCcursosonlineCtecnicasdetincionCtecnicasdetincion.html .
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